阅读说明：本技术 一种快速识别大曲等级的方法 (Method for rapidly identifying Daqu grade ) 是由 王寿峰 明红梅 周慧 周冯利 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及大曲识别技术领域,具体涉及一种快速识别大曲等级的方法。具体技术方案为：一种快速识别大曲等级的方法,采集多个不同等级的大曲样品的核磁图谱,并对核磁图谱进行校正,分段积分；然后构建大曲等级识别分类模型；最后将未知大曲的核磁数据输入分类模型中,实现对大曲等级的快速识别。本发明运用<Sup>1</Sup>H-NMR的技术,建立了<Sup>1</Sup>H-NMR积分数据库,构建大曲等级识别分类模型,最终与计算机联用对大曲等级进行识别。(The invention relates to the technical field of yeast identification, in particular to a method for quickly identifying the grade of yeast. The specific technical scheme is as follows: a method for rapidly identifying the grade of Daqu comprises the steps of collecting nuclear magnetic maps of Daqu samples with different grades, correcting the nuclear magnetic maps, and performing segmentation integration; then constructing a yeast grade identification classification model; and finally, inputting the nuclear magnetic data of the unknown Daqu into a classification model to realize the rapid identification of the Daqu grade. Application of the invention 1 H-NMR technique, established 1 And (4) constructing a Daqu grade identification classification model by using an H-NMR integral database, and finally identifying the Daqu grade by using the Daqu grade identification classification model and a computer.)

一种快速识别大曲等级的方法

技术领域

本发明涉及大曲识别技术领域，具体涉及一种快速识别大曲等级的方法。

背景技术

大曲是以小麦为主或辅以豌豆和大麦等发酵制成的形状较大并含有多种菌类、酶类及香味物质的微生态制品，是酿酒生产中的糖化发酵剂和生香剂，同时也是酿酒生产的部分原料。由于微生物的代谢作用使得大曲含有丰富的风味物质及其前体物，这些风味化合物构成了大曲自身的“曲香”，对中国白酒的生产有重大影响。

大曲质量评价多以传统的感官评价方式为主辅以理化分析，虽然能在一定程度上反映出大曲的质量，但缺乏一些科学依据，理化指标为常量分析，个别指标需要7天才能完成，耗时耗力(酿酒大曲通用分析方法QB/T 4257-2011；CN104865360A，一种浓香型大曲质量评价方法及系统)。

近年来，随着分析仪器和分析技术的不断提高，在剖析大曲风味物质组成方面取得了很大进展，合理的大曲风味物质解析可以在一定程度上反映大曲质量。中国专利(CN103293264A，一种鉴别大曲质量的方法)介绍了一种应用固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术，可以对出仓黄曲，白曲，成品曲进行区分，准确率不高。近些年迅速发展起来的高通量DNA测序技术可以获得微生物群落组成，将该技术运用于大曲微生物的研究，能够揭示微生物群落结构与大曲质量的关系(中国专利CN104109719A，一种基于箱线图鉴别大曲质量的方法；CN104372075A，一种构建判别模型鉴别大曲质量的方法；CN109949863A，一种基于随机森林模型鉴别大曲质量的方法)，该技术当前检测灵敏度略低，重复性较差。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速识别大曲等级的方法，运用¹H-NMR的技术，建立了¹H-NMR积分数据库，构建大曲等级识别分类模型，最终与计算机联用对大曲等级进行识别。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种快速识别大曲等级的方法，采集多个不同等级的大曲样品的核磁图谱，并对核磁图谱进行校正，分段积分；然后构建大曲等级识别分类模型；最后将未知大曲的核磁数据输入分类模型中，实现对大曲等级的快速识别。

优选的，大曲样品的制备过程为：在大曲样品中加入蒸馏水，研磨，离心，取上清液加入到核磁管中，再加入重水，混匀，密封，冷藏，待测。

优选的，研磨的过程为：70Hz研磨300s，循环2次；离心的过程为：10000rpm离心10min。

优选的，重水中含有0.05％氘代三甲基硅基丙酸钠。

优选的，核磁图谱通过Mestrenova软件处理，对核磁图谱进行校正、分段积分，建立标准样品核磁积分数据库。

优选的，构建大曲等级识别分类模型的方式为支持向量机或神经网络。

优选的，将标准样品核磁积分数据库内的数据通过支持向量机进行分析，建立分类模型；然后将未知大曲样品的核磁图谱数据导入分类模型中，对未知大曲样品进行识别。

优选的，将标准样品核磁积分数据库内的数据进行神经网络分析，网络层数为3层，第一层隐藏节点数为20，最大迭代数为5×10⁴，进行训练优化，建立分类模型；然后将未知大曲样品的核磁图谱数据导入分类模型中，对未知大曲样品进行识别。

本发明具备以下有益效果：

1)与现有技术相比，本发明采用高通量、高分辨率的¹H-NMR代谢组学技术，对不同品种大曲品质进行评价。该方法表明，不同品种大曲代谢产物组成与含量都有显著的差异，对核磁图谱进行校正，分段积分；采用数据处理技术，构建大曲等级识别分类模型，实现对未知大曲等级的快速识别。采用本发明可建立不同品质大曲的核磁共振积分数据数据库。本发明具有系统、准确、可靠、高效的特点，结合计算机统计分析技术对于完善目前的大曲品质评价技术体系具有重要意义。

2)本发明从根本上解决了依靠人为感官评定与主要化学成分分析所带来的问题：人为感官评定工作量大，且结果受许多环境因素、人的心理因素等制约，有很大的主观性和随机性，以及感官评定结合理化分析虽是大曲品质评价的基本方法，但是理化指标有限，大曲成分十分复杂，单纯的某些指标并不足以反映大曲的内在品质，在应用中有严重的局限性。

3)本发明提供的大曲品质¹H-NMR评价方法，是一种对成分复杂样品也能进行很好的分析的手段，它的整体性和模糊性，既能反映样本的整体信息，且工作量并不大。更为重要的是它能达到区分不同种类，不同地域，不同品质的大曲。

附图说明

图1为大曲核磁氢谱图；

图2为不同等级的大曲O2PLS-DA分析图；

图3为未知等级大曲O2PLS-DA分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

若未特别指明，实施举例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明公开了一种快速识别大曲等级的方法，采集多个不同等级的大曲样品的核磁图谱，并对核磁图谱进行校正，分段积分，具体的：采用核磁图谱通过Mestrenova软件处理，对核磁图谱进行校正、分段积分，建立标准样品核磁积分数据库。然后通过偏最小二乘法判别分析、支持向量机和神经网络中的任意一种方式构建大曲等级识别分类模型；最后将未知大曲的核磁数据输入分类模型中，实现对大曲等级的快速识别。

大曲样品的制备过程为：在大曲样品中加入蒸馏水，研磨，离心，取上清液加入到核磁管中，再加入含有0.05％氘代三甲基硅基丙酸钠(TMSP)内标的重水，混匀，密封，冷藏，待测，¹H-NMR的测定条件为：测定频率为600.13MHz，温度298K，扫描范围-5～15ppm，采样点64k，扫描次数64。研磨的过程为：70Hz研磨300s，循环2次；离心的过程为：10000rpm离心10min。

采用偏最小二乘法判别分析时：用偏最小二乘法判别分析O2PLS-DA对标准样品核磁积分数据库内的数据进行分析，建立分类模型；然后将位置大曲样品的核磁图谱数据导入分类模型中，对未知大曲样品进行识别。

采用支持向量机分析时：将标准样品核磁积分数据库内的数据通过支持向量机进行分析，建立分类模型；然后将未知大曲样品的核磁图谱数据导入分类模型中，对未知大曲样品进行识别。

采用神经网络分析时：将标准样品核磁积分数据库内的数据进行神经网络分析，网络层数为3层，第一层隐藏节点数为20，最大迭代数为5×10⁴，进行训练优化，建立分类模型；然后将未知大曲样品的核磁图谱数据导入分类模型中，对未知大曲样品进行识别。

下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例

1、对待测样品进行测定

1.1大曲材料：

本实施例共收集泸州怀玉制曲有限责任公司不同贮存期浓香型中高温曲80个样品，其中65个样品作为训练集，15个样品作为测试集，样品结合理化生化指标(酒化力、酯化力、氨态氮、容重)进行了等级划分，详情见下表1所示。对选取的大曲曲块进行粉碎、过0.25mm孔径筛处理，于-80℃深冷冰箱保存备用。测试所用重水(D₂O)及氘代三甲基硅基丙酸钠(TMSP-d4)购买于剑桥同位素实验室，核磁共振氢谱测定采用Bruker AVANCEIII600MHz超导核磁共振谱仪测定。

表1浓香大曲分类统计

1.2样品准备：

通过考察各因素对信噪比的影响，来确认最优方法。优选的方法是：准确称取50mg均一的大曲粉置于2mL的离心管中，加入900μL蒸馏水，加入研磨珠，组织研磨仪研磨，70Hz研磨300s,循环2次；提取液于10000rpm高速离心10min，取上清液450μL，加入核磁管，再向该核磁管加入50μL重水(含0.05％TMSP内标)，涡旋30s，采集NMR谱图。

1.3 ¹H-NMR测定条件：

样品在600MHz NMR仪上测定，测定频率600.13MHz，温度298K，谱宽16ppm，采样点64k，扫描次数64，采用zgpr脉冲序列或者noesygppr1d序列压制水峰，优选使用noesygppr1d序列，用重水进行锁场，内标为TMSP。测得的一级大曲样品核磁氢谱如图1所示。

2、建立标准样品的¹H-NMR矩阵

利用MestReNova软件对谱图依次进行相位校正、基线校正、扣除水峰(δ5.10-4.50ppm)，从δ-0.05-12ppm按0.05ppm分段积分，归一化处理，导出数据，得到化学位移及相应积分面积。经过上述处理之后，对训练集建立了的65×228结构的¹H-NMR积分数据矩阵(训练集)，即整个训练集数据库包括65个样品，每个样品包括228个数据点。

3、建立大曲识别模型

将训练集数据导入Simca13.0软件，利用偏最小二乘法判别分析O2PLS-DA对训练集65个大曲进行分析，由图2中可以看到，3种不同等级大曲分类明显，可以看到不同等级大曲样品各自聚类，并相互区分，一级(A)、二级(B)、三级(C)三组样品能够完全区分开来。将一个未知等级样品数据(S)加入到数据库中，进行O2PLS-DA分析，可以看到未知样品S和A类(一级)聚到一起，见图3所示。

或者，将训练集数据导入支持向量机软件进行分析，将训练集的数据导入Matlab软件进行支持向量机分析，向量机类型选C-SVM，核函数选：radial basis，数据归一化处理，偏差类型为方差，进行训练优化，建立分类模型。然后，将测试集数据导入分类模型，计算，输出结果，见下表2所示；经对比表1中的数据，15个测试样品全部正确识别，见下表3所示。

表2不同大曲等级支持向量机分析结果

表3不同大曲等级的鉴定结果

大曲等级	测试样本数	正确识别样本数	识别率	正确率
					优(1)	6个	6个	100％	100％
良(2)	6个	6个	100％	100％
					合格(3)	3个	3个	100％	100％

或者，将训练集数据导入神经网络软件进行分析，将训练集的数据导入Matlab软件进行神经网络分析，网络层数选3层；第一层隐藏节点数选择20；最大迭代数选5×10⁴，进行训练优化，建立分类模型。将测试集数据导入分类模型，计算，输出结果，见下表4所示，经对比表1中的数据，15个测试样品全部正确识别。

表4不同大曲等级神经网络分析结果

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。