一种新型的Hg2+离子探针的合成及应用
阅读说明:本技术 一种新型的Hg2+离子探针的合成及应用 (Novel Hg2+Synthesis and application of ion probe ) 是由 朱海亮 齐鹏飞 徐镜 李红林 严晓强 于 2018-06-20 设计创作,主要内容包括:一种含氧杂蒽的Hg~(2+)离子探针,它具有如下通式I所示的结构。本发明公开了一种新型的含氧杂蒽的Hg~(2+)离子探针得制备方法与在水中和活细胞中检测Hg~(2+)离子中的应用。(Hg containing oxyanthracene 2+ The ion probe has a structure shown in the following general formula I. The invention discloses a novel Hg of oxygen-containing heteroanthracene 2+ Preparation method of ion probe and detection of Hg in water and living cells 2+ Application in ions.)
技术领域
本发明属于生物化学领域,涉及一种新型的含氧杂蒽的Hg2+离子探针的合成与在水中和细胞内的应用。
背景技术
Hg2+是最危险的金属离子之一,对环境和人类健康都有重大的危害。由于它与核酸和蛋白质中的亚胺或巯基基团具有高亲和力,Hg2+可破坏细胞功能,并对脑,肠,肾和免疫系统造成严重损伤。人体中Hg2+的积累可能导致各种生理功能失调,如水俣病。
近年来,人们已开发出多种检测Hg2+的方法,如电化学、电感耦合,等离子质谱法、高效液相色谱法和原子发射光谱法。虽然这些传统方法具有很好的检测范围,但由于昂贵的设备或专业的操作技能,它们很难被广泛使用。与上述技术相比,因为荧光法具有高选择性、灵敏性、敏捷性、低成本和非侵入性检测等优点,基于荧光法的小分子荧光探针被广泛的应用于检测金属离子以及其他小分子中。本发明根据氧杂蒽的荧光性质,对其接入1,3-丙二硫醇修饰,得到一个含氧杂蒽的荧光探针XL-Hg,对其进行荧光活性以及细胞内活性测试。
发明内容
本发明涉及一种含氧杂蒽的Hg2+离子探针的制备与在检测Hg2+离子中的应用。
本发明的技术方案如下:
一种含氧杂蒽的衍生物XL-Hg,中文名为4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽,其化学结构如下:
一种含氧杂蒽的衍生物XL-Hg的合成方法,其特征是它具有以下步骤:
步骤i 在适当条件下将三溴化磷缓慢加入含有一定体积有机溶剂的烧瓶中混匀,在合适温度下搅拌后,加入适量三氯甲烷溶解的环己酮,在一定条件下搅拌,TLC跟踪检测反应进度直到环己酮反应完全。将反应液倒入冰水中,调节反应液到pH至中性,萃取后取有机相,得到粗制品。经硅胶柱层析后最终得到黄色的油状物即化合物2。
步骤ii 称取一定比例的碳酸铯和2-羟基苯甲醛到烧瓶中,用DMF溶解,缓慢加入DMF溶解的化合物2到反应瓶中,25℃下搅拌反应一段时间,TLC跟踪检测反应进度直到化合物2反应完全。将反应液倒入水中,萃取后取有机相,蒸干得到粗制品,使用硅胶柱层析分离纯化粗产物,最终得到黄色固体即化合物3。
步骤iii 称取化合物3和1,3-丙二硫醇到烧瓶中,用二氯甲烷溶解,滴加三氟化硼醚合物到反应液中,使用氮气保护反应液在25℃下搅拌一段时间,TLC跟踪检测到反应完全。反应液用真空旋转蒸发仪蒸干,使用硅胶柱层析分离纯化粗产物,最终得到黄色固体即为化合物XL-Hg。
其步骤中所述硅胶柱层析,是采用200-300目硅胶柱,洗脱剂为一定比例的二氯甲烷和甲醇以及无水乙酸乙酯和石油醚。
本发明的氧杂蒽的荧光探针在体外以及细胞中检测Hg2+离子具有较好的荧光性质。因此本发明的含氧杂蒽的荧光探针可以有效的检测Hg2+离子的浓度。
附图说明
图1、本发明所述4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的紫外吸收活性图。
图2、本发明所述4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的荧光响应时间图。
图3、本发明所述4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的金属离子选择性图。
图4、本发明所述4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽在细胞内检测Hg2+的荧光成像图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明,但本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例一:4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的制备
称取化合物3(636.75mg,3.0mmol)和1,3-丙二硫醇(649.32μL,6.0mmol)到100ml圆底烧瓶中,用二氯甲烷(5ml)溶解,滴加三氟化硼醚合物(245μL,2mmol)到反应液中,使用氮气保护反应液在25℃下搅拌12h,TLC跟踪检测到反应完全。反应液用真空旋转蒸发仪蒸干,使用200-300目硅胶柱层析分离纯化粗产物(洗脱剂为一定比例的无水乙酸乙酯和石油醚),最终得到黄色固体即为化合物XL-Hg(0.26g,产率29%)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.16(t,J=7.7Hz,1H),7.09(dd,J=7.4,1.3Hz,1H),6.96-6.92(m,2H),6.36(s,1H),5.65(s,1H),3.08(t,J=13.4Hz,2H),2.85(t,J=3.6Hz,1H),2.83(t,J=3.2Hz,1H),2.42(t,J=5.5Hz,2H),2.33(t,J=5.9Hz,2H),2.09-2.06(m,1H),1.68-1.59(m,3H);13C NMR(151MHz,DMSO)δ152.52,144.46,130.25,129.09,126.49,123.15,121.74,120.10,114.83,109.59,46.07,40.52,30.53,29.82,25.39,25.37,21.43;HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+H]+Calcdfor C17H19OS2303.0841,Found 303.0840.
实施例二:4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的紫外吸收活性研究
利用紫外-可见光分光光度计来测定4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的紫外吸收活性研究。
1.实验材料和试剂
(1)PBS缓冲液的配制:135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PHO4,pH7.4,10mM 10%DMSO。
(2)药液的配制:将测试样品XL-Hg用少量的DMSO溶解配成储备液,一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。
(3)Hg(NO3)2溶液的配制:将Hg(NO3)2用少量的去离子水溶解配制成储备液。
(4)加药:将0.5μL测试药液按照最终浓度分别加入到各个1.5ml离心管中。实验分为药物试验组XL-Hg+Hg2+(加入测试药和20μM的Hg(NO3)2)、对照组XL-Hg(只加测试药,不加Hg(NO3)2)。将加药后的离心管室温静置一段时间。
(5)紫外吸收活性的测定:在静置了一段时间后,将离心管中的反应液用移液器转移到比色皿中,在300nm-800nm进行吸收测定。
2.实验结果
4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的紫外吸收活性研究结果见图1。
结果表明:加入20μM的Hg(NO3)2后,368nm处的吸收峰升高并红移到407nm处。说明本发明中的离子探针XL-Hg对Hg2+具有很好的响应能力,具有很显著的荧光强度变化,有作为探针检测细胞内Hg2+离子的潜力。
实施例三:4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的体外荧光响应时间研究
方法:利用荧光仪来测定4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的体外荧光响应时间。
1.实验材料和试剂
(1)PBS缓冲液的配制:135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PHO4,pH7.4,10mM 10%DMSO。
(2)药液的配制:将测试样品XL-Hg用少量的DMSO溶解配成储备液,一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。
(3)Hg(NO3)2溶液的配制:将Hg(NO3)2用少量的去离子水溶解配制成储备液。
(4)加药:将0.5μL测试药液按照最终浓度加入到1.5ml离心管中,加入20μM的HgCl2。将加药后的离心管转移到比色皿中。
(5)荧光活性的测定:在加药后的0,1,5,10,15,30,40,50,60,120,180,360,720min对比色皿中的反应液进行测试。激发波长选择401nm,发射波长选择410nm-650nm,电压650mV,狭缝选择5nm。
2.实验结果
4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的体外荧光响应时间研究结果见图2(a)。
结果表明:加入Hg(NO3)2之后的10min,探针出现一个强烈的荧光增强(超过一半的最大荧光强度),在60min内达到最大荧光强度,并且在12h内保持稳定。证明探针的荧光性质具有时间稳定性,有作为体内长时程检测汞离子的潜在能力。
根据这个实验,我们利用不同时间点的最大荧光强度和时间得到了线性图(图2(b))。
结果表明:在加入Hg(NO3)2之后的0-60min,探针荧光强度急剧增加,1-12h荧光强度很稳定。说明本探针可以用于长时间检测Hg2+。
实施例四:4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的金属选择性研究
利用荧光仪来测定4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的金属选择性活性研究。
1.实验材料和试剂
(1)PBS缓冲液的配制:135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PHO4,pH7.4,10mM 10%DMSO。
(2)药液的配制:将测试样品XL-Hg用少量的DMSO溶解配成储备液,一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。
(3)金属离子溶液的配制:将AlCl3,AgNO3,BaCl2,Ca(NO3)2.4H2O,CdCl2,CoSO4·7H2O,CrCl3,CuSO4·5H2O,FeSO4·7H2O,FeCl3,KCl,LiCl,MgSO4·7H2O,MnCl2·4H2O,NaCl,NiSO4·6H2O,Pb(OAc)2,ZnSO4和Hg(NO3)2用少量的去离子水溶解配制成储备液。
(4)加药:将0.5μL测试药液按照最终浓度分别加入到各个1.5ml离心管中。实验分为药物试验组(20μM的金属离子)、对照组(只加测试药,不加金属离子)。将加药后的离心管室温静置一段时间。
(5)荧光活性的测定:在静置了一段时间后,将离心管中的反应液用移液器转移到比色皿中,激发波长选择401nm,发射波长选择410nm-650nm,电压650mV,狭缝选择5nm。
2.实验结果
4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽的金属选择性研究结果见图3。
结果表明:只加探针的时候F/F值在0-5之间,加入20μM的Hg(NO3)2之后,F/F值在55左右,加入其他金属离子的时候F/F值在0-5之间。证明探针相对于其他金属离子来说,对Hg2+有很好的选择性,在体外荧光性质不受其他金属离子的影响,只对Hg2+有相应,具有细胞内和体内检测Hg2+的潜力,可应用于水中金属离子检测。
实施例五:4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽在细胞成像中的应用
利用荧光共聚焦显微镜技术来检测4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽在细胞成像中的应用,通过双通道收集405nm激发后的反射光,从而检测出细胞中所含的Hg2+。
1.实验材料和试剂
(1)培养液的配制:DMEM(基础培养基)89%,胎牛血清10%,100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素溶液1%。
(2)CT26细胞的培养:利用上述培养液,在37℃、5%CO2培养箱中培养24h。
(3)PBS缓冲液的配制:135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PHO4,pH7.4,10mM 10%DMSO。
(4)实验药液的配制:将测试样品XL-Hg用少量的DMSO溶解配成储备液,一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。
(5)Hg(NO3)2溶液的配制:将Hg(NO3)2用少量的去离子水溶解配制成储备液。
(4)加药:将1μL实验药液按照最终浓度分别加入到细胞培养皿中,在37℃,5%CO2培养箱中孵育15分钟,之后用PBS缓冲液洗三遍,然后加入Hg(NO3)2孵育15分钟。实验分为药物试验组(加入20μM的Hg(NO3)2)、对照组(只加测试药,不加Hg(NO3)2)。
(6)荧光成像:将需成像细胞用PBS洗三遍,在60倍油镜下进行观测。激发为405nm,发射为500nm-520nm以及570nm-590nm。
2.实验结果
4-(1,3-二噻烷-2-基)-2,3-二氢-氧杂蒽在细胞成像中的应用结果见图4。
如图4所示:a-c为只加入荧光探针孵育15分钟的对照组,d-f为加入探针孵育15分钟后又加入Hg(NO3)2孵育15分钟后的实验组。a,d为500nm-520nm的荧光merge图,b,e和c,f分别是green场和dic场下的细胞成像。图中标尺为20μm。
结果证明:只加入探针的时候,细胞在500nm-520nm处没有荧光,加入Hg(NO3)2后,500nm-520nm的荧光显著增强。本探针可以较好的检测活细胞里面的Hg2+。
- 上一篇:一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇:用于检测粘度的近红外荧光化合物及其制备与应用