阅读说明：本技术 一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方及制备方法 (Formula and preparation method of traditional Chinese medicine perfusion preparation for treating female livestock uterine inflammation ) 是由 张同金 王慧姣 于 2020-05-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方及制备方法,包括以下重量份数的成分：横经席130-180份、金樱根130-180份、金银花120-170份、鸡血藤130-180份、红花120-170份、蒲公英120-170份、五指毛桃130-180份、益母草120-170份、苦参80-120份,制作方包括制作横经席、金樱根、鸡血藤、五指毛桃药液1,制作益母草、苦参、红花的药液2,制作蒲公英和金银花的药液3,将三种药液混合、浓缩、注水及得,本发明替代西药抗生素等治疗奶牛子宫内膜炎的理想药品,不但临床效果良好,而且使用方便、操作简单,又可解决化学药品的残留问题,并解决同类中药的治疗不理想的问题。(The invention relates to a formula and a preparation method of a traditional Chinese medicine perfusion preparation for treating female livestock uterine inflammation, wherein the traditional Chinese medicine perfusion preparation comprises the following components in parts by weight: the preparation method comprises the steps of preparing transverse channel mat, cherokee rose root 180, cherokee rose root 130 180, honeysuckle flower 120 170, spatholobus stem 130 180, safflower 120 170, dandelion 120 170, hispid fig 130 180, motherwort 120 170 and sophora flavescens 80-120, wherein the preparation method comprises the steps of preparing transverse channel mat, cherokee rose root, spatholobus stem and hispid fig liquid medicine 1, preparing motherwort herb, sophora flavescens and safflower liquid medicine 2, preparing dandelion and honeysuckle liquid medicine 3, mixing, concentrating and injecting water to obtain the medicinal liquid.)

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方及制备方法

技术领域

本发明涉及中兽药制剂，具体涉及一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方及制备方法。

背景技术

目前有的技术：

1、西药(抗生素)治疗

国内外科研工作者和临床工作人员为研究和探索奶牛子宫内膜炎的治疗方法做了大量的工作，提出了许多有效的治疗措施。总的来说采取的措施有全身性治疗和针对子宫局部抗感染治疗。全身性治疗主要有内服或肌肉注射抗菌药物或激素。但是，全身用药时子宫局部的药物难以达到或维持有效浓度，且大量使用抗生素可导致血液和奶产品中抗生素残留量超标。局部治疗主要是冲洗子宫并给子宫内灌注抗菌药物或激素等生物活性物质，以上应用化药对子宫内治疗是普遍使用的方法。

①、专利CN200710072144.8，专利名称为“一种治疗奶牛子宫内膜炎的复方灌注剂及其制备方法”涉及其配方配比是每100g药粉的含量是土霉素30～50份、β－环糊精30～50份、十二烷基硫酸钠0.5～4份、聚乙烯吡咯烷酮4～10份；每100g药粉中药材重量为益母草80－120g、桃仁40－60g、当归40－120g、川芎20－40g、黄芪40－120g、甘草40－60g。

其方法含有化药成份，对奶牛的治疗有一定的残留，不利于长久应用。

②、期刊论文“宫炎消栓防治奶牛子宫内膜炎的疗效观察”涉及本文通过用宫炎消栓(由蓝桉油、益母草、红花、桃仁、蒲黄等组成的中药栓剂)和利凡诺土霉素溶液分组对伊康乳业分公司牧场的90头奶牛子宫内膜炎防治的效果观察。临床药效学表明:在预防对比试验中,试验A组的有效率,经产奶牛为87.5％。

本文通过用宫炎消栓(由蓝桉油、益母草、红花、桃仁、蒲黄等组成的中药栓剂)和利凡诺土霉素溶液分组对伊康乳业分公司牧场的90头奶牛子宫内膜炎防治的效果观察。临床药效学表明:在预防对比试验中,试验A组的有效率,经产奶牛为87.5％,青年奶牛为100％；受孕时间平均提前,经产奶牛为9.6天,青年奶牛为7.5天。结果表明试验A组效果要稍微好于试验B组。在治疗对比试验中,试验A组的治愈率为66.7％,好转率为16.7％,试验B组的治愈率为60.0％,好转率为20.0％,A组也稍好于试验B组。

其含有土霉素等化药，会对奶牛造成药物残留问题的缺点，且在技术性能治愈率不高。

小结，其含有土霉素等西药及抗生素成分的化药治疗子宫内膜炎，子宫灌注后，能对子宫带来损害，且被吸收在牛奶中有药物残留。目前国家针对动物的用药严格要求，在产奶期严紧应用化药，或要有停药期限，也就是在产奶期就要弃掉治疗期间的牛奶，这样就会对奶牛造成药物残留问题的缺点。

2、中药治疗：

由于抗生素易对奶源造成药物残留和抗生素、化学药物的耐药菌株不断的产生而使疗效降低。因此,近十几年来利用中草药来治疗奶牛子宫内膜炎的研究越来越多,产生了不少经验药方。并且经过科学试验,得到了许多治疗牛子宫内膜炎疗效确实的中草药方剂,市场出现了多种治疗奶牛子宫内膜炎的制剂。中草药具有明显的抗菌消炎、改善血液循环和增强子宫收缩的作用。目前,治疗牛子宫内膜炎的中药制剂及疗效报道较多。

①、专利“一种防治奶牛子宫内膜炎的复方中药灌注液及其制备方法”涉及由蛇床子、苦参、黄连及甘草组成，该复方中药灌注液对奶牛因细菌、真菌、滴虫等引起的子宫内膜炎等疾病疗效显著。其中药治疗的效果不很明显，不够显著。

②、成果“防治母畜子宫内膜炎的中药制剂--清宫促孕灌注液”涉及清宫促孕灌注浆液系根据中兽医药学理论,以具有清热解毒活血化淤、祛腐排脓、净宫促孕功效的千里光、益母草、当归等多味中药为原料,经科学提取制研制而成无菌高渗溶液。临床试验表明：清宫促孕灌注液职母畜子宫内膜炎二次治愈率为96.2％,其中一镒治愈率为86.5％。在技术性能治愈率较低。

③、一种治疗奶牛子宫内膜炎的药物及其制备方法

文献：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所(苗小楼；杨耀光；苏鹏；潘虎；王瑜；焦增华；李锦宇)

一种治疗奶牛子宫内膜炎治疗药物组合物及其制备方法。选用益母草、杨树花、啤酒花、紫锥菊四味药材，经过超声波提取、澄清剂除杂得到澄清透明的红棕色液体。治疗奶牛子宫内膜炎180例,对化脓性子宫内膜炎的治疗奶牛子宫内膜炎的总有效率91.3％，3～5次治愈，治愈后3个情期受胎率为80.91％。此种中药组合治疗方法虽然有一定效果，可用药时间长，且治愈率与受胎率较低。

本发明是一种防治奶牛子宫内膜炎的复方中药灌注液，该药物可用于奶牛因细菌、真菌、滴虫引起的子宫内膜炎等疾病的防治，属于兽药领域。本发明还公开了该复方中药灌注液的制备方法，该方法制备过程简单。其中药治疗的效果不很明显，不够显著等缺点。

④、一种防治母畜不孕症的中药灌注液，目前中药治疗药物只有红花灌注剂一种(其配方由淫羊藿、益母草、红花等3味中药组成)，此种中药组合治疗方法虽然对促孕有一定效果，但对治疗和修复炎症不明显。可用药时间长，且治愈率与受胎率较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方及制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方，包括以下重量份数的成分：横经席130-180份、金樱根130-180份、金银花120-170份、鸡血藤130-180份、红花120-170份、蒲公英120-170份、五指毛桃130-180份、益母草120-170份、苦参80-120份。

在优选的实施方案中，包括以下重量份数的成分：横经席150-170份、金樱根150-170份、金银花130-160份、鸡血藤150-170份、红花130-160份、蒲公英130-160份、五指毛桃150-170份、益母草130-160份、苦参90-110份。

在优选的实施方案中，包括以下重量份数的成分：横经席160份、金樱根160份、金银花150份、鸡血藤160份、红花150份、蒲公英150份、五指毛桃160份、益母草150份、苦参100份。

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：称取上述份数的横经席、金樱根、鸡血藤、五指毛桃，加入相当于生药材12倍量的稀乙醇(50％)水浴回流提取，提取2次，每次2小时，提取液过滤，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，放冷，得药液1；横经席、金樱根、鸡血藤、五指毛桃的主要有效成分为黄酮类物质。性质相似，均易溶于乙醇，故采用一定浓度的乙醇进行回流提取，经过L9(34)正交实验，结果用50％的乙醇提取两次，每次两小时效果最好；

S2：称取上述份数的益母草、苦参，切碎，与上述份数的红花共同加入10倍量的水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约400ml，放冷，缓缓加入95％乙醇使醇沉浓度达到70％，搅匀，密闭静置24小时，沉淀，滤过，滤渣用70％的乙醇洗涤，洗液与滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，放冷，得药液2；益母草、苦参与红花三味中药所含主要药效成分为生物碱、红花黄色素及红花苷等，根据成分的性质及经验可采用传统的水提醇沉工艺进行提取；

S3：经过L9(34)正交实验优选结果为，称取上述份数的蒲公英和金银花加入8倍量的水煎煮提取2次，每次1小时，合并煎液，滤过，2000r/min离心10min，取上清液，得药液3；蒲公英和金银花，二者均含有绿原酸，且为抗菌消炎的主要有效成分，考虑到绿原酸对热有一定的敏感性，有报道，制剂中的绿原酸含量会随着煎煮次数的增多、加热时间的延长而有所降低，故本实验中将此两味药的提取工艺单独考虑，用L9(34)正交实验法对其水提工艺进行了优选，经过对其结果的综合分析，最终确定了蒲公英与金银花两味药的水提工艺路线，确定最佳参数降低抗菌、消炎主要成分绿原酸对热的敏感性；

S4：将药液1、药液2、药液3合并、过滤、浓缩、除杂，加注射用水至规定量即得。

临床疗效与抗生素等治疗效果进行对比，效果有很大差距。差距在于中药在治疗期间奶牛产奶量不受影响，无需休药期，具有散瘀止痛，活血通经,活血化瘀，催情促孕，杀菌消炎，促进粘膜修复，促进子宫自净，改善宫内环境。主治急慢性子宫内膜炎，脓性子宫内膜炎，胎衣不下引起的产后子宫感染等。子宫体炎症，宫颈炎，发情周期不规律，甚至不发情以及母畜不孕症等。

本发明的有益效果为：

1、替代西药抗生素等治疗奶牛子宫内膜炎的理想药品，不但临床效果良好，而且使用方便、操作简单，又可解决化学药品的残留问题，并解决同类中药的治疗不理想的问题，在治疗奶牛子宫内膜炎技术性能指标治愈率达98.7％以上；

2、技术性能指标治愈率达98.7％以上，治疗奶牛子宫内膜炎的治愈率为98.7％,有效率为99.7％,大多1～3次治愈。治疗后3个情期受胎率为95.3％。说明本发明不仅能有效地治疗子宫内膜炎,而且在提高受胎率方面也有很好的效果。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明。

图1-1是本发明实施例所述的对照品的紫外吸收谱；

图1-2是本发明实施例所述的绿原酸的浓度和吸收度之间的关系；

图2是本发明实施例所述的氯原酸标准品浓度为8.6μg/ml高效液相色谱图；

图3是本发明实施例所述的绿原酸标准品溶液浓度与峰高值关系图；

图4是本发明实施例所述的蒲公英水提样品2高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将参照具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明实施例的一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方及制备方法。

实施例1：

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方，包括以下重量份数的成分：横经席130g、金樱根130g、金银花120g、鸡血藤130g、红花120g、蒲公英120g、五指毛桃130g份、益母草120g份、苦参80g份。

实施例2：

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方，包括以下重量份数的成分：横经席150g、金樱根150g、金银花130g、鸡血藤150g、红花130g、蒲公英130g、五指毛桃150g、益母草130g、苦参90g。

实施例3：

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方，包括以下重量份数的成分：横经席160g、金樱根160g、金银花150g、鸡血藤160g、红花150g、蒲公英150g、五指毛桃160g、益母草150g、苦参100g。

实施例4：

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方，横经席170g、金樱根170g、金银花160g、鸡血藤170g、红花160g、蒲公英160g、五指毛桃170g、益母草160g、苦参110g。

实施例5：

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂配方，包括以下重量份数的成分：横经席180g、金樱根180g、金银花170g、鸡血藤180g、红花170g、蒲公英170g、五指毛桃180g、益母草170g、苦参120g。

实施例6：

一种治疗母畜子宫炎症的中药灌注制剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：经过L9(34)正交实验优选结果为，称取上述份数的横经席、金樱根、鸡血藤、五指毛桃，加入相当于生药材12倍量的稀乙醇(50％)水浴回流提取，提取2次，每次2小时，提取液过滤，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，放冷，得药液1；

S2：称取上述份数的益母草、苦参，切碎，与上述份数的红花共同加入10倍量的水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约400ml，放冷，缓缓加入95％乙醇使醇沉浓度达到70％，搅匀，密闭静置24小时，沉淀，滤过，滤渣用70％的乙醇洗涤，洗液与滤液合并，减压回收乙醇至无醇味，放冷，得药液2；

S3：经过L9(34)正交实验优选结果为，称取上述份数的蒲公英和金银花加入8倍量的水煎煮提取2次，每次1小时，合并煎液，滤过，2000r/min离心10min，取上清液，得药液3；

S4：将药液1、药液2、药液3合并、过滤、浓缩、除杂，加注射用水至规定量即得。

一、本专利与同类产品红花灌注剂对奶牛子宫内膜炎的治疗效果比较，见表1：

表1：

本专利对子宫内膜炎的治愈率达到98％以上，国内同类产品红花灌注液治愈率为87％以下。

二、体外抑菌活性试验：

取本专利复方药液加注射用水至1000ml得到含生药浓度为1g·mL-1的灌注液，G3垂熔玻璃漏斗过滤，流通蒸汽灭菌20min，此作为体外抑菌活性供试药品。

称取金银花、蒲公英、横经席、赤勺、菊花、地丁、苦参、瓜萎、白芷各100g加入8倍量的水煎煮提取2次，每次1小时，合并煎液，滤过，2000r/min离心10min，取上清液，得各味中药提取液。

体外抑菌活性的测定：采用试管二倍稀释法，测定单味中药及复方中药对5种致病菌的MIC和MBC。取7支灭菌试管，从1～5管各加2mL无菌营养肉汤(链球菌用血清肉汤)，然后于第1支试管加入2mL的复方中药提取液，充分混匀取出2mL加入第2支试管中，再充分混匀取出2mL加入第3支试管中，以此类推，至第5支试管，充分混匀后弃去2mL，1～5管的中药含量分别为500、250、125、62.5、31.3g·L^－1。第7管加药液2mL作为药液对照。第6管加营养肉汤2mL作为空白对照。1～5和第7管分别加稀释菌液0.05mL，加完样充分混匀，置36～37℃温箱，培养16～18h后观察结果。凡无浑浊变化的药物最低稀释浓度即为该测试菌的最低抑菌浓度。再将肉眼观察无细菌生长的所有试管，划线接种于营养琼脂(链球菌接种血液琼脂)，置36～37℃培养24h后观察记录，以菌落数不超过5个的药物最低稀释浓度为该菌的最小杀菌浓度。

9味重要提取液同样采用试管二倍稀释法，重复上述操作。

9味中药及其复方对5种致病菌体外最小低抑菌浓度和最小杀菌浓度见表2(9味中药与复方中药共计10组)。

表2单味中药和复方中药对5种细菌的MIC值和MBC值(g·L-1)

根据MIC值和MBC值评价中药的体外抗菌活性为:由金银花、蒲公英、横经席等组成的复方中药对5种细菌有较强的抗菌活性，MIC和MBC的范围在31.5～125g·L-1。故选用复方中药横经席，红花、蒲公英、苦参、金银花作为治疗奶牛子宫内膜炎的效果最佳。

三、提取工艺的研究

采用L9(34)正交实验法对蒲公英和金银花水提醇沉工艺进行了优选，确定蒲公英与金银花两味中药水提醇沉工艺最佳参数，其特点是降低抗菌、消炎主要成分绿原酸对热的敏感性，从而增强本产品的抗菌消炎的最佳疗效的技术的工作原理。

1、复方中药提取工艺的研究对单味中药和复方中药分别采用水提工艺、水醇提取、醇水提取及超声波强化浸出四种不同的提取方法，以出膏率和绿原酸提取率为检测指标，考察对其质量的影响，从而筛选出最佳提取工艺。

(1)4种提取工艺研究及干浸膏制备

水提工艺：将蒲公英、金银花、横经席、金樱根、苦参、红花加入8倍量水，不浸泡，直接煎煮2次，每次1h，合并提取液，纱布脱脂棉滤过，2000r·min离心10min，取上清液，常压加热(70～80℃)浓缩至稠膏状，于60℃真空干燥，得干浸膏。

水、醇法：将蒲公英、金银花、横经席、金樱根、苦参、红花加8倍量水，煮沸2次，每次1h，合并两次提取液，纱布脱脂棉过滤，加热浓缩至每mL相当于原药材1g(70～80℃)。加95％乙醇，使溶液含醇量达85％，放置过夜，取上层醇液，下层2000r·min离心10min，取上清液与前液合并，回收乙醇浓缩至无醇味呈稠膏状，于60℃真空干燥，得干浸膏。

醇、水法：将蒲公英、金银花、横经席、金樱根、苦参、红花分别粉碎过24目筛，混匀，取粗粉125g，先用适量95％乙醇浸湿，再按6倍量用95％乙醇，回流提取2次，每次1h，合并醇提液，浓缩回收乙醇至无醇味，加4倍药量的水，放置过夜，滤取上清液，下层2000r·min离心10min，取上清液与前液合并，浓缩至稠膏状，于60℃真空干燥，得干浸膏。

超声波强化浸出法：将蒲公英、金银花、横经席、金樱根、苦参、红花分别粉碎过24目筛，混匀，取粗粉125g，置于有盖容器中(用广口瓶)，加入70％乙醇625mL，密盖，置超声清洗机(工作频率为50kH_Z，输出功率120W，温度60℃)的清洗糟内水液中，开机，超声浸出2h，停机，倾取上层清液，用纱布过滤，残渣用力压榨(用瓶子挤压)出残液，与滤液合并，浓缩回收乙醇至无醇味呈稠膏状，于60℃真空干燥，得干浸膏

4种方法的出膏率见表3。

表3 4种方法所得干膏率

(2)绿原酸含量测定

标准曲线回归方程的建立，精密称取绿原酸对照品4mg，置棕色量瓶中，加50％甲醇溶液100mL至刻度，然后再倍倍稀释，使每1mL含绿原酸40、20、10、5μg系列浓度，即得标准品溶液(10℃以下保存)。用紫外分光光度法在310～340nm波长处，测定其吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，得吸收曲线，327nm为最大吸收波长(见图1-1)。

在波长327nm处测定四种浓度的吸光度(A)。用已知浓度C₁、C₂、C₃、C₄为横坐标，A₁、A₂、A₃、A₄为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y＝37.176x-0.033，r＝0.9995(n＝4)，由此可见，绿原酸含量在0.04mg/mL～0.005mg/mL之间呈良好的线性关系(见图1-2)。

精密度试验按上法对同一标准品溶液平行测定5次，用下列公式计算相对标准差(RSD)，根据RSD评价仪器的精密度。试验结果见表4，平均RSD为1.95％，表明仪器精密度良好。

表4精密度试验结果(n＝5)

不同工艺供试品溶液的制备分别取不同工艺相当于原药材0.5g的复方中药干浸膏，精密称定，置25mL棕色容量瓶中，加50％甲醇约20mL，超声处理30min，放冷，加50％甲醇至刻度，摇匀，4000r·min离心10min，精密量取上清液5mL，置50mL棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，作为不同工艺供试品溶液。

复方中药对照品药材溶液的制备取复方中药对照药材5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇500mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，4000r·min离心10min，精密量取上清液5mL，置50mL棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，作为复方中药对照品药材溶液。

在327nm处测定吸光度，代入回归方程计算样品和对照品药材中绿原酸的含量，以水提工艺和超声波强化浸出法绿原酸的提取率较高。结果见表5。

表5：4种提取工艺绿原酸的含量(n＝3)

(3)结果：四种方法所得干浸膏率以水提工艺较高，因为在水煮过程中，有效成分提取出来的同时，许多杂质如淀粉、多糖类、蛋白质、黏液质、鞣质、树胶、无机盐类等也被提取出来，尽管通过离心除去大部分，但仍有少量留在了提取液中；其次是水、醇法，因药材水煮后，加入乙醇可将部分或大部分淀粉、多糖、蛋白质沉淀除去，但对鞣质、色素、树脂等不易除去，留在了提取液中。

四种方法绿原酸的提取率均低，但以水提工艺和超声波强化浸出法相对较高。由于绿原酸的化学性质稳定性差，在提取过程中受到时间、温度、浓缩方式等影响较大，使其在原药材中的含量损失也随温度升高、时间延长而逐步增加^[1、5]。所以，对金银花、蒲公英这样已经明确有效成分和防治功效的中草药，应该利用现代生物学技术，对其有效成分进行提取、分离。这样既有利于有效成分药理作用机制的研究，又能提高中草药制剂的质量。

2、正交试验法优选蒲公英中绿原酸水提工艺的研究

(1)绿原酸标准品溶液的制备：精密称取经110℃干燥至恒重的绿原酸标准品4.3mg，置50ml的棕色量瓶中，加50％甲醇10ml溶解，再加0.05mol/L pH3 KH2PO4溶液稀释至刻度，摇匀(浓度86μg/ml)，作为储备液。取1ml储备液加0.05mol/L pH3.0KH2PO4溶液稀释10倍(浓度8.6μg/ml)，作为应用液。

(2)供试品溶液的制备：按2000年药典下的高效液色谱法测定蒲公英中绿原酸的含量，精密称取相当于0.5g生药材的干浸膏，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，再精密量取5ml置50ml棕色量瓶中，加0.05mol/L pH3KH2PO4溶液至刻度，摇匀，用孔径为0.45μm水溶性微滤膜滤过，注入高效液相色谱仪并测定含量。

(3)绿原酸含量的测定

色谱条件：采用ODS-3色谱柱，以甲醇-0.05mol/L pH3KH2PO4溶液(35:65)为流动相，检测波长327nm，自动进样量20μL，1.000ml/min流速，柱温25℃下测定。(见图2)

绿原酸标准曲线的制备：精密吸取浓度为86μg/ml的标准品溶液0.5ml、1.0ml、1.0ml、2.5ml、5ml分别加入100ml、100ml、50ml、50ml、50ml的棕色量瓶中，加0.05mol/LpH3KH2PO4溶液稀释至刻度，摇匀。其浓度分别为0.43μg/ml、0.86μg/ml、1.72μg/ml、4.3μg/ml、8.6μg/ml。用孔径为0.45μm水溶性微滤膜滤过，注入高效液相色谱仪并记录色谱图及峰高值。由所得数据进行回归分析，得回归方程。Y＝1.80308x+0.11586，r＝0.99955。绿原酸浓度在0.43μg/ml～8.6μg/ml范围内线性关系良好。(见图3)

精密度试验：用浓度为8.6μg/ml标准品溶液，连续进样6次，测其峰高值。RSD＝0.66％，结果表明，本法精密度较好。

稳定性试验：分别用同一标准品溶液和供试品溶液，每隔一定时间进样1次，结果表明，标准品溶液和供试品溶液在24h内稳定。

重现性试验：取水提工艺样品2相当于蒲公英原药材0.5g的干浸膏，精密称定，分别为0.1511g、0.1513g、0.1510g、0.1517g、0.1518g。按供试品溶液的制备方法，测定蒲公英中绿原酸的含量。RSD＝8.56％。重现性结果较好。(见图4)

回收率试验：取已知绿原酸含量的蒲公英样品2的水提工艺的干浸膏相当于原药材0.5g，精密称定，共取5份，分别为0.1512g、0.1510g、0.1510g、0.1527g、0.1518g。分别精密加入绿原酸标准品，按上述方法测定。RSD＝6.15％。

生药样品绿原酸含量的测定：精密称取粉碎后的样品粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，再精密量取5ml置50ml棕色量瓶中，加0.05mol/L pH3 KH2PO4溶液至刻度，摇匀，用0.45um滤膜滤过，注入液相色谱仪并测定含量。

蒲公英水提醇沉工艺：按L9(34)正交试验表，共设9次实验，每次都分别称取干燥至恒重的样品50g，煎煮后合并滤液，倒入坩埚中，80℃水浴浓缩至稠膏状，80℃真空干燥，得干浸膏。

表6水提工艺正交试验因素、水平表L₉(3⁴)

(4)结果

按正交试验因素、水平表L9(34)，见表1。共设9次实验，每次精密称定干燥至恒重的蒲公英样品50g。经水提工艺提取后，按供试品溶液的的制备方法，测定每份蒲公英样品中绿原酸的含量，并计算绿原酸的提取率。结果见表7。

表7正交试验法优选蒲公英中绿原酸水提工艺试验结果

注：提取率＝样品中绿原酸的含量/生药材绿原酸含量×100％

对表7蒲公英样品绿原酸提取率进行方差分析，结果见表8。

表8正交试验法优选蒲公英水提工艺绿原酸提取率方差分析表

注：*F_0.05(2,11)＝3.98；F_0.01(2,11)＝7.20

从上表7、8可知各因素对提取效果的影响程度依次为C>A>B，因素C和A对结果影响显著(P<0.05),而因素B对试验结果影响不显著，可任选其一个水平。根据蒲公英水提法正交试验绿原酸提取率结果可以分析出：蒲公英中绿原酸的含量随浸泡时间的延长逐渐下降，随提取时间的过长而明显降低，所以浸泡时间以0h、提取时间以1h、1h为最佳条件，加水量可任选一个水平，如从节约能源的角度，应选12+8倍量水为好，但从绿原酸提取率的角度，我们应选15+12倍量为好。因此最优提取工艺可选方案2，即不浸泡，提取2次，加水15+12倍量或12+8倍量，煎煮1h+1h。绿原酸在提取过程中会发生化学变化，提取时间不宜过长。

在流动相的选择中，经反复几次试验摸索，选择酸性流动相，因绿原酸为有机酸，酸性可抑制其电离，出峰时间早，峰形稳定，分离度好。

一般来说，不含贵重药材的中草药汤剂提取次数为2次，所以我们没有考查煎煮次数对实验结果的影响，将煎煮次数定为2次。

验证性试验：精密称取干燥的蒲公英样品50g，共6份，3份加12+8倍量水，另3份加15+12倍量水，都不浸泡，提取1h+1h，收集提取液，按上述方法测定。结果表明：12+8倍量水的蒲公英样品平均提取率为40.88％；15+12倍量水的为42.72％。两者的提取率差异不大，都可作为优选方案。

最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。