阅读说明：本技术 一种地西泮半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 (Diazepam hapten and artificial antigen as well as preparation methods and application thereof ) 是由 马立才 聂靖东 丁亚芳 邢维维 李蓉蓉 刘薇 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种地西泮半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的地西泮人工抗原为将式I<Image he="184" wi="126" file="100004_DEST_PATH_IMAGE001.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>所示的地西泮半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明所提供地西泮人工抗原合成方法简单,纯度高和产率高,对于地西泮抗体的制备,以及地西泮药物残留检测具有重大价值。(The invention discloses a diazepam hapten, an artificial antigen, and preparation methods and applications thereof. The diazepam artificial antigen provided by the invention is represented by the formula I)

一种地西泮半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物残留快速检测领域，涉及一种地西泮人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

地西泮又名安定，为镇静剂类药物，主要用于焦虑、镇静催眠，还可用于抗癫痫和抗惊厥，对改善病人的睡眠，对抗焦虑，解除烦躁，起重要作用。但在发挥治疗作用的同时，也表现出种种不良反应，例如嗜睡、头痛、乏力等，特别是连续使用容易成瘾。随着包括地西泮在内的镇静剂类药物在临床上的广泛应用，其间接的毒副作用越来越引起重视。农业部235号公告的附件《动物性食品中兽药最高残留量》中明确规定地西泮等镇静剂类药物只能用于治疗，不得在动物性食品中检出。2011年的“瘦肉精事件”后，卫生部于当年4月发布了食品中可能违法添加的非食用物质名单，其中就包括安定（即地西泮）药物。因此，建立快速高效检测食品中地西泮残留量的方法具有重要意义。

目前对于地西泮的检测方法，主要有气相色谱质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）以及液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）等，虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。

影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种地西泮人工抗原及其制备方法与应用。

本发明所提供的地西泮人工抗原是在地西泮半抗原的基础上构建所得的抗原。

所述地西泮半抗原属于本发明的保护范围，其结构如式I所示。

式I

本发明所提供的制备所述地西泮半抗原的方法，具体可包括如下步骤：

1、2-氨基-5-氯二苯甲酮加入四氢呋喃（THF）搅拌，加入溴乙酰溴反应，反应液经旋干、萃取、再旋干获得干燥黄色固体1。所述2-氨基-5-氯二苯甲酮、四氢呋喃（THF）和溴乙酰溴的配比为200mg：5ml：261mg，所述溴乙酰溴反应条件为冰浴，所述萃取剂为水和乙酸乙酯，水、乙酸乙酯配比为5ml：15ml。

2、固体1溶解于甲醇中，加入六次甲基四胺反应，反应液经调PH、加热、旋干、萃取、再旋干获得固体2。所述固体1、甲醇、六次甲基四胺的配比为150mg：3ml：120mg，所述调pH为盐酸调pH=5，所述萃取剂为水和乙酸乙酯，水、乙酸乙酯配比为3ml：9ml。

3、固体2溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，加入氢化纳、4-溴丁酸甲酯反应，再加入水，析出沉淀，过滤，获得固体3。所述固体2、二甲基甲酰胺（DMF）、氢化纳、4-溴丁酸甲酯、水的配比为50mg：1ml：6mg：63mg：5ml。

4、固体3溶解于甲醇中，加入2N氢氧化钠溶液反应，反应液经调PH、旋干、水洗、过滤获得到半抗原4。所述固体3、甲醇、2N氢氧化钠溶液的配比为100mg：5ml：15ml。

在地西泮半抗原的基础上构建所得的地西泮抗原也属于本发明的保护范围。

所述地西泮抗原，为将所述地西泮半抗原（式I）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。

所述地西泮抗原的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述地西泮抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述地西泮半抗原（式I）与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述地西泮抗原。

在本发明中，所述地西泮抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：

（1）将所述地西泮半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；

其中，所述地西泮半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为15.07mg：1.5ml：21.45mg：12.88mg。

（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.57-50mg：3.5ml；

其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5ml；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.57mg：3.5ml；

（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；

（4）用磷酸盐缓冲液（0.01M PBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述地西泮抗原。

所述地西泮半抗原（式I）或所述地西泮抗原在定性或定量检测地西泮中的应用也属于本发明的保护范围。

利用所述地西泮抗原制备的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。

本发明所提供的地西泮半抗原，以及所述地西泮抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于地西泮抗体的制备，以及地西泮药物残留检测具有重大价值。

附图说明

图1为地西泮半抗原质谱图。

图2为地西泮的标准曲线。

图3为ELISA法检测三种样本（猪肉、猪尿、猪饲料）与GC-MS检测结果一致性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、地西泮半抗原的制备及鉴定

1、地西泮半抗原的制备

（1）将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，将其固定在搅拌器上，加入搅拌子，称取200mg2-氨基-5-氯二苯甲酮，用5ml THF溶解，搅拌，全部溶解后留样，在冰浴下加入261mg溴乙酰溴，搅拌，点板监测反应，反应完全后，旋干溶剂，加5ml水和15ml乙酸乙酯，萃取分液，旋干乙酸乙酯得到干燥黄色固体1。

（2）将150mg上述黄色固体1用3ml甲醇溶解，加入120mg六次甲基四胺，用盐酸调节PH=5，加热回流反应，点板监测，反应完全，旋干溶剂，加3ml水和9ml乙酸乙酯萃取，旋干有机相得到固体2。

（3）将50mg上述固体2用1ml DMF溶解，冰浴下加入6mg氢化纳，再加入63mg 4-溴丁酸甲酯，点板监测，反应完全后，向体系中加入5ml水，有沉淀析出，过滤，得到固体3。

（4）将100mg上述固体3用5ml甲醇溶解，搅拌，加入1.5ml 2N氢氧化钠溶液，点板监测反应进程，完全反应后，用乙酸调节PH值到6，旋干，水洗，过滤，得到半抗原4。

反应方程式如下：

2、地西泮半抗原的结构鉴定

对所得半抗原4进行质谱检测（图1），结果显示其化学结构式如式I所示（MW=356.81），即为地西泮半抗原。

式I

实施例2、地西泮人工抗原的制备

1、免疫原的合成

（1）将15.07mg地西泮半抗原4用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入21.45mg EDC、12.88mg NHS溶解，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。

（2）称取50mg BSA溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1ml/min），500rpm搅拌反应24h。

（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。

2、包被原的合成

（1）将15.07mg地西泮半抗原4用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入21.45mg EDC、12.88mg NHS溶解，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。

（2）称取33.57mg OVA溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1ml/min），500rpm搅拌反应24h。

（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。

实施例3、地西泮人工抗原免疫动物制备单克隆抗体

一、动物免疫

用实施例2制备出的免疫原（地西泮-BSA）按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

二、细胞融合与克隆

按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000）进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

3、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/ml的地西泮等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代地西泮作对照，其余步骤同上。若经地西泮阻断后的OD_450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

三、单克隆抗体的制备及纯化

将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×10⁵/只，7~10日后抽取小鼠腹水。收集细胞上清或腹水，采用间接ELISA法测定其效价（测定效价时以P/N>2.1的细胞上清或腹水最大稀释倍数表示），结果表明细胞上清的效价为1：10000，腹水的效价为1：50000。接着，用辛酸-饱和硫酸铵法对其进行纯化，纯化后放入-20℃环境保存。

经检测，地西泮单克隆抗体的重链的可变区的氨基酸序列为序列表的序列1所示，地西泮单克隆抗体的轻链的可变区的氨基酸序列为序列表的序列2所示。

实施例4、地西泮酶联免疫试剂盒检测地西泮

一、地西泮酶联免疫试剂盒的组装

1、地西泮酶联免疫试剂盒的组成包括如下：

（1）地西泮标准品工作液：6瓶，1.5ml/瓶，浓度为0μg/l、0.03μg/l、0.09μg/l、0.27μg/l、0.81μg/l、2.43μg/l；

（2）地西泮酶标板：1块（8孔×12条），为包被了实施例2制备得到的“地西泮-OVA”的酶标板；

（3）地西泮抗体工作液：1瓶（7ml），为抗体稀释液将抗体进行1:40000稀释，抗体稀释液为含6%（体积分数）山羊血清的0.2M PBS，所述地西泮抗体为实施例3制备得到的抗血清纯化所得的抗体；

（4）酶标记物浓缩液：1瓶（1ml），酶标记物为经辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体；

（5）复溶液：1瓶（2×，50ml），为0.01M pH7.4的PBS；

（6）洗涤液：1瓶（20×，25ml），为0.01M pH7.4的PBST溶液；

（7）底物A液、底物B液各1瓶（7ml）。其中，底物A为2%过氧化脲水溶液。底物B为1%四甲基联苯胺水溶液；

（8）终止液：1瓶（7ml），为2M H₂SO₄溶液；

（9）盖板膜；

（10）自封袋。

2、需要而未提供的设备和材料

（1）设备

酶标仪（检测波长450nm，参考波长630nm）、均质器、天平（精度：0.01g）、漩涡振荡器、离心机（4000g）、氮吹仪、微量移液器、计时器。

（2）试剂

1M氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠于干净烧杯中，加入500ml去离子水溶解。

复溶工作液：用去离子水按1:1体积比（1份浓缩复溶液+1份去离子水）稀释。

洗涤工作液：用去离子水按1:19体积比（1份浓缩洗涤液+19份去离子水）稀释。

乙腈、正己烷。

3、贮存

该试剂盒贮存于2-8℃，切勿冷冻，有效期1年。

未使用完的酶标板条应密封，2-8℃保存。

4、试剂盒检测原理

样品中的地西泮与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标记物，催化底物显色，根据显色的深浅来判断样品中地西泮的含量。显色深，含量少，显色浅，含量多。

二、地西泮酶联免疫试剂盒的使用方法

1、样品前处理

（1）组织（肌肉、肝脏等）（稀释系数：10）

a）称取2.0±0.05g均质后的组织样本于50ml离心管中；b）依次加入7.2ml去离子水、0.8ml 1M氢氧化钠溶液，振荡5min；c）4000g以上，离心10min；d）取1ml上清液于50ml离心管中，加入10ml正己烷，振荡5min；e）4000g以上，离心10min；f）取5ml上层有机相于10ml新的离心管中，50-60℃水浴氮气吹干；g）加入1ml复溶工作液，涡动2min；h）取50μl进行检测。

（2）尿液（稀释系数：10）

a）取1ml清亮尿液样本于50ml离心管中；b）依次加入3.6ml去离子水、0.4ml 1M氢氧化钠溶液，振荡2~5min；c）取1ml混合液于50ml离心管中；d）加入10ml正己烷，用振荡器振荡5min；e）4000g以上，离心10min；f）取5ml上层有机相于10ml新的离心管中，50-60℃水浴氮气吹干；g）加入1ml复溶工作液，涡动2min；h）取50μl进行检测。

（3）饲料（稀释系数：20）

a）称取1.0±0.05g饲料样本于50ml离心管中；b）依次加入3.7ml去离子水、0.3ml 1M氢氧化钠溶液，涡动1min；c）再加入10ml正己烷，振荡10min；d）4000g以上，离心10min；e）移取1ml上层有机相于10ml新的离心管中，50-60℃水浴氮气吹干；f）加入1ml复溶工作液，涡动2min；g）用复溶工作液按1:1体积比（1份样本液+1份复溶工作液）稀释，涡动1min；h）取50μl进行检测。

2、检测步骤

（1）将板条插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做双孔平行，未使用的板条用自封袋密封后，立即保存于2-8℃环境中；

（2）将50μl各浓度的地西泮标准品工作液（或待测样品溶液）分别加入对应的标准品（或待测样品孔）中；

（3）配制酶标记物工作液：用抗体工作液按1:10体积比（1份酶标记物浓缩液+10份抗体工作液）稀释，轻柔混匀。该溶液混匀后应立即使用，不能存放；

（4）每孔加入50μl酶标记物工作液；

（5）盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应30min；

（6）揭开盖板膜；

（7）倒掉板孔中液体，在每孔加入260μl洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡15-30s；

（8）倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；

（9）立即在每孔中加入100μl A、B混合液；

（10）盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应20min；

（11）揭开盖板膜，在每孔中加入50μl终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；

（12）终止后5min内用酶标仪在双波长450nm、630nm下读取酶标板吸光度值。

3、结果计算或判定

（1）各标准品（或待测样品）的平均吸光度值，除以零标（浓度为0μg/l的标准品）吸光度值，乘以100，可以得到各标准品对应的吸光度的百分比，即百分吸光度值。

（2）以各标准品的百分吸光度值为纵坐标，以对应的地西泮浓度为横坐标绘制标准曲线。

（3）将待测样品的百分吸光度值代入标准曲线方程，可得出待测样品对应的浓度，再乘以相应样品的稀释倍数，方得待测原样品中地西泮的实际含量。

三、地西泮酶联免疫试剂盒检测地西泮

按照本实施例二试剂盒使用方法，测定本发明开发的试剂盒的灵敏度（IC₅₀）、检测限、

1、试剂盒灵敏度（IC₅₀）测定

检测浓度分别为0.00、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43、7.29μg/l的地西泮标准品。以标准品浓度的对数值为横坐标、吸光率B/B₀为纵坐标(B为各个标准品浓度的OD值，B₀为0μg/l的OD值）绘制标准曲线。

地西泮标准曲线见图2。

地西泮标准曲线方程为：y=0.0154+0.9868/(1+(x/0.1705)^1.772)

相关系数(R²)为0.9996，IC₅₀为0.1705μg/l，地西泮酶联免疫试剂盒的灵敏度为0.17μg/l。

2、最低检测限测定

取20份空白样品进行检测，根据标准曲线求出测定值，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限，结果如表1所示，测得猪肉、猪尿中地西泮最低检测限为5μg/kg，猪饲料中地西泮最低检测限为20μg/kg。

表1 空白样品测定结果统计表（µg/kg）

3、方法准确度和精密度的测定

分别测定了20个空白样品，按照本发明提供方法进行前处理，根据标准曲线求出测定值，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限。结果见表2-表4，结果表明猪肉、猪尿、猪饲料样品各添加浓度的回收率在92.35～108.90%之间；批内、批间变异系数小于10%。

表2 试剂盒准确度和精密度（猪肉）

表3 试剂盒准确度和精密度（猪尿）

表4 试剂盒准确度和精密度（猪饲料）

4、特异性检测

地西泮酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确定的。交叉反应越小，特异性越好。

将地西泮及其它类似物（硝西泮、氯硝西泮、氟西泮、氟托西泮）分别做系列稀释，分别按照如上步骤二2进行操作，以地西泮及其它类似物的系列稀释液替代其中的“地西泮标准品工作液”，制作标准曲线，并在曲线上找出各自50%抑制浓度（IC₅₀），具体方法如下：得到纵坐标数值等于50%对应的地西泮浓度（μg/l），即IC₅₀值。用下式计算试剂盒对地西泮和各类似物的交叉反应率。

交叉反应率（%）＝（引起50%抑制的地西泮浓度/引起50%抑制的地西泮类似物浓度）×100％

结果如表5所示，从表5中可以看出，地西泮酶联免疫试剂盒对各种类似物的交叉反应率均小于0.1%。这说明地西泮酶联免疫试剂盒对地西泮具有极高的特异性，可有效的排除其它类似物的干扰，可专门用于地西泮的检测。

表5 地西泮酶联免疫试剂盒的特异性

5、地西泮酶联免疫试剂盒检测地西泮的回收率测定

测定采用地西泮酶联免疫试剂盒检测地西泮的回收率。具体方法如步骤二。

结果显示，采用地西泮酶联免疫试剂盒检测地西泮的回收率范围为80%~120%。

6、地西泮酶联免疫试剂盒与仪器方法检测结果比对

用ELISA法检测三种样本（猪肉、猪尿、猪饲料，共60份），分别与GC-MS的检测结果进行确证比较。其中有49份样本，两种方法的结果均为阴性。剩余11份阳性样本的检测准确如图3所示，ELISA的结果显示与GC-MS显著相关，均准确可靠。线性拟合的R²为0.9829，斜率（slop）为0.8003。ELISA法与GC-MS的检测结果一致性好。

ELISA法检测三种样本（猪肉、猪尿、猪饲料）与GC-MS检测结果一致性见图3。

实施例5、地西泮胶体金试纸条检测地西泮

一、地西泮胶体金试纸条的组成

地西泮胶体金试纸条由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例3得到的地西泮单克隆抗体；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区（T线）和质控区（C线）均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被实施例2制备的地西泮-OVA，质控区包被羊抗鼠二抗。

样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端的一端。

二、试纸条的制备

1、胶体金标记抗体

（1）胶体金溶液的制备

取0.01％氯金酸水溶液100ml用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.5ml，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，2-8℃保存。

（2）金标抗体溶液的制备

用0.1mol/l K₂CO₃水溶液调节胶体金溶液的pH至8.2，然后取10ml加入50ml烧杯中，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入单克隆抗体溶液，逐滴加入3ml 5g/100 ml BSA水溶液，持续搅拌10min。

（3）将金标抗体溶液20-24℃低速（1500r/min）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液。

（4）将步骤（3）的溶液4℃、11000r/min 离心40min，溶液分为三层( 透明上清、管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层)，将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1g/100ml BSA的0.01mol/l磷酸盐缓冲液混悬至原金标抗体溶液的体积，过夜，4℃、11000r/min离心40min，收集沉淀。

（5）用含1g/100ml BSA和0.02g/100ml NaN₃的0.01mol/l磷酸盐缓冲液将步骤（4）的沉淀混悬至原金标抗体溶液的体积的1/40，2-8℃保存。

2、喷金：将步骤（1）得到的混悬液喷到玻璃纤维膜上，制成胶体金垫。

3、喷膜：在反应膜上的T线位置喷上实施例2制备的地西泮-OVA、C线位置喷上羊抗鼠抗体。

4、组装：将样品吸收垫（纤维素滤膜）、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按常规方法进行组装，然后切条，即可检测。也可以将试纸条装入塑料制卡中，形成试纸卡用于检测。

三、用试纸卡进行检测

1、样品前处理及检测

样品前处理方法如实施例四的步骤二1。

取出试纸卡，开封后平放于桌面，吸取待测样本溶液逐滴加入3~5滴于样品孔中；5-10min判断结果，15min后的判断结果无效。

结果判断标准：

阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性；

阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性；

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。

序列表

<110> 北京维德维康生物技术有限公司

<120> 一种地西泮半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Leu Gln Gln Ser Glu Val Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Lys Leu Ser Ser Cys Ala Ser Gly Lys Tyr Phe Val Thr Ala Tyr

20 25 30

Trp Met Trp Leu Gln Leu Glu Arg Gln Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Val Pro Gly Asp Ile Tyr Gly Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys

50 55 60

Phe Gln Gly Lys Ala Thr Tyr Thr Ala Asp Lys Ser Leu Thr Ala Ser

65 70 75 80

Ser Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Val Tyr Tyr Cys Ser Ala

85 90 95

Asp Ala Arg Trp Phe His His Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Ser Thr Val

115

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Gln Leu Thr Gln Ser Asp Pro Lys Ser Met Val Ser Met Ser Glu

1 5 10 15

Glu Lys Ala Leu Ser Thr Arg Val Cys Ser Glu Gly Asn Val Tyr Val

20 25 30

Ser Trp Tyr Thr Lys Gln Gln Pro Gln Ser Pro Glu Arg Asn Ser Gly

35 40 45

Val Ile Leu Tyr Arg Cys Thr Leu Gly Asp Val Pro Phe Thr Gly Ser

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Ile Leu Thr Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Leu Ala Glu Asp Asp Tyr Cys Gly His Gln Ile Tyr Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105