阅读说明：本技术 使用合成气的多级合成方法 (Multi-stage synthesis process using synthesis gas ) 是由 T.哈斯 E.M.维特曼 于 2013-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及使用合成气的多级合成方法。具体地,本发明提供了一种制备烃的方法,所述烃被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代,所述方法包括以下方法步骤：A)使包含至少一种选自CO<Sub>2</Sub>和CO的物质的碳源与第一种微生物反应,以产生乙酸盐和/或乙醇,B)从所述第一种微生物分离出所述乙酸盐,C)使所述乙酸盐与第二种微生物反应,以产生被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代的烃,和任选地D)纯化所述被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代的烃。(The present invention relates to a multistage synthesis process using synthesis gas. In particular, the present invention provides a process for the preparation of a hydrocarbon substituted with at least one group containing at least one oxygen atom, comprising the process steps of: A) so as to contain at least one selected from CO 2 And CO, B) separating the acetate salt from the first microorganism, C) reacting the acetate salt with a second microorganism to produce a hydrocarbon substituted with at least one group containing at least one oxygen atom, and optionally D) purifying the hydrocarbon substituted with at least one group containing at least one oxygen atom.)

使用合成气的多级合成方法

本专利申请是申请号为201380024696.5，申请日为2013年5月8日，同题的母案专利申请的分案申请。

技术领域

本发明的主题是制备烃的方法，所述烃被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代，所述方法包括以下方法步骤：

A) 用第一种微生物将碳源转化成乙酸盐和/或乙醇，所述碳源包含选自CO₂和CO的至少一种，

B) 将所述第一种微生物与所述乙酸盐和/或乙醇分离，

C) 用第二种微生物将所述乙酸盐和/或乙醇转化成烃，所述烃被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代，和任选地

D) 纯化所述被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代的烃。

背景技术

在文献中经常描述CO₂作为碳源在以微生物方法合成有机化合物中的用途。

通常，在现有技术中尝试在重组细胞中构建得自不同生物体的2个互补代谢途径，然后可以在其帮助下合成有机物质。

在这里产生的问题是，意在将其性能组合在一起的不同生物体是生态位中非常高特异性化的生物，且因此难以将与其有关的所有优点的总和合并在一个细胞中。另外，这些生物体的遗传可达性的缺乏会给所希望的操作造成困难。

使用CO₂作为碳源的替代方法通过发酵参数的某种选择影响已知能够固定CO₂的微生物，使得所述微生物增加合成所希望的、简单的有机物质，例如，乙醇、正丁醇或2,3-丁二醇。

WO200068407描述了产乙酸细菌在乙醇制备中的用途，WO2012024522描述了产乙酸细菌在丁二醇制备中的用途。

所有描述的方法具有以下缺点：收率低，并且单一细胞类型的使用不能实现发酵条件下的灵活性。

本发明的目的是，提供能够克服现有技术的至少一种缺点的方法。

发明内容

已经令人惊奇地发现，下面描述的具有将乙酸盐-继续加工的乙酸盐-产物与CO₂和/或CO分离的多级方法能够以最简单的方式克服现有技术的缺点。

因此，本发明提供了如权利要求1和其它独立权利要求中描述的方法。

本发明的一个优点是，CO₂/CO混合物是基本上更有利的原料，其此外可以由多种来源，诸如天然气和生物气、煤、油、以及植物残余物制备。

本发明的方法的另一个优点是高碳收率。这可通过返回所形成的CO₂实现。因为，CO₂可以在第一级中再次转化成乙酸。

另一个优点在于，在使用的发酵条件方面的更大的灵活性，因为对于根据本发明的方法步骤C)中的实际生产而言，在乙酸盐加工中使用的生物不同于用于碳固定的生物。

本发明的再一个优点是，与在方法步骤C)中使用糖相比，通过在方法步骤C)中使用乙酸盐和/或乙醇、特别是乙酸盐作为碳源，可以产生不同的产物组合物。

本发明提供了一种制备烃的方法，所述烃被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代，所述方法包括以下方法步骤：

A) 用第一种微生物将碳源转化成乙酸盐和/或乙醇，尤其是乙酸盐，所述碳源包含选自CO₂和CO的至少一种，

B) 将所述第一种微生物与所述乙酸盐和/或乙醇分离，尤其是乙酸盐，

C) 用第二种微生物将所述乙酸盐和/或乙醇，尤其是乙酸盐，转化成烃，所述烃被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代，和任选地

D) 纯化所述烃，其被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代，优选具有至少3个、尤其是至少4个碳原子。

在本发明的上下文中，术语“乙酸盐”应当理解为是指乙酸以及它的盐；这是必然得出的，因为微生物在水性介质中工作，并因此总是存在盐和酸之间的平衡。

在本发明的上下文中，术语“第二种微生物”应当理解为是指与得自方法步骤A)的“第一种微生物”不同的微生物。

除非另外说明，所有给出的百分比(%)都是质量百分比。

在根据本发明的方法中，在方法步骤A)中，第一种微生物由包含二氧化碳和/或一氧化碳的碳源形成乙酸盐和/或乙醇；该表述包含乙酸盐和/或乙醇至少部分地由二氧化碳和/或一氧化碳形成。

关于底物二氧化碳和/或一氧化碳的来源，显而易见，存在许多可能的来源用于提供CO和/或CO₂作为碳源。显然，在实践中，可以使用能够给微生物供应足量的碳以使它们能形成乙酸盐和/或乙醇的任何气体或任何气体混合物均可用作本发明的碳源。

在根据本发明的方法中，优选的是，通过废气例如合成气、烟道气、炼油厂废气，通过酵母发酵或梭菌发酵形成的气体，由含纤维素的材料的气化或碳气化产生的废气提供所述碳源。

在这方面，特别优选的是，至少部分二氧化碳和/或一氧化碳是根据本发明的方法的方法步骤C)的副产物。这具有以下技术效果：整个方法的碳收率是100%。

这些废气不必必然作为其他工艺的副产物（Nebenerscheinung）而产生，而是可以用在根据本发明的方法中而专门生产。

在根据本发明的方法的一个优选的实施方案中，所述碳源是合成气。

合成气可以例如由碳气化的副产物提供。因此，该微生物将作为废物产物的物质转化成有价值的原料。

可替换地，合成气可以通过气化广泛可提供的、价格便宜的农业原料提供给根据本发明的方法。

可以被转化成合成气的原料存在众多例子，因为几乎所有形式的植物都可以用于该目的。优选的原料选自多年生的草诸如中国芦苇（Chinaschilf），谷类残余物，加工废物诸如锯屑。

一般而言，合成气在气化设备中由干燥的生物质制得，主要通过热解、部分氧化和蒸汽重整，由此主要产物是CO、H₂和CO₂。

通常，预加工部分产物气体，以优化产物收率和避免焦油形成。可使用石灰和/或白云石将不希望的焦油裂化成合成气和CO。这些方法详细地描述在例如Reed, 1981(Reed, T.B., 1981, Biomass gasification: principles and technology, NovesData Corporation, Park Ridge, NJ.)中。

也可能使用不同来源的混合物作为碳源。

一般而言，在根据本发明的方法中优选的是，在方法步骤A)中的碳源包含至少50重量%、优选地至少70重量%、特别优选地至少90重量%的CO₂和/或CO，其中重量%基于在方法步骤A)中微生物可利用的所有碳源计。

在方法步骤A)中，优选地与二氧化碳和/或一氧化碳一起向反应输送还原剂，优选氢。

因此，根据本发明优选的方法的特征在于，在方法步骤A)中的碳源包含合成气，尤其是由合成气组成。

长久以来已知将CO₂和/或CO转化成乙酸盐和/或乙醇、尤其是乙酸盐的微生物，以及在方法步骤A)中可以使用的合适方法和工艺条件。这样的方法描述在例如以下文献中：

WO9800558，WO2000014052，WO2010115054

Demler等人. Reaction engineering analysis of hydrogenotrophic production of acetic acid by Acetobacterium woodii. Biotechnol Bioeng. 2011年2月; 108(2): 470-4,

Younesia等人. Ethanol and acetate production from synthesis gas via fermentation processes using anaerobic bacterium, Clostridium ljungdahlii. Biochemical Engineering Journal, 第27卷, 第2期, 第110-119页,

Morinaga等人. The production of acetic acid from carbon dioxide and hydrogen by an anaerobic bacterium.Journal of Biotechnology, 第14卷, 第2期,第187-194页,

Li Production of acetic acid from synthesis gas with mixed acetogenic microorganisms, ISSN 0493644938,

Schmidt等人. Production of acetic acid from hydrogen and carbon dioxide by clostridium species ATCC 2979. Chemical Engineering Communications, 45:1-6, 61-73,

Sim等人. Optimization of acetic acid production from synthesis gas by chemolithotrophic bacterium - Clostridium aceticum using a statistical approach. Bioresour Technol. 2008 May; 99(8):2724-35,

Vega等人. Study of gaseous substrate fermentations CO conversion to acetate 1 Batch culture and 2 continuous culture. Biotechnology andBioengineering 第34卷, 第6期, 第774和785页, 1989年9月,

Cotter等人. Ethanol and acetate production by Clostridium ljungdahlii andClostridium autoethanogenumusing resting cells. Bioprocess and BiosystemsEngineering (2009), 32(3), 369-380，和

Andreesen等人. Fermentation of glucose, fructose, and xylose by Clostridium thermoaceticum. Effect of metals on growth yield, enzymes, and the synthesis of acetate from carbon dioxide. Journal of Bacteriology (1973),114(2), 743-51。

由此给本领域技术人员提供了大量用于设计方法步骤A)的可行的可能性，它们都良好地起作用。

在这方面，特别适合的是产乙酸细菌。产乙酸细菌群体属于厌氧性的原核生物，其可以利用CO₂作为末端电子受体，并在该过程中形成乙酸盐和/或乙醇。目前，在产乙酸菌中包括21个不同属(Drake等人, 2006)，其中一些也是梭状芽胞杆菌(Drake和Küsel, 2005)。它们能够利用二氧化碳或者一氧化碳作为碳源，并利用氢作为能源(Wood, 1991)。另外，醇、醛、羧酸和众多己糖也可以用作碳源(Drake等人, 2004)。导致乙酸盐形成的还原代谢途径被称作乙酰辅酶A途径或Wood-Ljungdahl途径。

因此，优选的是，在根据本发明的方法的方法步骤A)中，使用产乙酸细菌作为第一种微生物。特别优选的是，使用选自以下的产乙酸细菌：Clostridium autothenogenum DSMZ 19630、拉氏梭菌（Clostridium ragsdahlei）ATCC no. BAA-622、产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）、穆尔氏菌属（Moorella sp）HUC22-1、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoaceticum）、热自养穆尔氏菌（Moorella thermoautotrophica）、Rumicoccus productus、Acetoanaerobum、普氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii）、巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）、噬乙酸甲烷八叠球菌（Methanosarcina acetivorans）、氧化碳嗜热菌属（Carboxydothermus）、Desulphotomaculum kutznetsovii、热球菌属（Pyrococcus）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）ATCC 33266、蚁酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum）、酪酸梭菌（Clostridium butyricum）、Laktobacillus delbrukii、Propionibacterium acidoprprionici、Proprionispera arboris、Anaerobierspirillum succiniproducens、Bacterioides amylophilus、Becterioides ruminicola、凯伍热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter kivui）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、潮湿厌氧醋酸菌（Acetoanaerobium notera）、醋酸梭菌（Clostridium aceticum）、食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica）、产粘真杆菌（Eubacterium limosum）、产生消化链球菌（Peptostreptococcus productus）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）、梭菌属（Clostridium）ATCC 29797和食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans），尤其是ATCC BAA-624。一种特别合适的细菌是食一氧化碳梭菌，尤其是诸如“P7”和“P11”等菌株。这样的细胞描述在例如US 2007/0275447和US2008/0057554中。

另外的特别合适的细菌是扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii），尤其是选自扬氏梭菌PETC、扬氏梭菌ERI2、扬氏梭菌C0l和扬氏梭菌O-52的菌株，这些描述在WO 98/00558和WO 00/68407中，以及ATCC 49587、ATCC 55988和ATCC 55989。

在根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案中，在方法步骤A)中，形成乙醇，且使用的微生物是Alkalibaculum bacchi ATCC BAA-1772、穆尔氏菌属HUC22-1、扬氏梭菌、拉氏梭菌或产乙醇梭菌。关于实施方法步骤A)的相应指导可以参见例如：

Saxena等人. Effect of trace metals on ethanol production from synthesis gas by the ethanologenic acetogen Clostridium ragsdalei. Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology Volume 38, Number 4 (2011), 513-521,

Younesi等人. Ethanol and acetate production from synthesis gas via fermentation processes using anaerobic bacterium Clostridium ljungdahlii.Biochemical Engineering Journal Volume 27, Issue 2, 2005年12月15日, 第110-119页,

Sakai等人. Ethanol production from H2 and CO2 by a newly isolated thermophilic bacterium, Moorella sp. HUC22-1.Biotechnology Letters Volume 26,Number 20 (2004), 1607-1612，和

Abrini等人. Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Archives of Microbiology Volume161, Number 4 (1994), 345-351。

方法步骤A)优选地在厌氧条件下进行。

在根据本发明的方法的方法步骤B)中，将在方法步骤A)中形成的乙酸盐和/或乙醇，尤其是乙酸盐与所述第一种微生物分离。

在最简单的情况中，例如通过已知方法诸如沉降、离心或过滤，将微生物作为固体从包含乙酸盐和/或乙醇、尤其是乙酸盐的培养基中除去，并任选地将剩余的液相直接供入方法步骤C)。所述直接供入具有以下优点：得自方法步骤A)的还另外包含的培养基组分（例如，维生素、痕量元素或诱导物）在方法步骤C)中同样供第二种微生物利用，并因此是优选的。在这方面，在供入到方法步骤C)之前，提高乙酸盐和/或乙醇、尤其是乙酸盐的浓度（例如通过除去至少一部分存在的水）可能是有利的且因此是优选的。

同样地，借助于萃取，尤其是借助于原位萃取，可以由方法步骤A)中的微生物除去乙酸盐本身。合适的萃取方法是本领域技术人员已知的，因而例如得自：EP2294206,WO2000014052, US 4405717, Katikaneni等人. Purification of Fermentation- Derived Acetic Acid By Liquid-Liquid Extraction and Esterification. Ind. Eng.Chem. Res. 2002, 41, 2745-2752, 和Huh等人. Selective extraction of acetic acid from the fermentation broth produced by Mannheimia succiniciproducens.Biotechnol Lett. 2004 Oct; 26(20):1581-4。

合适的萃取剂描述在例如WO2000014052的第8-17页的第A点The modified solvent and solvent/co-solvent mixture（改进的溶剂和溶剂/共溶剂混合物）下面。

在通过萃取分离乙酸盐的情况中，优选包含特别是烷基胺或低沸点溶剂诸如MTBE或乙酸乙酯作为萃取剂，其中所述烷基胺优选是具有至少16个碳原子的那些，优选是三烷基胺，且特别优选是选自三己胺、三辛胺（Trioctylamin）、三癸胺、三辛基胺（Tricaprylamin）、三-十二烷基胺的三烷基胺。这些包含三烷基胺的萃取剂优选地与原位萃取结合用在方法步骤B)中。这具有第一种微生物不受损伤的技术效果和可以在反向流方法中进行方法步骤B)的额外优点，这是另外优选的。

作为在方法步骤B)中使用的萃取剂尤其使用三辛胺和2-乙基-1-己醇的混合物，在此这些优选地以相同量使用。

关于详细的方法说明，可以参考EP2294206和那里描述的方法步骤A)和B)。

在方法步骤C)中，用第二种微生物将所述乙酸盐和/或乙醇、尤其是乙酸盐转化成烃，所述烃被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代。

所述被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代的烃优选是羧酸、二羧酸、羟基羧酸、羧酸酯、羟基羧酸酯、醇、醛、酮，其尤其具有4-32个、优选6-20个、特别优选8-12个碳原子。特别优选的是羧酸、羟基羧酸和羧酸酯。

所述第二种微生物优选是酵母或细菌。

所述第二种微生物优选是遗传修饰的菌株，其尤其已经在遗传上优化了被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代的烃的收率。

本领域技术人员由现有技术知晓适合用于各自的靶分子的第二种微生物和要使用的工艺条件。

如，

WO2011127409、WO2009111672和WO2010062480描述了合适的第二种微生物和用于制备脂肪醇的方法，

WO2012017083描述了脂肪酸乙酯的制备，

WO2011157848、WO2011059745、WO 2009140695、WO2007106903和WO2009124694描述了脂肪酸的制备，

WO2010126891描述了醇、脂肪酸和脂肪酸酯的制备，

WO2010118410、WO2010021711和WO2010022090描述了脂肪酸酯的制备、

WO2010042664和WO 2009140695描述了脂肪酸醛的制备，

WO2012038390、WO2007077568和WO2011153317描述了二羧酸的制备，和

WO2011008232、WO 2009156214、WO2007141208、WO2004003213、GB2473755和EP11191923.9描述了羟基羧酸的制备。

在根据本发明的方法的一种优选替代方法中，所述被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代的烃是脂肪酸，尤其是具有4-32个、优选6-20个、特别优选8-12个碳原子的直链饱和脂肪酸。在这种情况中，所述第二种微生物具体地是这样的微生物：其与它的野生型相比具有增加的至少一种硫酯酶的活性。术语“与它的野生型相比增加的活性”应当理解为是指：所述微生物已经经过遗传修饰，使得它具有该增加的活性。优选地，这被理解为是指硫酯酶的过表达或外源硫酯酶的表达。在这方面优选的硫酯酶选自酰基-ACP-硫酯酶，优选EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.22或酰基辅酶A-硫酯酶，优选EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22。在根据本发明的替代方法中使用的优选的第二种微生物公开于WO2010118410、WO2010075483、WO2008119082和WO2007136762中，明确地参考这些文件中关于这些微生物和关于这些硫酯酶的公开内容。

在根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案中，所述脂肪酸是辛酸和/或癸酸，且所述硫酯酶是得自萼距花（Cuphea hookeriana）的fatB2的基因产物。

在根据本发明的方法的一种优选替代方法中，所述被至少一个含有至少一个氧原子的基团取代的烃是羟基羧酸、尤其是ω-羟基羧酸，或羟基异丁酸、尤其是3-羟基异丁酸。在涉及羟基异丁酸的情况中，所述第二种微生物尤其是在WO2009156214、WO2007141208、WO2009135074和EP11191923.9中公开的微生物，明确地参考这些文件中关于这方面的公开内容。在涉及ω-羟基羧酸的情况中，所述第二种微生物尤其是在WO2011008232中公开的微生物，明确地参考该文件中关于这方面的公开内容。

根据本发明优选的是，将在方法步骤C)中产生的二氧化碳返回至方法步骤A)中的方法中，并因此用作碳源。这具有碳收率为100%的技术效果。

下面列出的实施例示例性描述本发明，没有任何意图将由整个说明书和权利要求书中给出的本发明、其应用范围限制于在实施例中提及的实施方式。

附图说明

下述附图是实施例的组成部分：

图1：在大肠杆菌（E. coli）中由乙酸盐生产脂肪酸，所述乙酸盐由微生物由合成气制备。

具体实施方式

实施例

实施例1: 方法步骤A)乙酸盐和乙醇形成

将食一氧化碳梭菌DSMZ 15243的活培养物装入1 l厌氧瓶中，每瓶含有200 ml根据Hurst由1 g酵母浸出物、19 g MES、30 ml矿物盐溶液、10 ml痕量元素溶液、10 ml维生素溶液在1 l双蒸馏水中组成的改良PETC培养基。用0.5 M NaOH将pH调至pH 5.9。每升矿物盐溶液由80 g氯化钠、100 g氯化铵、10 g氯化钾、10 g磷酸氢二钾、20 g硫酸镁、4 g氯化钙组成。每升维生素溶液由0.01 g吡多辛、0.005 g硫胺素、0.005 g核黄素、0.005 g泛酸钙、0.005 g硫辛酸、0.005 g (对)氨基苯甲酸、0.005 g烟酸、0.005 g维生素B12、0.002 g生物素、0.002 g叶酸、0.01 g美司钠组成。每升痕量元素溶液由2 g次氮基乙酸、1 g硫酸锰、0.8g硫酸铁铵、0.2 g氯化钴、0.2 g硫酸锌、0.02 g氯化铜(II)、0.02 g氯化镍、0.02 g钼酸钠、0.02 g硒酸钠、0.02 g钨酸钠组成。

将培养基煮沸20 min，然后用纯氮气通气20 min。然后将它在121℃高压灭菌20分钟。冷却后，将培养基用50%CO、45%H2和5%CO₂的气体混合物供气3次，直到1巴的过压。然后将压力调至0.8巴的过压。在即将接种之前，在无菌厌氧条件下，在每种情况下加入1.5 ml的4%的亚硫酸钠/半胱氨酸盐酸盐溶液作为还原剂。

将培养物在100 upm(5 cm离心率)下在37℃培养。在每种情况下，在72小时以后，通过接种将培养物转移至新培养基。

由这样的48 h龄培养物取出用于产物制备的接种物。

为此，给2 l搅拌容器（得自Infors HT的Labfos 2）装入900 ml上述的改良PETC培养基（不包括美司钠，不含维生素溶液），并用氮气通气20分钟。然后将容器在121℃高压灭菌20分钟。然后在无菌厌氧条件下加入维生素溶液。

在整个发酵过程中，用0.5 M NaOH和0.5 M HCl将pH调在5.9。

使用得自Westphal Mess- und Regeltechnik的WMR 4000气体混合站，将气体混合物调至80%CO和20%CO₂。恒定地以5 l/h进行通气。

将搅拌器速度设定在恒定的400 rpm，其相当于0.2 W/l的功率输入。

在即将接种之前，在无菌厌氧条件下，在每种情况下加入7.5 ml的4%的亚硫酸钠/半胱氨酸盐酸盐溶液作为还原剂。

接种物为10%，并且同样在无菌厌氧条件下在气化开始以后30分钟加入。起始OD₆₀₀为0.055。

在0/14.4/16.8/20.8/24.2/38.7 h以后，使用注射器经由立管抽出3 ml样品。

通过高效液相色谱法(HPLC)，确定乙酸、乙醇、丁酸和丁醇的浓度。使用柱AminexHPX-87H作为固定相。使用的洗脱液是5 mM硫酸，恒定流速为0.6 ml/min。柱的温度为40℃。借助于折射率检测器进行乙醇和丁醇的检测，并使用二极管阵列检测器在210 nm的波长下检测乙酸和丁酸。借助确定浓度的校准直线，经由峰面积确定物质浓度。

38.7小时以后，测得0 mM丁醇、1.42 mM丁酸盐、3.33 mM乙醇和54.26 mM乙酸盐。这相当于91.95%的乙酸盐比例。

实施例2: 方法步骤B)乙酸盐分离

分离细胞以后，通过加入乙酸，将发酵液的pH降至低于3.0的pH。然后将三正辛基胺在1-辛醇中的溶液（比率为1:1）加入发酵液中，并在25℃在至少1000 rpm的搅拌器速度下与发酵液一起混合最多2小时。随后通过离心进行相分离。然后在120℃和500毫巴的过压下由有机相中蒸馏出乙酸。通过HPLC确定馏出液的乙酸含量，并将该溶液以对应的浓度用在进一步发酵中(参见实施例3和4和6)。

实施例3：在重组大肠杆菌中将乙酸盐转化成C8和C10脂肪酸

用接种针将大肠杆菌菌株JW5020-1 (ΔfadE)（可得自Yale CGSC, The Coli GeneticStock Center）由冷冻培养物划线到LB琼脂平板（pH 7）上，所述LB琼脂平板由5 g酵母浸出物、10 g蛋白胨、0.5 g氯化钠和15 g琼脂组成。用接种针将大肠杆菌菌株JW5020-1 (ΔfadE) pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc]由冷冻培养物划线到LB平板上，所述LB平板另外包含100 mg/ml氨苄西林。将平板在37℃温育过夜。

用得自萼距花的基因fatB2的表达载体转化大肠杆菌菌株JW5020-1 (ΔfadE)pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc]。为了生产前述载体，对在大肠杆菌中用于该表达的基因进行密码子优化。将该基因与tac启动子一起合成，并且同时***在启动子上游的限制位点和在终止子下游的限制位点。将合成的DNA片段P_tac-ChFatB2 (SEQ ID NO. 1)用限制性内切核酸酶BamHI和NotI消化，并连接进对应地切割的载体pJ294 (DNA2.0 Inc., Menlo Park,CA, USA)中。完成的大肠杆菌表达载体被称作pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc] (SEQ ID NO.2)。

预培养1：将两种培养物分别转移接种在位于100 ml带挡板的摇瓶中的10 ml M9mod-G液体培养基中。所述M9 mod-G培养基由溶解在800 ml M9缓冲液和150 ml ddH₂O中的2.6 g/l (NH₄)₂SO₄、0.49 g/l MgSO₄+7H₂O、20 g/l葡萄糖、1 ml/l痕量元素US3组成。所述M9缓冲液由溶解在800 ml ddH₂O中的6.79 g/l Na₂HPO₂+2H₂O、3 g/l KH₂PO₄、0.5 g/l NaCl、2g/l NH₄Cl组成。对于携带质粒的菌株，将100µg/ml氨苄西林加入培养基中。

在每种情况下，使用接种针将一满环的细胞材料从平板转移至相应的液体培养基中。

将培养物在37℃和200 rpm温育过夜。

20小时以后，OD为：

大肠杆菌JW5020-1 (ΔfadE) 10.6

大肠杆菌JW5020-1 (ΔfadE) pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc] 12.8。

预培养2

将得自预培养1的0.5 ml转移接种在位于100 ml带挡板的摇瓶中的20 ml M9，mod-G中。所述M9，mod-G培养基由溶解在800 ml M9缓冲液和170 ml ddH₂O中的2.6 g/l (NH₄)₂SO₄、0.49 g/l MgSO₄+7H₂O、60 mM醋酸钠(得自实施例2)、1 ml/l痕量元素US3组成。对于携带质粒的菌株的培养，加入100µg/ml氨苄西林。

将培养物在37℃和200 rpm温育过夜。

预培养2的OD为

大肠杆菌JW5020-1 (ΔfadE)/乙酸盐 2.5

大肠杆菌JW5020-1 (ΔfadE) pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc]/乙酸盐 1.75

给1000 ml带挡板的摇瓶中的100 ml改良的M9液体培养基（含有60 mM乙酸盐/菌株）接种所述预培养物，由此得到0.2的OD。

在37℃和225 rpm下温育该培养物。

在约0.5的OD₆₀₀下，用1 mM IPTG（得自1M IPTG的原液）进行诱导。

为取样，在每种情况下，无菌取出4 ml细胞混悬液，确定OD，并将剩余的混悬液在15 ml falcon试管中在-80℃储存，直到对样品进行后处理。

脂肪酸的定量在衍生化为脂肪酸甲酯后借助于气相色谱法进行。在加入1 ml丙酮和2 ml水之后，将50µl十七烷酸(10 g/l，溶解在乙醇中)作为内部参比物加入由2 ml培养液组成的样品中。将样品用200µl乙酸酸化，并与10 ml的1:1 (v/v)氯仿/甲醇混合物混合。将样品剧烈混合至少1 min。然后将氯仿相取出和蒸发。将干燥的残余物溶解于1 ml的1.25M盐酸的甲醇溶液中，并在50℃温育过夜，以酯化所含脂肪酸。通过加入5 ml饱和碳酸钠溶液停止反应(所有物质得自Sigma-Aldrich, Steinheim)。通过加入1 ml正庚烷并剧烈混合15秒，萃取脂肪酸甲酯。借助于气相色谱法测量将庚烷相。为了分离脂肪酸甲酯，使用毛细管柱SP^TM-2560 (Supelco, Sigma-Aldrich, Steinheim)作为固定相，所述SP^TM-2560具有100 m x 0.25 mm的尺寸和0.2µm的膜厚度。使用的载体气体为氦气。历时45 min进行分离，在开始时为260℃的注射器温度、260℃的检测器温度和140℃的柱温度，保持5 min，并以4℃/min的速率增加至240℃并保持15 min。注射体积为1µl，***率为1:20，载体气体的流通量为1 ml/min。借助于火焰离子化检测器(GC Perkin Elmer Clarus 500, Perkin Elmer,Rodgau)进行检测。使用十七烷酸(Sigma-Aldrich, Steinheim)作为用于定量脂肪酸甲酯的内部参比物。将参比物C8:0-Me辛酸甲酯、C10:0-Me癸酸甲酯、C12:0-Me月桂酸甲酯、C14:0-Me肉豆蔻酸甲酯、C16:0-Me棕榈酸甲酯、C16:1-Me棕榈油酸甲酯、C18:0-Me硬脂酸甲酯、C18:1-Me油酸甲酯(GLC Standard Mix GLC-20 1892-1AMP, GLC-30 1893-1AMP, GLC-501894-1AMP, Sigma-Aldrich, Steinheim)用于校准。所有脂肪酸甲酯的测定限度是10 mg/l的浓度。

96小时以后，大肠杆菌JW5020-1 (ΔfadE) pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc]的脂肪酸浓度的分布表现出标准化至1的OD，如在图1中所示。

实施例4：用解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）H222-41Δ3HIBDH (ura)-8将 乙酸盐转化成3-羟基异丁酸(3-HIB)

根据EP 11191923.9的实施例1，第1-3点，合成了具有减弱的3-羟基异丁酸脱氢酶活性的解脂耶氏酵母细胞H222-41；该细胞在下文中被称作H222-41Δ3HIBDH (ura)-8。

与对应的野生型H222-41 (ura)-8相比，培养H222-41Δ3HIBDH (ura)-8。

培养

将两种菌株用接种针由冷冻培养物无菌划线到YEPD琼脂平板上。所述YEPD琼脂平板由10 g葡萄糖、10 g酵母浸出物、20 g蛋白胨和15 g琼脂组成。pH是5.4。在25℃温育80小时。

预培养(生物质生产)

给6个1000 ml无挡板的摇瓶装入100 ml由葡萄糖、10 g酵母浸出物、20 g蛋白胨组成的YEPD液体培养基（pH 5.4）。向每个摇瓶中加入3滴Delmex消泡剂。

每种菌株各接种转移3个摇瓶，在每种情况下，用接种针无菌接种转移2满环的对应的YEPD琼脂平板的细胞材料。在28℃和180 rpm(振幅2.5 cm)下，将摇瓶温育20小时。

用于乙酸盐培养的接种物的制备

20小时以后，将3个含有解脂耶氏酵母H222-41Δ3HIBDH (ura)-8和解脂耶氏酵母H222-41 (ura)-8的摇瓶合并。使用得自KREIENBAUM Wissenschaftiche Meßsysteme e.K.的多参数生物分析体系 YSI 7100确定葡萄糖含量，为0 g/l。将所述液体培养基分入50 mlfalcon试管中，并在5600 rpm下离心10分钟。抛弃上清液，并将沉淀物再悬浮于0.9%的NaCl溶液中，并再次在5600 rpm下离心10分钟。将该操作重复另外2次，以除去可能的残余糖。然后，在每种情况下将沉淀物再悬浮于15 ml乙酸盐培养基中，并根据菌株合并培养物，并且在每种情况下用乙酸盐培养基补充至50 ml。

根据van Uden的乙酸盐培养基具有下述组成：

基础培养基

5 g/l (NH₄)₂SO₄, 5 g/l KH₂PO₄, 0.5 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 0.15 g/l CaCl₂ x 2H₂O, 4 g/l乙酸钠(得自实施例2), 5 ml/l维生素溶液, 5 ml/l生物素溶液, 5 ml/l痕量元素溶液A, 5 ml/l痕量元素溶液B。

维生素溶液

80 mg/100 ml泛酸钙, 200 mg/100 ml肌醇, 160 mg/100 ml烟酸, 160 mg/100 ml盐酸吡哆醇, 16 mg/100 ml盐酸硫胺素。

生物素溶液

生物素8 mg/l。

痕量元素溶液A

100 mg/100 ml H₃BO₃, 20 mg/100 ml KI, 40 mg/100 ml NaMoO₄ x 2 H₂O。

痕量元素溶液B

8 mg/100 ml CuSO₄ x 5 H₂O, 40 mg/100 ml FeCl₈ x 6 H₂O, 80 mg/100 ml MnSO₄x 4 H₂O, ZnSO₄ x 7 H₂O 0.001 N HCl。

将基础培养基的固体组分溶解在700 ml ddH₂O中，将pH调至5.4，并将培养基高压灭菌。将溶液无菌过滤，并在冷却后加入到基础培养基中，然后用无菌ddH₂O将总培养基补至1000 ml。

调节发酵罐

给得自DASGIP的平行发酵系统的4个800 ml无菌发酵罐装入175 ml乙酸盐培养基。将工艺条件设置为30 pO₂ [%]、14 sl/h空气流、400-1500 rpm搅拌器速度、28℃温度和pH5.4。用0.5%H₂SO₄或25%乙酸和12.5%NH₄OH调节pH。使用的补料使用14%的乙酸钠溶液，pH5.4。

3-HIB的生产

给每2个发酵罐接种25 ml接种物解脂耶氏酵母H222-41Δ3HIBDH (ura)-8和解脂耶氏酵母H222-41 (ura)-8。

在接种后0、3、5、21、30和46小时进行取样。对于所有样品，用得自R-Biopharm的Analytical Test Kit，测定OD600和乙酸盐含量。使补料适应乙酸盐消耗。

对于在0和46小时的样品，另外用D₂O作为溶剂进行NMR测定，并进行乙酸盐和3HIB的水抑制。

结果

OD在实验期间由平均10增加至平均45。

在开始时，乙酸盐含量为平均2250 mg/kg，在发酵结束时为32 mg/l。

对于解脂耶氏酵母H222-41Δ3HIBDH (ura)-8和解脂耶氏酵母H222-41 (ura)-8，在发酵开始时的3HIB含量为0 mg/l。

46小时以后，对于野生型解脂耶氏酵母H222-41 (ura)-8，测得0 mg/kg。

具有3-HIB脱氢酶敲除的解脂耶氏酵母菌株H222-41Δ3HIBDH (ura)-8已经产生了平均18 mg/kg 3HIB。

实施例5: 方法步骤B)乙醇分离

通过直接蒸馏得自实施例1的发酵液，以水性浓缩物的形式分离出乙醇。

实施例6：用厌氧细菌克鲁佛梭菌（Clostridium kluyveri）将乙酸盐和乙醇转化 成己酸和己酸乙酯

为进行培养，使用耐压玻璃瓶，其可以用丁基橡胶塞气密密封。所有培养步骤在厌氧条件下进行。将瓶子在121℃高压灭菌20 min，以确保无菌。

对于培养物，给4个耐压玻璃瓶(容积500 ml)装入200 ml厌氧培养基，其被DSMZ作为培养基52推荐用于克鲁佛梭菌。使用得自实施例2和5的需要的乙酸盐和乙醇。然后给培养物分别接种10 ml克鲁佛梭菌的培养物。将培养物分别用丁基橡胶塞密封，在35°温育116.25 h。在培养开始和结束时取样。研究它们的光密度并借助NMR研究不同的分析物。由于借助于NMR仅可以将己酸和己酸乙酯确定为累积参数，因此借助于GC/MS分析来确认两种物质各自在最终样品中的存在。

经培养持续时间，平均经过4轮重复，显示出乙酸盐由5.4 g/l下降至1.4 g/l，且乙醇由14.2 g/l下降至5.8 g/l。同时，可证明丁酸的形成；在这里，值由0.13 g/l增加至2.5 g/l，和己酸/己酸乙酯的形成；在这里，总值由0.05 g/l增加至7.6 g/l。

序列表

<110> 赢创运营有限公司

<120> 使用合成气的多级合成方法

<130> 201100374

<160> 2

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经过密码子优化的基因

<400> 1

gcggccgcaa attcagtaag cagaaagtca aaagcctccg accggaggct tttgactatt 60

aggaaacgct gttgccatta gacgtcttgc cggtgctaat agcaccattc gcacctgcat 120

ttttcggacg ccactcggtt gcaccattga cgattgcagt accatcctcc agacgcagca 180

ggtgttgata ttggctacgc acaccaactt tggacgggtc catcgccgtc acgctttcca 240

aaacgctgtc acggccgcac tcgcgacgat attccagagc caggctgcac agctcctgcg 300

tttccaggac ctcggtcggc atgctctcca gaatccagcc aatgtatttg acgttgctga 360

catgttgatt cacatccaga tcgttccagc ctggggtcaa gcctttttgg atgctgtcac 420

cggtcttaac cttgaactta tggaccttca gatcgctatc ctcgataacc ggagagtcaa 480

cgaacagagg gacgatttcc tgatgcacct cgtacggcag cttgctcagg cgacgagttt 540

tctgattcat catggcatac gcgctggtcg cacgcaccag gatttcgccc gtattgcaat 600

cgctaatcag ccagtcgcga cccataccaa tcttacccag acggctgaaa cgcgtgttaa 660

tctcaacggt gtcaccccag gccgggtaac ggttaacttt gatctgcatc ttaatcacca 720

cccaaatcaa atcacgctta cacatctcca gggtgcgacc gaaaccatcc aacaggatac 780

cggtagattt acagtggttc aagctggttt cctgcaggtg gttcatcagg gtttcgatgc 840

tcgcggtacg atccgtgcca atctcgtagc tgcggatgct aaaggattga cgaaacacca 900

ggccgtcctg gaccgtgctt tccagaccaa acgagtctac cagcatgtcc gggcgtttgg 960

atttgcggtc gtgcatatgt tttacctcct gttaaacaaa attatttcta gagggaaacc 1020

gttgtggaat tgtgagcgct cacaattcca catccacaca ttatacgagc cgatgattaa 1080

ttgtcaacag cgtcgatcac tgtgcatgaa gctcgtaatt gttatccgct cacaattgga 1140

tcc 1143

<210> 2

<211> 4985

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 载体

<400> 2

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 60

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 120

gcgctgcgat gataccgcga gaaccacgct caccggctcc ggatttatca gcaataaacc 180

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 240

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 300

ttgttgccat cgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 360

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 420

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 480

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 540

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ggaaatgttg aatactcata ttcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 900

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gtgttacaac caattaacca attctgaaca ttatcgcgag cccatttata cctgaatatg 1020

gctcataaca ccccttgttt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg 1080

ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggactcc ccatgcgaga 1140

gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg 1200

cccgggctaa ttatggggtg tcgcccttat tcgactctat agtgaagttc ctattctcta 1260

gaaagtatag gaacttctga agtgggggcg gccgcaaatt cagtaagcag aaagtcaaaa 1320

gcctccgacc ggaggctttt gactattagg aaacgctgtt gccattagac gtcttgccgg 1380

tgctaatagc accattcgca cctgcatttt tcggacgcca ctcggttgca ccattgacga 1440

ttgcagtacc atcctccaga cgcagcaggt gttgatattg gctacgcaca ccaactttgg 1500

acgggtccat cgccgtcacg ctttccaaaa cgctgtcacg gccgcactcg cgacgatatt 1560

ccagagccag gctgcacagc tcctgcgttt ccaggacctc ggtcggcatg ctctccagaa 1620

tccagccaat gtatttgacg ttgctgacat gttgattcac atccagatcg ttccagcctg 1680

gggtcaagcc tttttggatg ctgtcaccgg tcttaacctt gaacttatgg accttcagat 1740

cgctatcctc gataaccgga gagtcaacga acagagggac gatttcctga tgcacctcgt 1800

acggcagctt gctcaggcga cgagttttct gattcatcat ggcatacgcg ctggtcgcac 1860

gcaccaggat ttcgcccgta ttgcaatcgc taatcagcca gtcgcgaccc ataccaatct 1920

tacccagacg gctgaaacgc gtgttaatct caacggtgtc accccaggcc gggtaacggt 1980

taactttgat ctgcatctta atcaccaccc aaatcaaatc acgcttacac atctccaggg 2040

tgcgaccgaa accatccaac aggataccgg tagatttaca gtggttcaag ctggtttcct 2100

gcaggtggtt catcagggtt tcgatgctcg cggtacgatc cgtgccaatc tcgtagctgc 2160

ggatgctaaa ggattgacga aacaccaggc cgtcctggac cgtgctttcc agaccaaacg 2220

agtctaccag catgtccggg cgtttggatt tgcggtcgtg catatgtttt acctcctgtt 2280

aaacaaaatt atttctagag ggaaaccgtt gtggaattgt gagcgctcac aattccacat 2340

ccacacatta tacgagccga tgattaattg tcaacagcgt cgatcactgt gcatgaagct 2400

cgtaattgtt atccgctcac aattggatcc aaaatgaagg gaagttccta tactttctag 2460

agaataggaa cttctatagg gagtcgaata agggcgacac aaaaggtatt ctaaatgcat 2520

aataaatact gataacatct tatagtttgt attatatttt gtattatcgt tgacatgtat 2580

aattttgata tcaaaaactg attttccctt tattattttc gagatttatt ttcttaattc 2640

tctttaacaa actagaaata ttgtatatac aaaaaatcat aaataataga tgaatagttt 2700

aattataggt gttcatcaat cgaaaaagca acgtatctta tttaaagtgc gttgcttttt 2760

tctcatttat aaggttaaat aattctcata tatcaagcaa agtgacaggc gcccttaaat 2820

attctgacaa atgctctttc cctaaactcc ccccataaaa aaacccgccg aagcgggttt 2880

ttacgttatt tgcggattaa cgattactcg ttatcagaac cgcccaggat gcctggcagt 2940

tccctactct cgccgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggg acctcagcgc tagcggagtg 3000

tatactggct tactatgttg gcactgatga gggtgtcagt gaagtgcttc atgtggcagg 3060

agaaaaaagg ctgcaccggt gcgtcagcag aatatgtgat acaggatata ttccgcttcc 3120

tcgctcactg actcgctacg ctcggtcgtt cgactgcggc gagcggaaat ggcttacgaa 3180

cggggcggag atttcctgga agatgccagg aagatactta acagggaagt gagagggccg 3240

cggcaaagcc gtttttccat aggctccgcc cccctgacaa gcatcacgaa atctgacgct 3300

caaatcagtg gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggcg 3360

gctccctcgt gcgctctcct gttcctgcct ttcggtttac cggtgtcatt ccgctgttat 3420

ggccgcgttt gtctcattcc acgcctgaca ctcagttccg ggtaggcagt tcgctccaag 3480

ctggactgta tgcacgaacc ccccgttcag tccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 3540

cgtcttgagt ccaacccgga aagacatgca aaagcaccac tggcagcagc cactggtaat 3600

tgatttagag gagttagtct tgaagtcatg cgccggttaa ggctaaactg aaaggacaag 3660

ttttggtgac tgcgctcctc caagccagtt acctcggttc aaagagttgg tagctcagag 3720

aaccttcgaa aaaccgccct gcaaggcggt tttttcgttt tcagagcaag agattacgcg 3780

cagaccaaaa cgatctcaag aagatcatct tattaatcac tgcccgcttt ccagtcggga 3840

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 3900

attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagact ggcaacagct gattgccctt 3960

caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg 4020

aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctatctt cggtatcgtc 4080

gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat 4140

tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt 4200

cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc 4260

tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc 4320

cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag 4380

atgctccacg cccagtcgcg taccgtcctc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt 4440

ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat 4500

ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag 4560

attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac 4620

gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg 4680

cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg 4740

tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt 4800

tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc 4860

ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcata ttcaccaccc tgaattgact 4920

ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattcga tggcgcgccg 4980

ctttt 4985