阅读说明：本技术 用于细菌感染局部治疗的5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1h-四唑 (5- (2, 5-bis (4-chloro-2-isopropylphenyl) thiophen-3-yl) -1H-tetrazoles for topical treatment of bacterial infections ) 是由 吴帆 克里斯多夫·R·麦克马斯特 唐纳德·F·韦弗 于 2018-12-10 设计创作，主要内容包括：一种化合物5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑,制备所述化合物的方法,包含所述化合物的局部组合物,以及所述化合物在局部治疗由病原菌在伤口部位引起的感染的方法。(A compound 5- (2, 5-bis (4-chloro-2-isopropylphenyl) thiophen-3-yl) -1H-tetrazole, a process for preparing the compound, a topical composition comprising the compound, and a method of topical treatment of an infection at a wound site caused by a pathogenic bacterium with the compound.)

用于细菌感染局部治疗的5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻 吩-3-基)-1H-四唑

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年12月11日提交的题为“局部治疗感染”的美国临时专利申请No.62/597,159的优先权，其内容通过引用并入本文。

背景技术

糖尿病是一种严重疾病，全世界受到糖尿病影响的人超过4.15亿，到2035年，该疾病的发病率预计将上升到6.42亿以上(国际糖尿病联盟，2016年)。糖尿病患者会出现许多严重的并发症，包括外周血流减少。流向四肢的血液减少可引起周围神经病变的发作，周围神经的退化。影响多达50％的糖尿病患者，周围神经病变的典型特征是刺痛、麻木和无法感受到四肢疼痛，这会导致感染发展为糖尿病性溃疡(所谓的“糖尿病性溃疡感染”或“DUI”))，这种溃疡通常出现在足部(糖尿病足感染，“DFI”)。每年，大约3％的糖尿病患者会患上糖尿病性溃疡，转换一下，也就是有超过1150万人会患上糖尿病性溃疡。很大比例的糖尿病溃疡患者会发生严重的感染，这些感染到达皮肤的更深层并最终进入骨骼，通常导致肢体的部分或全部截肢。由于当前可选的治疗方案不佳，导致许多这类感染进展地越来越严重。

当前用抗生素治疗DUI所产生的效果有限，因为从DFI第2阶段转变到DFI第3阶段约有50％。最严重的病例(占所有糖尿病足感染的50％)需要足部完全截肢或部分截肢，实际上，DFI占所有糖尿病患者医院住院治疗的25％。现有的口服或注射用抗生素并不能有效治疗DFI，因为糖尿病性溃疡及其周围的脉管系统较差，并且降低了此类抗生素到达感染部位的能力。

局部抗生素有望提供更有效的治疗，因为它们直接应用于感染部位，即使在没有正常脉管系统的情况下也可以消灭细菌。不幸的是，由于目前可用的局部抗生素本身的物理化学性质阻止其渗透到皮肤深处，因此这种抗生素通常是无效的。此外，DFI内已表现出多药耐药性(MDR)，这给设计适当的疗法带来了挑战。

目前有关开发针对MDR细菌的新抗生素的策略主要集中在与已知靶标相比产生新一代现有抗生素上。但是，由于作用机制已经到位，因此抵抗力通常会迅速发展。与新型靶标相比，目前还未被使用和设计的此类抗生素是需要的，因为它们对于对抗MDR细菌感染更为有效。

发明内容

提供了很多化合物，这种化合物具有专门适用于局部施用的理化性质并抑制目前在抗菌疗法中尚未开发的细菌靶标。这些化合物表现出局部施用的细菌谱和功效，即使与相似类别的抗菌化合物相比，这些化合物也出乎意料地好。

通常，一方面，提供了5-(2，5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐。

通常，一方面，提供了具有5-(2，5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐的药物组合物，以及提供了皮肤病学上可接受的载体。

通常，一方面，提供了上述组合物作为药物的用途，特别是作为用于消除糖尿病性溃疡内的病原菌或用于治疗糖尿病足感染或用于蜂窝织炎的药物。

通常，一方面，提供了一种消除糖尿病性溃疡内的病原菌的方法，该方法包括将有效量的上述组合物之一施用于需要这种治疗的个体的溃疡上。

通常，一方面，提供了一种治疗个体糖尿病足感染的方法，其中个体的感染部位需要这种治疗，该方法包括将有效量的上述组合物之一施用于所述感染部位。

通常，一方面，提供了一种在需要这种治疗的个体的感染部位治疗蜂窝织炎的方法，该方法包括将有效量的上述组合物之一适用于所述部位。

通常，一方面，提供了一种制造5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括在钯交叉偶联条件下使N-保护的5-溴四唑与噻吩-3-基硼酸的混合物反应。

接下来本发明的上述和其它优点和特征将变得明显，通过参考以下对本发明的详细描述和所附权利要求，可以更清楚地理解本发明的性质。

附图说明

图1显示了兔缺血性耳模型中随时间推移的伤口收缩百分比。黑线(底部)表示1％DMSO对照组；红线(中间)表示2％莫匹罗星软膏组；紫色虚线(顶部)表示1％DMSO(v/v)中的2％5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑(w/v)组。

图2A显示了已经皮内注射了MRSA并治疗了7天的SKH1小鼠的柱状图(菌落形成单位/单位组织重量)(N＝5/组)。红条(左)是对照组；蓝条(中)是用比较剂莫匹罗星治疗的组；绿条(右)是用5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑治疗的组。

图2B显示了已经皮内注射了MRSA并治疗了7天的SKH1小鼠的病变面积(平方毫米)(N＝5/组)。深蓝色线(顶部)是对照组；浅蓝色线(底部)是用5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑治疗的组。

具体实施方式

脂质合成是抗菌药物发现的有吸引力的靶标，因为许多步骤是细菌特有的，并且在整个Genera.AcpS中高度保守，它就是这样一种催化酰基载体蛋白的活化以随后用于脂质和其他重要大分子合成的靶标。我们在此公开了一种AcpS抑制剂，5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑，其可有效对抗多种临床相关的革兰氏阳性细菌。由于其独特的作用方式，与MRSA和VRE的重要MDR临床分离株相比，5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑显示出高水平的效价。用5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑对动物进行局部治疗可消除MRSA感染并改善愈合。因此，5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑作为局部感染药物具有价值。

特别地，如本文所讨论，独特的作用方式是，该化合物是如实施例中所讨论的ACP合酶抑制剂。另外，已经显示该化合物对皮肤层具有特别好的渗透性，而没有明显地穿过皮肤渗透到体腔。如本领域技术人员将理解，这是一个显著的益处，因为该药物存在于细菌所在部位(位于皮肤中)，但是人们并不希望该药物进入人体，正如下文将讨论的。

在此引用的所有专利、专利申请和其他出版物的全部内容均通过引用并入本文。

在一个实施例中，提供了5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐。

在一个实施例中，提供了包含5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐的药物组合物，以及提供了皮肤病学上可接受的载体。在一些实施例中，所述皮肤病学上可接受的载体是乳膏，并且5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐的浓度约为0.5-5％，例如2％或1％。在一些实施例中，所述皮肤病学上可接受的载体包括胶质基质。

在一个实施例中，提供了以上提供的组合物之一作为药物的用途。在一些实施例中，该药物用于消除糖尿病性溃疡内的病原菌。在一些实施例中，该药物用于治疗糖尿病足感染。在一些实施例中，该药物用于治疗蜂窝织炎。

病原菌的例子包括但不限于：肠球菌、粪肠球菌，包括耐万古霉素的肠球菌ATCC700211和ATCC51299，芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌NRS7(万古霉素中间体)、NRS2(万古霉素中间体)、ATCC43300(耐甲氧西林-MRSA)、NRS1、NRS382(USA100流行株)、NRS383(USA200流行株)、NRS384(USA300流行株)，临床分离株包括MRSA临床分离株、社区获得性MRSA临床分离株，以及耐多药(MDR)的环丙沙星，青霉素、红霉素和/或莫匹罗星耐药的临床分离株，链球菌属、无乳链球菌、肺炎链球菌和梭菌属。

在一个实施例中，提供了一种消除糖尿病性溃疡内的病原菌的方法，该方法包括将有效量的上述提供的组合物之一施用于需要这种治疗的个体的溃疡上。

在一个实施例中，提供了一种治疗糖尿病足感染的感染部位的方法，该方法包括将有效量的上述提供的组合物之一施用于需要这种治疗的个体的感染部位上。

在一个实施例中，提供了一种在感染部位治疗蜂窝织炎的方法，该方法包括将有效量的上述提供的组合物之一施用于需要这种治疗的个体的感染部位上。

如本领域技术人员将理解的，“需要这种治疗的个体”是指患有，已被诊断或疑似患有包含病原菌、糖尿病足感染和/或蜂窝织炎的糖尿病性溃疡。

如本领域技术人员将理解的，“有效量”是指足以降低与包含病原菌、糖尿病足感染和蜂窝织炎的糖尿病性溃疡相关的至少一种症状的严重性的量。这些疾病的症状的示例是本领域技术人员众所周知的和/或可以通过参考各种参考文献源来轻松确定。例如，一些症状包括：炎症和化脓，溃疡性疾病的持续发展(没有愈合或愈合缓慢)，溃疡面积或深度增加。

在一些实施例中，“有效量”是有效清除感染的量或有效减少并发症如骨髓炎或下肢截肢的风险的量。

在使用中，应定期(例如每天一次或两次)使用该化合物。常见的使用方式是7-14天，例如7天，10天或14天或直到伤口闭合。

在一个实施例中，提供了一种制造5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括在钯交叉偶联条件下使N-保护的5-溴四唑与噻吩-3-基硼酸的混合物反应。在一些实施例中，氮保护基是苄基。在一些实施例中，钯交叉偶联条件包括Pd(PPh₃)₄和碳酸钠。

以上提供的治疗方法或用途优选地应用于需要这种治疗的哺乳动物，更优选地是人类。治疗方法或用途优选在溃疡或感染部位(如果适用)内，上，或周围局部施用。

定义

除非另有定义，否则本说明书中使用的术语是指以下定义，如下所述。

术语“施用”应理解为是指将可引入到个体体内或个体上的形式的5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐提供给个体，其中提供的量为对预防、治疗或诊断而言有效的量；特别地，提供包含药学上可接受的载体的局部剂型，更特别地，提供包含皮肤病学上可接受的载体的局部剂型。

在一些实施例中，局部剂型是液体、固体或半固体。在一些实施例中，局部剂型被配制为霜剂、乳剂、软膏剂、糊剂或凝胶剂。在一些实施例中，局部剂型被施用于个体的打开或封闭状态的皮肤。在一些实施例中，在无菌条件下将局部制剂与5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑或其药学上可接受的盐混合，所述局部制剂包含药学上可接受的载体和任何所需的赋形剂，例如防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、湿润剂、渗透促进剂或增稠剂。在一些实施例中，所述制剂包含油质基质或烃类基质。在一些实施例中，制剂包含无水或吸收基质。在一些实施例中，该制剂包含乳液基质(油包水或水包油)。在一些实施例中，制剂包含水溶性基质。

如本文所用，术语“氨基”是指-NH₂基团。

如本文所用，术语“溴”是指-Br。

如本文所用，术语“羰基”是指-C(＝O)-基团。

如本文所用，术语“羧基”是指-COOH基团，其可以被保护为酯基：-COO-烷基。

如本文所用，术语“氰基”是指-CN基团。

如本文所用，术语“氟”是指-F。

如本文所用，术语“卤素”是指Cl、Br、I或F。

如本文所用，术语“羟基”是指-OH基团。

术语“羟基保护基”是指在合成过程中保护羟基免于不希望的反应的取代基。

羟基保护基的实例包括但不限于甲氧基甲基、苄氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、苄基、三苯甲基、2,2,2-三氯乙基、叔丁基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、亚甲基缩醛、丙酮化物亚苄基乙缩醛、环状原酸酯、甲氧基亚甲基、环状碳酸酯和环状硼酸酯。羟基保护基通过以下方式附加到羟基上，即，通过使包含羟基的化合物与碱，例如三乙胺，和试剂反应，该试剂选自烷基卤、三氟烷基磺酸盐、三烷基甲硅烷基卤化物、三烷基甲硅烷基三氟甲磺酸酯、芳基二烷基甲硅烷基三氟甲磺酸盐或烷基氯甲酸酯，CH₂I₂或二卤代硼酸酯，例如与甲基碘、苄基碘、三乙基甲硅烷基硫酸盐、乙酰氯、苄基氯或碳酸二甲酯反应。通过使包含羟基的化合物与酸和烷基缩醛反应，保护基也可以被附加到羟基上。

如本文所用，术语“氮保护基”是指那些旨在保护氮原子免于在合成过程中发生不希望的反应的基团。氮保护基包括氨基甲酸酯、酰胺、N-苄基衍生物和亚胺衍生物。优选的氮保护基是乙酰基、苯甲酰基、苄基、苄氧羰基(Cbz)、甲酰基、苯磺酰基、新戊酰基、叔丁氧羰基(Boc)、叔丁基乙酰基、三氟乙酰基和三苯甲基。通过使包含胺基的化合物与碱(例如三乙胺)和试剂反应，将氮保护基连附加到伯氨基或仲氨基上，所述试剂选自烷基卤、三氟甲酸烷基酯、例如(烷基-O)2C＝O所示的二烷基酐、例如(芳基-O)2C＝O所示的二芳基酸酐、酰基卤、烷基氯甲酸酯或烷基磺酰卤、芳基磺酰卤或卤代CON(烷基)2，例如乙酰氯、苯甲酰氯、苄基溴、苄氧羰基氯、甲酰氟、苯磺酰氯、新戊酰氯、(叔丁基-O-C＝O)2O、三氟乙酸酐和三苯甲基氯。

除非另有说明，否则术语“保护基”在用于指发生化学反应的分子的一部分时，是指在该化学反应的条件下不具有反应性的化学部分，并且可以除去该部分以提供在那些条件下具有反应性的部分。保护基是本领域公知的。参见，例如，Greene，T.W.和Wuts，P.G.M。，《有机合成中的保护基》(第三版，John Wiley&Sons：1999)；Larock，R.C.，《综合有机转化》(第二版，John Wiley&Sons：1999)。一些实例包括苄基、二苯甲基、三苯甲基、Cbz、Boc、Fmoc、甲氧基羰基、乙氧基羰基和邻苯二甲酰亚胺基。保护基包括例如氮保护基和羟基保护基。氮保护的化合物可以称为“N-保护的”。

本发明的化合物可以以衍生自无机或有机酸的药学上可接受的盐的形式使用。药学上可接受的盐是本领域公知的。为了清楚起见，本文所用的术语“药学上可接受的盐”通常是指由药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机酸和碱以及有机酸和碱)制备的盐。合适的药学上可接受的碱加成盐包括由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐，或由赖氨酸、N，N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡萄糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。

合适的无毒酸包括无机酸和有机酸，例如乙酸、藻酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、等离子酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、硝酸、pamoic、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、硫酸、酒石酸和对甲苯磺酸。具体的无毒酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和甲磺酸。因此，具体盐的实例包括盐酸盐和甲磺酸盐。其他盐在本领域中是公知的。参见，例如，《雷明顿药物科学》，第18版。(MackPublishing，Easton，宾夕法尼亚州：1990年)和《Remington：药学的科学与实践》，第19版。(Mack Publishing，Easton，宾夕法尼亚州：1995)。

本发明化合物的酸加成盐、羧酸盐、氨基酸加成盐和两性离子盐的制备和使用也可认为是药学上可接受的，前提条件是它们都在合理的医学判断范围内，适用于同人体和低等动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应等，并且具有合理的受益/风险比，并且对于它们的预期用途是有效的。这样的盐还可以包括本发明化合物的各种溶剂化物和水合物。

当所讨论的化合物包含至少一个这样的原子时，本发明的某些化合物可以例如用碳、氟或碘的各种同位素进行同位素标记。

应该注意的是，形成较大化合物的一部分的化学部分在本文中可以以当其作为单个分子存在时的通用名称来描述或通常为其自由基的名称来描述。例如，术语“吡啶”和“吡啶基”在用于描述连接至其他化学部分的部分时具有相同的含义。因此，例如，两个短语“XOH，其中X是吡啶基”和“XOH，其中X是吡啶”具有相同的含义，并且包括化合物吡啶-2-醇、吡啶-3-醇和吡啶-4-醇。

除非另有说明，否则术语“预防”是指在患者开始患有特定疾病或病症之前发生的一种动作，该动作可抑制或减轻疾病或病症的严重程度或其一种或多种症状的严重程度。该术语包括预防。

除非另有说明，否则化合物的“预防有效量”是足以预防疾病或病症，或与该疾病或病症相关的一种或多种症状的量，或防止其复发的量。化合物的预防有效量是仅治疗剂的量或治疗剂与其它药剂组合的量，其可预防疾病。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。

除非另有说明，否则化合物的“诊断有效量”是足以诊断疾病或病症的量。通常，就一种化合物的治疗用途而言，用于诊断目的的化合物将不再继续施用，并且仅在足以产生诊断的情况下才可以施用一次。

除非另有说明，否则化合物的“治疗有效量”是足以治疗疾病或病症或与该疾病或病症有关的一种或多种症状的量。

术语“受试者”旨在包括可能出现疾病的生物体。受试者的实例包括人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

术语“基本上纯的”是指如通过本领域已知的分析技术所测定的，分离的材料的纯度至少为90％，优选95％，甚至更优选99％。

可以改变药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得对于特定患者，组合物和给药方式有效达到所需治疗反应的活性化合物的量。选择的剂量水平将取决于具体化合物的活性，给药途径，所治疗疾病的严重程度以及所治疗患者的疾病状况和既往病史。但是，以低于获得所需治疗效果所需的剂量开始化合物的剂量并逐渐增加剂量直至获得所需效果，这在本领域技术范围内。

有效量的5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑可以以纯净形式使用，或以其药学上可接受的盐的形式使用。每日总使用量将由主治医生根据合理的医学判断来作出决定。任何特定患者的具体有效剂量水平和给药频率将取决于多种因素，包括正在治疗的病症和病症的严重程度；使用的组合物的组成；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用所需的时间；每次给药的有效期；整体治疗的持续时间；风险/收益比；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。例如，以低于获得所需治疗效果所需的剂量开始化合物的剂量并逐渐增加剂量直至获得所需效果，这在本领域技术范围内。

关于本文描述的化合物，组合物，方法和用途的进一步信息可在以下实施例中找到。

实施例

实施例1–合成5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑

参考以下化学方案：

将溴腈2(1.0g，3.7mmol)，异丙基苯基硼酸酯1(2.31g，8.2mmol，2.2当量)和Pd(PPh₃)₄(0.22g，0.19mmol，0.05当量)添加到圆底烧瓶中并抽真空持续3秒钟，并用氩气冲洗3次。向该混合物中添加2M碳酸钠水溶液(9.4ml，18.8mmol，5当量)和20ml二恶烷。将反应在95℃搅拌过夜，然后用水淬灭。将深色混合物用乙酸乙酯(2×20ml)萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，并通过旋转蒸发浓缩。通过快速柱色谱法(在己烷中的25％DCM)获得硫代苯甲腈3(1.4g，90％)。

将硫代苯甲腈3(1.0g，2.4mmol)、叠氮化钠(0.39g，6.0mmol，2.5当量)和溴化锌(1.36g，6.0mmol，2.5当量)与20ml无水DMF在圆底烧瓶组合，抽真空3秒钟，并用氩气冲洗3次。将反应在135℃搅拌过夜，然后用5ml 1N HCl溶液淬灭。过滤混合物，并通过快速柱色谱法(1％AcOH和35％EtOAc的己烷溶液)获得产物。

NMR评估。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ(ppm)1.13(s，br，6H)，1.30(d，J＝6.8Hz，6H)，2.92(m，1H)，3.38(m，1H)，7.26(dd，J＝2.0，8.1Hz，1H)，7.40(m，4H)，7.54(d，J＝1.3Hz，1H)，7.76(s，1H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)：δ(ppm)24.6(2)，24.7，24.8，30.4，31.0，123.0，126.5，126.9，127.2，127.8，128.1，128.7，130.0，132.5，132.7，135.9，137.8，142.5，143.9，150，151.5。

实施例2(预言的)

5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑的无叠氮化物的合成

5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑也可以通过保护四唑来制备，得到N-保护的四唑的混合物。此步骤后进行溴化反应，得到N保护的5-溴四唑混合物，然后使用噻吩-3-基硼酸进行钯交叉偶联。然后将所得产物在噻吩的2-位和5-位溴化，然后使用(4-氯-2-异丙基苯基)硼酸进行钯交叉偶联。N-保护的四唑部分的脱保护将混合物分解为单一产物。使用本领域已知的方法，可以将脱保护与药学上可接受的盐部分结合或随后引入药学上可接受的盐部分。以下方案给出了一种可能的合成方法，其中氮保护基为苄基：

实施例3-

包含5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑和皮肤病学上可接受的载体的药物组合物的制备

通过将50mg化合物溶解在50μl 100％DMSO中，然后逐步添加并混合至5ml Glaxal基质(WellSpring Pharmaceutical Canada Corp.，奥克维尔，加拿大)中进行配制，最终浓度为1％(w/v)化合物和1％(v/v)DMSO。

生物数据

最低抑菌浓度(MIC)

根据临床实验室标准协会(CSLI)指南，使用肉汤微量稀释测定法，我们测试了5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑(下表中的“试验样品”)，建立了针对多种MDR细菌的MIC，并指出了与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素的肠球菌(VRE)和链球菌属菌种的实质活性。根据CLSI指南，通过微量稀释肉汤测定法进行了抗菌药敏试验。由用水稀释的固定相培养物制备成接种物。微量滴定板孔接收等份的100μL的化合物，该化合物在Mueller-Hinton II阳离子调节培养基中稀释。连续两次稀释后，化合物的终浓度通常为250μg/ml至0.125μg/ml。除测试化合物外，还包括生长和无菌对照以及DMSO媒介对照行。将5×10⁵个细菌接种于微量滴定板上，并将该微量滴定板在湿润的环境中在35℃下孵育过夜。

5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑与一组125种重要的革兰氏阳性菌株和MRSA，VRE和表皮葡萄球菌的MDR临床分离株的进一步体外测试，对这些MDR菌株(包括对万古霉素，青霉素，红霉素和环丙沙星耐药的菌株)的MIC值为0.5-1.0μg/ml。

5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑还保留了对表皮葡萄球菌、粪肠球菌、粪肠球菌VRE的莫匹罗星抗性菌株的活性，以及一组对莫匹罗星耐药的金黄色葡萄球菌菌株(MMX 1013，MMX 7779，MMX 7782，MMX 8845，MMX 9202：2ug/ml MIC，对莫匹罗星而言>256ug/ml)；这是值得注意的，因为莫匹罗星是最常用的其中一种局部抗生素。

5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑还保留了对梭菌属的活性，梭菌属是一种存在于更高级/复杂的DUI病例中的病菌，而其结构异构体5-(4,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-2-基)-1H-四唑对此类物质没有活性。

5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑如对USA100和USA300MRSA菌株有快速杀菌作用。

作用机制

使用标准重组DNA方法从金黄色葡萄球菌和大肠杆菌基因组DNA中扩增acpS基因，并将其插入pET23b载体中，从而使蛋白产物可在具有AcpS开放阅读框的框架内添加C末端6x-His标签。对插入载体中的产物的DNA序列进行测序，发现与已知的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌acpS开放阅读框相同。

通过加入IPTG和过夜培养诱导重组的His-Tagged AcpS表达。通过在50mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mM MgCl₂、2mM DTT，5％甘油的缓冲液中依次通过16、18和21G针抽吸获得细胞裂解液，并用MES将其进一步调节至pH 8.1。通过His-Tag方法纯化，得到约2mg/ml的储备纯化酶溶液。在典型的AcpS酶活性测定中，最终体积为10μL的57μM[³H]标记的酰基辅酶A，2μg脱辅基ACP，10mM MgCl₂、5mM DTT，50mM磷酸钠(pH 7.0)和AcpS在室温下在1.5mL微量离心管中孵育。在5、10、15和20分钟时，将2μL反应液加到750μL冰上10％TCA中。然后加入牛血清白蛋白(BSA；20μl的25mg/ml溶液)以促进放射性标记蛋白的沉淀。将样品以12000rcf离心5分钟。除去上清液，并将小丸用750μL的10％三氯乙酸漂洗两次。将小丸重悬于50μL甲酸中，并转移至闪烁瓶中。加入2mL闪烁液，并通过液体闪烁计数定量形成的[³H]标记的holo-ACP的量。每个数据点(剩余的AcpS酶活性)表示为媒介物对照的百分比，并给出四个时间点的中值。

人们认为AcpS被5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑抑制。

为了确定AcpS抑制是否是导致5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑杀死细菌的主要体内靶标，我们在细菌中过表达AcpS。在IPTG诱导型启动子的控制下，用表达大肠杆菌或金黄色葡萄球菌AcpS的质粒转化经过基因工程改造以具有多孔外膜的大肠杆菌菌株(菌株D22)。通过抑制AcpS杀死细菌的化合物应在AcpS表达增加时将MIC移至更高的浓度，这的确是5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-yl)-1H-四唑所呈现的抑制作用(对于大肠杆菌为32倍；对于金黄色葡萄球菌为16倍)。

选择性

与上述方法类似的体外酶法测定结果表明，5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑不会抑制其他两种利用细菌酶的ACP，这两种细菌酶是LpxA和脂肪酸合酶。

在全厚度人体尸体皮肤上的皮肤药代动力学

全厚度人体皮肤取自验尸后的人体供体躯干，并储存在-80摄氏度下。在研究的那天，将皮肤块在室温下在盐水中融化至少几分钟，然后分成大约2cm长x2cm宽的单个块，从中选择七块全厚度皮肤。修整约2/3的皮下层宽度，以便将选定的皮肤块安装到Franz细胞中。制备接收缓冲液(含有10mM HEPES，15mM碳酸氢钠和1.2mM氯化钙的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液；调节至pH 7.4并用0.1％叠氮化钠和1％牛血清白蛋白强化)。通过在600rpm下运行的水套/搅拌模块，用12mL接收器缓冲液在32摄氏度下平衡30分钟。30分钟后，使用vapometer读取每块皮肤块的经上皮的水分损失。该块皮肤的暴露表面积为1.77平方厘米。

将约300ul配制在2％w/w胶质基质中的5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑直接通过注射器涂在每块皮肤的顶部。在3、6、12、18和24小时从每个Franz池的接收器隔室中获取接收器样品，并用等体积的新鲜温热缓冲液替换以保持水槽条件。在24小时结束时，用棉签擦拭残留在每块皮肤上的大量制剂，将其一起储存在干燥的小瓶中进行分析。在60摄氏度下进行不超过2分钟的短暂热处理后，使用镊子将表皮和真皮轻轻分开。然后将每一层擦干，称重并保存在单独的玻璃小瓶中。所有样品均存储在-80摄氏度下，直到用LC/MS-MS进行分析时才拿出来使用。

通过在各个时间点测得的浓度之和，加上先前时间点测得的浓度的1/12(因为每次12mL接收器总体积中有1mL被抽出并更换)计算出在每个时间点渗透的5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑的累积浓度。从曲线的线性部分的斜率计算出24小时渗透过程中的通量值。通量由等式表示

通量＝d[(C_r-T x V_r)/dt/A

C_r-T是每个时间点的累积浓度(ng/mL)；Vr为12mL；t是小时数；并且A是1.77平方厘米的表面积。

结果显示，在24小时的渗透期结束时，接收器样品中没有可检测到的5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑(检测下限：0.5ng/mL)。在此实验中，计算得到从顶部(模拟局部给药)一直到底部(模拟进入体腔)的通量小于0.141ng/hr/cm²。相反，发现5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑堆积在皮肤层中。通过LC-MS/MS定量显示，在24小时的渗透期结束时，表皮(163±58.0ng/mg组织)，真皮(0.821±0.469ng/mg组织)和皮下组织(1.86±1.04ng/mg组织)的水平。

兔缺血性伤口模型的功效

测试了5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑在兔缺血性伤口模型中针对感染的功效，其中该兔缺血性伤口模型是模仿人类DUI的黄金标准动物模型。在该模型中，通过划分新西兰白兔的中央和有侧营养动脉来使耳朵缺血。新西兰白兔用于这项研究，其饲养和实验操作遵守标准的《实验动物护理和使用指南》(2001)。在耳朵底部的裸露的软骨处切开，然后皮内注射肾上腺素以获得血管收缩作用并帮助皮肤脱离。将皮肤与下面的软骨膜分离，并用6.0mm主动脉活检穿孔器去除皮肤。随意进食食物和水，使动物适应7天，提供光亮和黑暗交替的12小时光周期，同时在手术期间提供镇痛药(Buprenex0.02mg/kg sc)和麻醉药(异氟醚(0.5-5％，含氧载体0.5-2L/min)。

通过外科手术进行缺血伤口愈合模型。每个伤口均接种50ul的2x10⁷个CFU/mlMRSA(ATCC#33591)并包扎。一天后，每天用50μl含溶媒(N＝4)的对照乳膏，50μl含莫匹罗星(N＝4)的对照乳膏或50μl含5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑(N＝8)的乳膏处理伤口。在第1、3、5、7、10和14天进行临床观察。使用Draize评分系统评估伤口并记录观察结果。获得并记录了每个伤口的数码照片。

在受伤后第14天，在麻醉作用下，通过以150mg/kg体重的剂量静脉内注射Beuthanasia-D使动物安乐死。收集包括整个伤口在内的样本，以及大约2-3mm的正常未受伤的皮肤边缘。将每个耳朵伤口样本切成两半。将一半的伤口放入装有10％中性福尔马林缓冲液的容器中，并进行常规组织学评估。就伤口组织的受伤部位的四个参数进行评分，即，炎症，肉芽化，血管新生和上皮形成，评分标准从0至4。美国病理学家学院的董事会认证成员以盲照的方式对伤口进行了表征。另一半伤口在无菌陪替氏培养皿中称重(mg)，然后将其置于无菌一次性组织研磨机中并匀浆用于定量微生物学。装有研磨组织样品的试管中充满5ml 0.85％无菌盐水。然后用0.5ml等分试样和每等分试样4.5ml无菌盐水制备5个1:10系列稀释液。随后，将0.1ml匀浆和每种稀释液滴涂在胰蛋白酶大豆琼脂上，并置于37℃的培养箱中。将每个伤口的生物体的数量记录为cfu/每克组织。

与对照组相比，5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑使得细菌存活率降低了99％以上(4-log CFU下降)。5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑组在伤口愈合和上皮形成上明显优于莫匹罗星组。在这些组中，仅5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑组对红斑和浮肿具有明显效果。图1为三组伤口随时间减少的百分比的图表；对照组的伤口收缩比任何一个治疗组都要少(p<0.001)，并且5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑治疗组比莫匹罗星治疗组(p<0.03)好。

蜂窝织炎中的功效

用MRSA皮内注射SKH1小鼠(N＝15)。5只小鼠接受中性对照局部制剂7天。5只小鼠接受含有莫匹罗星的局部制剂7天。5只小鼠接受了含有5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑的局部制剂7天。每天测量病变面积。7天后，测量末端菌落形成单位(CFU)以确定微生物功效。发现用5-(2,5-双(4-氯-2-异丙基苯基)噻吩-3-基)-1H-四唑处理显著减少了病变面积和末端CFU计数(参见图2B，图2A)。