阅读说明：本技术 一种能够稳定发光的重组载体的构建方法 (Construction method of recombinant vector capable of stably emitting light ) 是由 雍金贵 喻明军 王维坤 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种能够稳定发光的重组载体的构建方法,包括对荧光素酶基因PCR扩增,制得荧光素酶基因PCR片段；对荧光素酶基因PCR片段进行回收,制得混合液；对混合液进行纯化,制备荧光素酶DNA片段；制备绿色荧光蛋白DNA片段,将绿色荧光蛋白DNA片段和荧光素酶DNA片段与PMD-18T载体连接,制得初级载体；将初级载体在HD5α感受态细胞中转化,挑选阳性菌落；对阳性菌落进行鉴定,获得能够稳定发光的重组载体；该重组载体的发光性稳定,用重组载体对细胞进行荧光标记后,经过细胞的不断分裂,细胞的荧光强度降低的速率小,进而保证了重组载体的发光稳定性。(The invention discloses a construction method of a recombinant vector capable of stably emitting light, which comprises the steps of carrying out PCR amplification on a luciferase gene to prepare a luciferase gene PCR fragment; recovering the luciferase gene PCR fragment to prepare a mixed solution; purifying the mixed solution to prepare luciferase DNA fragments; preparing a green fluorescent protein DNA fragment, and connecting the green fluorescent protein DNA fragment and the luciferase DNA fragment with a PMD-18T carrier to prepare a primary carrier; transforming the primary vector in HD5 alpha competent cells, and selecting a positive colony; identifying the positive bacterial colony to obtain a recombinant vector capable of stably emitting light; the luminescence of the recombinant vector is stable, and after the cells are subjected to fluorescent labeling by the recombinant vector and are continuously divided, the reduction rate of the fluorescence intensity of the cells is low, so that the luminescence stability of the recombinant vector is ensured.)

一种能够稳定发光的重组载体的构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够稳定发光的重组载体的构建方法。

背景技术

表达载体的构建是转基因技术的关键步骤，其主要过程是通过一系列酶切和连接反应将目的基因表达框与载体重组，再将重组后的载体转染宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞中的表达，发光重组载体在转染宿主细胞后，会使得宿主细胞出现荧光标记，可以使得操作者对目标细胞或蛋白质进行很好的监测，发光重组载体可以帮助学术研究者，对细菌病毒的感染方式进行研究，但传统的发光重组载体在将目的基因与载体连接的过程中，采用平末端连接法连接，平末端连接法仅适用于与限制性内切酶切割产生的平端和粘端补齐或切平形成的平端，使得重建载体的制备效率较低，传动的发光重组在对细胞进行荧光标记后，经过细胞几代分裂后，荧光强度大大降低，影响了细胞标记跟踪的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够稳定发光的重组载体的构建方法。

本发明要解决的技术问题：

传统的发光重组载体在将目的基因与载体连接的过程中，采用平末端连接法连接，平末端连接法仅适用于与限制性内切酶切割产生的平端和粘端补齐或切平形成的平端，使得重建载体的制备效率较低，传动的发光重组在对细胞进行荧光标记后，经过细胞几代分裂后，荧光强度大大降低，影响了细胞标记跟踪的效果。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种能够稳定发光的重组载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤S1：对荧光素酶基因PCR扩增，制得荧光素酶基因PCR片段；

步骤S2：对荧光素酶基因PCR片段进行回收，制得混合液；

步骤S3：将步骤S2制得的混合液进行纯化，制备荧光素酶DNA片段；

步骤S4：制备绿色荧光蛋白DNA片段，将绿色荧光蛋白DNA片段和步骤S3制得的荧光素酶DNA片段与PMD-18T载体连接，制得初级载体；

步骤S5：将步骤S4制得的初级载体在HD5α感受态细胞中转化，挑选阳性菌落；

步骤S6：对步骤S5制得的阳性菌落进行鉴定，获得能够稳定发光的重组载体。

进一步，步骤S1所述的荧光素酶基因PCR扩增的具体步骤如下：将荧光素酶基因、PCR缓冲液、dNTP mix、tap酶加入离心管中，加入双蒸馏水至50μl，将离心管置于PCR仪上，在温度为92-96℃的条件下，进行变性3-5min后，在温度92-96℃，时间40s，温度60-65℃，时间30s，温度70-75℃，时间60s的条件下，进行循环30-35次后，在温度为70-75℃的条件下，进行保温7-10min，制得荧光素酶基因PCR片段；所述的PCR缓冲液为10×PCR缓冲液，dNTPmix为2mM each，tap酶浓度为2U/μl，荧光素酶基因浓度1μg/μl。

进一步，步骤S2所述的荧光素酶基因PCR片段进行回收的具体步骤如下：将步骤S1制得的荧光素酶基因PCR片段，用琼脂糖凝胶电泳分离荧光素酶基因PCR片段，在波长为350-500nm波长的条件下，观察EB染色条带，使用刀片切出所需DNA琼脂条带，将DNA琼脂条带和结合缓冲液加入离心管中，在温度为55-60℃的条件下，进行温育8-15min，制得混合液。

进一步，步骤S3所述的混合液进行纯化的具体步骤如下：将步骤S2制得的混合液加入纯化柱中，用SPW缓冲液进行洗柱后，将纯化柱放入离心管中，在转速为10000-12000r/min的条件下，进行离心2-3min，取出纯化柱，将纯化柱放入新的离心管中，加入TE缓冲液，在转速为10000-12000r/min的条件下，进行离心1-2min，去除离心管得到纯化荧光素酶DNA片段。

进一步，步骤S4所述的初级载体制备的具体步骤如下：依照步骤S1至S3的步骤制备绿色荧光蛋白DNA片段，将步骤S3制得的荧光素酶DNA片段、绿色荧光蛋白DNA片段、PMD-18T载体、无菌水加入EP管中，在温度为45-50℃的条件下，进行退火5-7min后，降温至0℃，加入T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶、ATP，在转速为10000-12000r/min的条件下，离心5-8s后，在温度为10-12℃的条件下，培养14-16h，得到初级载体；所述的T4 DNA连接酶缓冲液为10×T4 DNA连接酶缓冲液，ATP为5mM ATP。

进一步，步骤S5所述的阳性菌落挑选的具体步骤如下：将HD5α感受态细胞加入离心管中并置于冰水域中，至HD5α感受态细胞完全化冻，将步骤S4制得的初级载体加入离心管中，静置30-40min，将离心管转移至42℃水浴中60-90s后，冰水浴静置2-3min，向离心管加入LB液体培养基混匀，在温度为35-37℃，转速为200-250r/min条件下，进行震荡培养45-60min，制得转化菌液，将转化菌液加入LB固体培养基上，在温度为35-37℃的条件下，培养14-16h，制得转化菌落，挑选阳性菌落。

进一步，步骤S6所述的阳性菌落鉴定的具体步骤如下：将步骤S6制得的阳性菌落接种至LB液体培养基中，在温度为35-37℃的条件下，培养14-16h后，得到混合菌液，将混合菌液加入EP管中，在转速为10000-12000r/min的条件下，进行离心30-40s去上清，加入重悬缓冲液重悬菌体，依次加入裂解液和中和缓冲液，颠倒EP管4-6次，在转速为12000-13000r/min的条件下，离心13-15min后，将上清液加入核酸纯化柱中，在转速为6000-6500r/min的条件下，离心1-2min弃接液管液体，加入漂洗缓冲，在转速为12000-13000r/min的条件下，离心30-60s弃接液管液体，再次离心1-2min，将核酸纯化柱放入EP管中，加入TE缓冲液，静置1-2min后，在转速为12000-13000r/min的条件下，离心1-2min，得到菌液，对菌液进行琼脂糖凝胶电泳测序，得到能够稳定发光的重组载体。

本发明的有益效果：本发明制备的一种能够稳定发光的重组载体，通过制备荧光素酶DNA片段和绿色荧光蛋白DNA片段，将荧光素酶DNA片段和绿色荧光蛋白DNA片段与PMD-18T载体连接，进而获得能够稳定发光的重组载体，本发明通过粘性末端连接法将荧光素酶DNA片段和绿色荧光蛋白DNA片段与PMD-18T载体连接，使得重组载体的制备效率提升，且该重组载体的发光性稳定，用重组载体对细胞进行荧光标记后，经过细胞的不断分裂，细胞的荧光强度降低的速率小，进而保证了重组载体的发光稳定性。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种能够稳定发光的重组载体的构建方法，具体步骤如下：

步骤S1：将荧光素酶基因、PCR缓冲液、dNTP mix、tap酶tap酶加入离心管中，加入双蒸馏水至50μl，将离心管置于PCR仪上，在温度为92℃的条件下，进行变性3min后，在温度92℃，时间40s，温度60℃，时间30s，温度70℃，时间60s的条件下，进行循环30次后，在温度为70℃的条件下，进行保温7min，制得荧光素酶基因PCR片段；

步骤S2：将步骤S1制得的荧光素酶基因PCR片段，用琼脂糖凝胶电泳分离荧光素酶基因PCR片段，在波长为350nm波长的条件下，观察EB染色条带，使用刀片切出所需DNA琼脂条带，将DNA琼脂条带和结合缓冲液加入离心管中，在温度为55℃的条件下，进行温育8min，制得混合液；

步骤S3：将步骤S2制得的混合液加入纯化柱中，用SPW缓冲液进行洗柱后，将纯化柱放入离心管中，在转速为10000r/min的条件下，进行离心2min，取出纯化柱，将纯化柱放入新的离心管中，加入TE缓冲液，在转速为10000r/min的条件下，进行离心1min，去除离心管得到纯化荧光素酶DNA片段；

步骤S4：依照步骤S1至S3的步骤制备绿色荧光蛋白DNA片段，将步骤S3制得的荧光素酶DNA片段、绿色荧光蛋白DNA片段、PMD-18T载体、无菌水加入EP管中，在温度为45℃的条件下，进行退火5min后，降温至0℃，加入T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶、ATP，在转速为10000r/min的条件下，离心5s后，在温度为10℃的条件下，培养14h，得到初级载体；

步骤S5：将HD5α感受态细胞加入离心管中并置于冰水域中，至HD5α感受态细胞完全化冻，将步骤S4制得的初级载体加入离心管中，静置30min，将离心管转移至42℃水浴中60s后，冰水浴静置2min，向离心管加入LB液体培养基混匀，在温度为35℃，转速为200r/min条件下，进行震荡培养45min，制得转化菌液，将转化菌液加入LB固体培养基上，在温度为35℃的条件下，培养14h，制得转化菌落，挑选阳性菌落；

步骤S6：将步骤S6制得的阳性菌落接种至LB液体培养基中，在温度为35℃的条件下，培养14h后，得到混合菌液，将混合菌液加入EP管中，在转速为10000r/min的条件下，进行离心30s去上清，加入重悬缓冲液重悬菌体，依次加入裂解液和中和缓冲液，颠倒EP管4次，在转速为12000r/min的条件下，离心13min后，将上清液加入核酸纯化柱中，在转速为6000r/min的条件下，离心1min弃接液管液体，加入漂洗缓冲，在转速为12000r/min的条件下，离心30s弃接液管液体，再次离心1min，将核酸纯化柱放入EP管中，加入TE缓冲液，静置1min后，在转速为12000r/min的条件下，离心1min，得到菌液，对菌液进行琼脂糖凝胶电泳测序，得到能够稳定发光的重组载体。

对比例2

一种能够稳定发光的重组载体的构建方法，具体步骤如下：

步骤S1：将荧光素酶基因、PCR缓冲液、dNTP mix、tap酶tap酶加入离心管中，加入双蒸馏水至50μl，将离心管置于PCR仪上，在温度为94℃的条件下，进行变性4min后，在温度94℃，时间40s，温度63℃，时间30s，温度73℃，时间60s的条件下，进行循环33次后，在温度为73℃的条件下，进行保温8.5min，制得荧光素酶基因PCR片段。

步骤S2：将步骤S1制得的荧光素酶基因PCR片段，用琼脂糖凝胶电泳分离荧光素酶基因PCR片段，在波长为425nm波长的条件下，观察EB染色条带，使用刀片切出所需DNA琼脂条带，将DNA琼脂条带和结合缓冲液加入离心管中，在温度为57℃的条件下，进行温育12min，制得混合液。

步骤S3：将步骤S2制得的混合液加入纯化柱中，用SPW缓冲液进行洗柱后，将纯化柱放入离心管中，在转速为11000r/min的条件下，进行离心2.5min，取出纯化柱，将纯化柱放入新的离心管中，加入TE缓冲液，在转速为11000r/min的条件下，进行离心1.5min，去除离心管得到纯化荧光素酶DNA片段。

步骤S4：依照步骤S1至S3的步骤制备绿色荧光蛋白DNA片段，将步骤S3制得的荧光素酶DNA片段、绿色荧光蛋白DNA片段、PMD-18T载体、无菌水加入EP管中，在温度为47℃的条件下，进行退火6min后，降温至0℃，加入T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶、ATP，在转速为10000-12000r/min的条件下，离心7s后，在温度为11℃的条件下，培养15h，得到初级载体。

步骤S5：将HD5α感受态细胞加入离心管中并置于冰水域中，至HD5α感受态细胞完全化冻，将步骤S4制得的初级载体加入离心管中，静置35min，将离心管转移至42℃水浴中75s后，冰水浴静置2.5min，向离心管加入LB液体培养基混匀，在温度为36℃，转速为220r/min条件下，进行震荡培养50min，制得转化菌液，将转化菌液加入LB固体培养基上，在温度为36℃的条件下，培养15h，制得转化菌落，挑选阳性菌落。

步骤S6：将步骤S6制得的阳性菌落接种至LB液体培养基中，在温度为36℃的条件下，培养15h后，得到混合菌液，将混合菌液加入EP管中，在转速为11000r/min的条件下，进行离心35s去上清，加入重悬缓冲液重悬菌体，依次加入裂解液和中和缓冲液，颠倒EP管5次，在转速为12500r/min的条件下，离心14min后，将上清液加入核酸纯化柱中，在转速为6300r/min的条件下，离心1.5min弃接液管液体，加入漂洗缓冲，在转速为125000r/min的条件下，离心45s弃接液管液体，再次离心1.5min，将核酸纯化柱放入EP管中，加入TE缓冲液，静置1.5min后，在转速为12500r/min的条件下，离心1.5min，得到菌液，对菌液进行琼脂糖凝胶电泳测序，得到能够稳定发光的重组载体。

实施例3

一种能够稳定发光的重组载体的构建方法，具体步骤如下：

步骤S1：将荧光素酶基因、PCR缓冲液、dNTP mix、tap酶tap酶加入离心管中，加入双蒸馏水至50μl，将离心管置于PCR仪上，在温度为96℃的条件下，进行变性5min后，在温度96℃，时间40s，温度65℃，时间30s，温度75℃，时间60s的条件下，进行循环35次后，在温度为75℃的条件下，进行保温10min，制得荧光素酶基因PCR片段；

步骤S2：将步骤S1制得的荧光素酶基因PCR片段，用琼脂糖凝胶电泳分离荧光素酶基因PCR片段，在波长为500nm波长的条件下，观察EB染色条带，使用刀片切出所需DNA琼脂条带，将DNA琼脂条带和结合缓冲液加入离心管中，在温度为60℃的条件下，进行温育15min，制得混合液；

步骤S3：将步骤S2制得的混合液加入纯化柱中，用SPW缓冲液进行洗柱后，将纯化柱放入离心管中，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2-3min，取出纯化柱，将纯化柱放入新的离心管中，加入TE缓冲液，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min，去除离心管得到纯化荧光素酶DNA片段；

步骤S4：依照步骤S1至S3的步骤制备绿色荧光蛋白DNA片段，将步骤S3制得的荧光素酶DNA片段、绿色荧光蛋白DNA片段、PMD-18T载体、无菌水加入EP管中，在温度为50℃的条件下，进行退火7min后，降温至0℃，加入T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶、ATP，在转速为12000r/min的条件下，离心8s后，在温度为12℃的条件下，培养16h，得到初级载体；

步骤S5：将HD5α感受态细胞加入离心管中并置于冰水域中，至HD5α感受态细胞完全化冻，将步骤S4制得的初级载体加入离心管中，静置40min，将离心管转移至42℃水浴中90s后，冰水浴静置3min，向离心管加入LB液体培养基混匀，在温度为37℃，转速为250r/min条件下，进行震荡培养60min，制得转化菌液，将转化菌液加入LB固体培养基上，在温度为37℃的条件下，培养16h，制得转化菌落，挑选阳性菌落；

步骤S6：将步骤S6制得的阳性菌落接种至LB液体培养基中，在温度为37℃的条件下，培养16h后，得到混合菌液，将混合菌液加入EP管中，在转速为12000r/min的条件下，进行离心40s去上清，加入重悬缓冲液重悬菌体，依次加入裂解液和中和缓冲液，颠倒EP管6次，在转速为13000r/min的条件下，离心15min后，将上清液加入核酸纯化柱中，在转速为6500r/min的条件下，离心1min弃接液管液体，加入漂洗缓冲，在转速为13000r/min的条件下，离心60s弃接液管液体，再次离心2min，将核酸纯化柱放入EP管中，加入TE缓冲液，静置2min后，在转速13000r/min的条件下，离心2min，得到菌液，对菌液进行琼脂糖凝胶电泳测序，得到能够稳定发光的重组载体。

对比例1

本对比例为市场上常见的一种发光载体。

将实施例1-3制备的重组载体和对比例1的发光载体，分别转入大肠杆菌中，并设置未载体转入的大肠杆菌作为空白对照，对大肠杆菌是否发光进行检测，检测结果如下表1；

表1

由上表1可知实施例1-3制备的重组载体对大肠杆菌进行荧光标记后，在6-7天后荧光标记才会消失，而实施例1的发光载体，在对大肠杆菌进行荧光标记3天后荧光标记就会消失，因此本发明制备的重组载体的发光性更为稳定。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。