阅读说明：本技术 一种颈动脉粥样硬化斑块动物模型的构建方法 (Method for constructing carotid atherosclerotic plaque animal model ) 是由 郭应坤 叶鹏飞 刘灵军 文凌仪 许华燕 谢林均 傅航 陈林 许可 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种颈动脉粥样硬化斑块动物模型的构建方法,属于动物模型构建领域。该构建方法是通过耳中央动脉损伤颈总动脉动脉内膜联合高脂饲料喂养造模。本发明成功构建了颈动脉粥样硬化斑块动物模型。该构建方法经兔耳中央动脉入路造模,创伤小、操作简便、动物存活率高、造模成功率高且其他因素影响小,克服了现有技术中构建颈动脉粥样硬化斑块动物模型存在的问题,可用于筛选治疗动脉粥样硬化斑块药物等,对于颈动脉粥样硬化的研究具有重要意义。(The invention provides a method for constructing a carotid atherosclerotic plaque animal model, and belongs to the field of animal model construction. The construction method is to combine the injury of the central artery of the ear with the endarterium of the common carotid artery and feed for molding with high fat feed. The invention successfully constructs the carotid atherosclerotic plaque animal model. The construction method is used for model building through rabbit ear central artery access, has the advantages of small wound, simple and convenient operation, high animal survival rate, high model building success rate and small influence of other factors, overcomes the problems in the prior art for building a carotid atherosclerotic plaque animal model, can be used for screening drugs for treating atherosclerotic plaque and the like, and has important significance for research on carotid atherosclerosis.)

一种颈动脉粥样硬化斑块动物模型的构建方法

技术领域

本发明属于动物模型构建领域，具体涉及一种颈动脉粥样硬化斑块动物模型的构建方法。

背景技术

动脉粥样硬化是动脉管壁上沉积了一层像腊样的脂类，使动脉弹性减低、管腔变窄的病变。当这些腊样的沉积物一块一块形成时，就称作动脉粥样硬化斑块。这些斑块早期是平齐血管内膜的，通常顺着血管纵向分布，然后如果继续进展，斑块就慢慢在管壁上向内突入，引起动脉内径不同程度的狭窄；如果有诱发因素，动脉斑块的某个部分破裂，就会形成血栓堵塞血管。颈动脉粥样硬化与许多心脑血管疾病相关，其中与脑缺血性卒中密切相关，其引起缺血性脑卒中的机制有多种，主要为：①粥样硬化斑块不断增大，直接阻塞血管；②斑块破裂，破裂的斑块栓塞远端血管；③破裂或未破裂的斑块表面粗糙，血小板和凝血因子被激活，形成血栓，栓子脱落；④狭窄颈动脉使远端的灌注压下降，导致分水岭区供血不足，形成边缘带梗死或低灌注性梗死。

目前，防治动脉粥样硬化的药物成为研究热门，而大多数研究筛选治疗动脉粥样硬化的药物时需要建立动脉粥样硬化斑块模型。目前，建立动脉粥样硬化斑块模型主要是使用兔子作为动物模型，其制备模型的方法很多，如颈动脉外膜植入硅橡胶圈法、球囊损伤法、电刺激法、空气造模法等。其中，植入硅橡胶圈法手术创伤大、动物存活率低；电刺激法程序多、操作复杂、耗时长、可行性有待商榷；空气造模法由于没有确定的气体流量，血管内膜损伤程度差异大，而且颈动脉完全阻断的同时将不可避免地导致脑组织和血管本身急性缺血的组织学变化，人为地改变了脑血流动力学。球囊损伤法是目前使用较多的方法，但是，大多在动物的胸主动脉、腹主动脉、股动脉或颈动脉进行构建，同样存在创伤大、操作困难、动物存活率低等问题。这对于动脉粥样硬化相关研究是很大的阻碍，寻找一种新的颈动脉粥样硬化斑块动物模型造模方法，以减小动物创伤、减少其他因素影响、简化操作、提高动物存活率、提高造模成功率，对于动脉粥样硬化的研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种颈动脉粥样硬化斑块动物模型的构建方法。

本发明提供了一种颈动脉粥样硬化斑块动物模型的构建方法，它是通过耳中央动脉损伤颈总动脉动脉内膜联合高脂饲料喂养造模。

进一步地，所述高脂饲料喂养为在损伤颈总动脉动脉内膜后第一天开始喂养；

优选地，所述高脂饲料喂养为喂养8周，一日3次，每次高脂饲料量为15g/kg体重；

更优选地，所述高脂饲料喂养时室内温度和湿度恒定，饮水自由。

进一步地，所述高脂饲料为在基础饲料中加入质量分数为1％的胆固醇。

进一步地，所述动物模型使用的动物为兔子；优选为新西兰大白兔。

进一步地，所述通过耳中央动脉损伤颈总动脉动脉内膜的步骤如下：取微导管，在微导丝的引导下送入兔耳中央动脉，并在微导丝的引导下再将微导管依次通过颞浅动脉、颈外动脉，最后送至颈总动脉，再使用球囊导管扩张颈总动脉，即可。

进一步地，所述通过耳中央动脉损伤颈总动脉动脉内膜的步骤如下：

(1)穿刺针穿刺兔耳中央动脉，退出针芯同时进入针鞘；

(2)将微导丝由穿刺针针鞘进入兔耳中央动脉，退出穿刺针针鞘；

(3)将微导管在微导丝的引导下送入兔耳中央动脉，并在微导丝的引导下再将微导管依次通过颞浅动脉、颈外动脉，最后送至颈总动脉；

(4)保留微导丝退出微导管，在微导丝的引导下，将球囊导管送入颈总动脉，充盈球囊，拖动球囊导管，即可。

进一步地，

步骤(1)中，所述穿刺针为24G的穿刺针；

和/或，步骤(1)中，所述穿刺时注射肝素抗凝；

和/或，步骤(2)中，所述微导丝是直径为0.014cm的微导丝；

和/或，步骤(3)中，所述微导管为1.8F的微导管；

和/或，步骤(4)中，所述球囊导管为3.0mm*2cm的球囊导管；

和/或，步骤(4)中，所述球囊导管送入颈总动脉至颈椎4-6椎体；

和/或，步骤(4)中，所述充盈球囊为使用碘对比剂充盈球囊。

进一步地，所述充盈球囊为用碘对比剂充盈球囊三次；

优选地，每次充盈球囊至12-14KPa压力保持60s，并在保持球囊内压力来回拖动球囊导管；

更优选地，所述每次充盈球囊的间隔为60s；和/或，所述来回拖动球囊导管为每次充盈球囊后来回拖动球囊导管1次。

本发明还提供了前述的构建方法构建的模型在筛选治疗动脉粥样硬化斑块药物中的用途；

优选地，所述动脉粥样硬化斑块为颈动脉粥样硬化斑块。

本发明还提供了一种筛选治疗动脉粥样硬化斑块药物的方法，包括如下步骤：

a.按照前述的构建方法构建颈动脉粥样硬化斑块动物模型；

b.将候选物施用于a步骤所述的颈动脉粥样硬化斑块动物模型；

c.用颈动脉粥样硬化斑块动物模型评价潜在的治疗动脉粥样硬化斑块的药物；

优选地，所述动脉粥样硬化斑块为颈动脉粥样硬化斑块。

本发明成功构建了颈动脉粥样硬化斑块动物模型。该构建方法经兔耳中央动脉入路造模，创伤小、操作简便、动物存活率高、造模成功率高且其他因素影响小，克服了现有技术中构建颈动脉粥样硬化斑块动物模型存在的问题，可用于筛选治疗动脉粥样硬化斑块药物等，对于颈动脉粥样硬化的研究具有重要意义。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为经兔耳中央动脉穿刺图：A为用24G穿刺针穿刺右侧兔耳中央动脉；B为将0.014cm微导丝由穿刺针针鞘进入兔耳中央动脉；C和D为退出穿刺针针鞘，将1.8F微导管在微导丝的导引下送入兔耳中央动脉。

图2为球囊导管扩张兔颈总动脉；A为球囊导管位于右侧颈总动脉颈椎4-6椎体水平；B为用碘对比剂充盈球囊(白色箭头)，扩张右侧颈总动脉。

图3为未经造模处理的新西兰大白兔头颈部DSA成像正常血管解剖图像，①为耳中央动脉，②为颈总动脉，③为大脑中动脉，④为颌下动脉：A为左侧卧位；B为俯卧位。

图4为球囊扩张兔颈总动脉前后DSA成像：A为球囊扩张前造影，直径约2.222mm，B为球囊扩张后造影，直径约2.822mm。

图5为新西兰大白兔双侧颈总动脉DSA成像血管直径。

图6为本发明颈动脉粥样硬化斑块动物模型T1WI横轴位扫描图像：A为T1WI横轴位普通扫描图像；B为钆类对比剂注入7min后T1WI横轴位增强扫描图像。

图7为解剖造模成功的新西兰大白兔两侧颈总动脉大体观察图片。

图8为兔颈总动脉切片HE染色光镜图像：A为实验组；B为自身对照组。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1、本发明颈动脉粥样硬化斑块动物模型的构建

1、实验动物

健康雄性新西兰大白兔，每只体重(2.1±0.63kg)，兔龄(5.0±0.12)月，单笼喂养，室内温度和湿度恒定，自由饮水，昼夜各12h，由四川大学华西临床医学院动物实验中学提供。

2、构建兔颈总动脉粥样硬化斑块动物模型

2.1球囊导管损伤兔颈总动脉动脉内膜

(1)术前准备

将实验动物用高脂饲料提前喂养4周，术前禁食但不禁水12h。

(2)手术步骤

用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮，按30-40mg/kg的剂量肌肉注射进行麻醉，约5-10min后新西兰大白兔进入麻醉状态，进入麻醉状态后用电动剃毛刀将右侧兔耳背侧兔毛剃除，充分暴露兔耳中央动脉。将兔以左侧卧位固定于血管造型(Digital subtractionangiography，DSA)机手术台上，酒精进行兔耳消毒，用棉签来回摩擦兔耳中央动脉表面皮肤，力量稍重，扩张兔耳中央动脉，用24G穿刺针穿刺右侧兔耳中央动脉，穿刺后退出针芯同时进针鞘，可见鲜红血液流出，在针鞘处注射肝素抗凝(注射2mL，15单位/mL)。然后将0.014cm微导丝由穿刺针针鞘进入兔耳中央动脉，退出穿刺针鞘，然后用手术刀片于穿刺点处将皮肤稍微扩开一个小口，约2mm；将1.8F微导管在微导丝的导引下送入兔耳中央动脉，微导管既是导管亦是血管鞘，将微导丝弯头转向背侧(后背方向)，在微导丝的引导下将微导管依次通过右侧颞浅动脉、颈外动脉、颈总动脉。保留微导丝退出微导管，再将3.0mm*2cm的球囊导管送入颈总动脉(将球囊导管在微导丝的引导下送入颈总动脉)，至颈椎4-6椎体水平。用碘对比剂充盈球囊至12-14KPa压力保持60s，重复三次，每次间隔60s，并且每次保持球囊内压力来回拖动球囊导管1次，共回拖动球囊导管3次。

然后观察颈总动脉扩张(颈总动脉动脉内膜损伤)是否成功：退出球囊导管，经微导丝将微导管送至颈总动脉，微导管连接高压注射器造影，流速1ml/s，流量3ml。经造影证实颈总动脉扩张成功，取出微导管和微导丝，穿刺点压迫止血，结束介入造模过程。手术过程中的步骤如图1和图2所示。

(3)术后护理

术后肌肉注射庆大霉素3天预防感染，密切观察实验动物的精神状态，饮食和活动情况。

2.2实验动物高脂饲料饲养

经过介入手术行颈总动脉内膜损伤的实验兔，从介入手术第二天开始，使用高脂饲料(1％胆固醇+基础饲料)喂养8周，一日三次，每次饲料量15g/kg体重，饲料按照体重比例持续增加，依旧单笼喂养，室内温度和湿度恒定，饮水自由，昼夜各12h。8周后，兔颈总动脉粥样硬化斑块动物模型构建成功。

本发明进行造模的新西兰大白兔共20只，经过造模后，存活率为85％。

3、造模结果

实验中，每只经过造模的新西兰大白兔，没有经过球囊导管损伤颈总动脉动脉内膜的一侧(左侧)作为自身对照组。

3.1新西兰大白兔头颈部DSA成像血管解剖

将未经过造模处理的新西兰大白兔分别以左侧卧位和俯卧位放置在DSA手术台上，微导管管头放置在颈总动脉处，行DSA成像，获得兔头颈部DSA成像正常血管解剖图像，如图3所示。

3.2球囊扩张兔颈总动脉前后DSA成像结果

所有造模的新西兰大白兔，在球囊扩张兔颈总动脉前后，均进行DSA成像，并测量其直径，结果显示：球囊扩张兔颈总动脉前血管直径为2.28±0.2mm，球囊扩张兔颈总动脉后血管直径为2.84±0.18mm，球囊扩张兔颈总动脉后血管直径较前明显增加(P<0.01)。其中经过造模编号为18号的兔子，球囊扩张兔颈总动脉前后DSA成像直径如图4所示。

3.3球囊导管损伤颈总动脉内膜联合高脂饲料喂养后DSA成像结果

所有兔子经球囊导管损伤兔颈总动脉内膜联合高脂饲料喂养8周后，均进行DSA成像，成像时不仅观察受损伤的颈总动脉(造模成功的颈总动脉，为实验组)，还要观察自身对照组。试验结果显示：本发明实验组颈总动脉血管直径为(2.75±0.25)mm，自身对照组颈总动脉血管直径为(2.26±0.11)mm，实验组血管直径较自身对照组明显增加(P<0.01)。其中经过造模编号为15号的兔子左侧颈总动脉(自身对照组)和右侧颈总动脉(实验组)DSA成像血管直径如图5所示。

3.4 MRI检查结果

图6A为造模后的新西兰大白兔(实验组)的T1WI横轴位普通扫描图像；图6B为钆类对比剂注入7min后，T1WI横轴位增强扫描图像，结果显示实验组造模的颈总动脉血管壁增厚，注入钆类对比剂后明显强化(白色箭头所示)。而自身对照组颈总动脉血管壁未见增厚，在钆类对比剂稍微强化。

3.5大体观察

解剖造模成功的新西兰大白兔，对其两侧颈总动脉进行大体观察。观察可知：实验组颈总动脉血管壁明显增厚，僵硬无弹性，呈黄白色(图7中白色箭头所示)；自身对照组颈总动脉血管壁薄，柔软富有弹性，呈粉红色(图7中红色箭头所示)。实验组颈总动脉管径较自身对照组颈总动脉管径明显增粗，弹性明显变差。

3.6光镜观察

图8为兔颈总动脉切片HE染色光镜图像。由图8可知：实验组颈总动脉血管壁内膜(图8A)增厚且不均匀，如图8A中红色的“*”所示，管腔变窄，内皮细胞不完整排列，泡沫细胞大量聚集，平滑肌细胞大量浸润，紊乱排列；中膜增厚，泡沫细胞较多，平滑肌细胞紊乱排列。自身对照组(图8B)兔颈总动脉血管壁内膜光滑，未见增厚，未见泡沫细胞，中膜平滑肌细胞整齐排列。

上述结果说明：本发明颈动脉粥样硬化斑块动物模型构建成功。

综上，本发明成功构建了颈动脉粥样硬化斑块动物模型。该构建方法经兔耳中央动脉入路造模，创伤小、操作简便、动物存活率高、造模成功率高且其他因素影响小，克服了现有技术中构建颈动脉粥样硬化斑块动物模型存在的问题，可用于筛选治疗动脉粥样硬化斑块药物等，对于颈动脉粥样硬化的研究具有重要意义。