阅读说明：本技术 一种缓解关节骨炎炎症反应的中药组合物及其制备方法 (Traditional Chinese medicine composition for relieving arthritis inflammatory reaction and preparation method thereof ) 是由 黎一江 郭弘妍 邢婉丽 程京 于 2019-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种缓解关节骨炎炎症反应的中药组合物及其制备方法。所述中药组合物由下述质量份的组分制成：伸筋草100～140份；透骨草100～140份；独活100～140份；威灵仙100～140份；当归100～140份；冰片100～140份；川牛膝100～140份。本发明中药组合物中不含有药典标明的毒性中药材成分,并且在肝肾细胞中对该药物组合进行了细胞毒性评价,发现对肝肾细胞的活性无明显的抑制作用,可长期服用。(The invention discloses a traditional Chinese medicine composition for relieving arthritis inflammatory reaction and a preparation method thereof. The traditional Chinese medicine composition is prepared from the following components in parts by mass: 100-140 parts of lycopodium clavatum; 100-140 parts of garden balsam stem; 100-140 parts of radix angelicae pubescentis; 100-140 parts of clematis root; 100-140 parts of angelica; 100-140 parts of borneol; 100-140 parts of medicinal cyathula root. The traditional Chinese medicine composition does not contain toxic traditional Chinese medicine components indicated by pharmacopoeia, and the cytotoxicity evaluation is carried out on the medicine composition in liver and kidney cells, so that the traditional Chinese medicine composition has no obvious inhibition effect on the activity of the liver and kidney cells, and can be taken for a long time.)

一种缓解关节骨炎炎症反应的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种缓解骨关节炎炎症反应的中药组合物及其制备方法，属于中药制剂技术领域。

背景技术

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种随年龄增长而发生率增加的退行性关节疾病，其病理特征主要为关节软骨出现原发性或继发性退行性变。有关调查表明，在我国50岁以上的人口中，骨关节炎的发病率为5％左右，60岁以上女性的发病率为25％，男性为5％。环氧化酶(COX)可催化***素的合成，***素参与体内多种病理和生理过程。COX有两种同工酶，COX-1和COX-2，前者与机体正常生理功能有关，如保护胃黏膜、控制血小板聚集等，后者则与炎症或肿瘤的发生有关。正常组织中COX-1在大部分细胞都可以分泌，COX-2则只在病理状况刺激之下才会表现。促炎症细胞因子通过调节转录因子活性促进COX-2转录和表达。COX-2促进花生四烯酸转化成PGE2，软骨细胞和滑膜细胞分泌PGE2和胶原酶增加，促进软骨细胞合成各种基质金属蛋白酶，加速软骨基质中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的降解，并抑制其合成，进而造成对骨关节的破坏，加重骨关节炎的炎症反应。

骨关节炎的治疗药物主要分为两类：西药类的治疗药物和中药类的治疗药物。非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是临床最常用的西药类的骨关节炎症状治疗药物，具有抗炎镇痛和退热功效。采用非甾体类抗炎药可能引起一些不良反应，若长期服用有导致消化道溃疡、肾功能损害的可能。研究发现每年服用NSAIDs的人有1％～4％出现严重胃肠道并发症，包括出血、穿孔和梗死。服用NSAIDs后出现严重胃肠道并发症的风险是未服者的3～5倍。中医学认为膝骨性关节炎的主要病机为本虚标实、本痿标痹；因肝藏血、主筋，肾藏精、主骨，肝肾亏虚，精血不足，则筋骨失养，腠理空虚，易感风寒湿之邪而为痹，采用的治疗方剂多为补益类和祛风除湿类的方剂为主。治疗骨关节炎的中药方剂中大多含有川乌、草乌、附子等含有剧毒乌头碱等药材，以及其他中药药典中标注具有大毒的药材，不适合口服使用。同时大部分的方剂的具体的左右机制并不确切。因此，针对现有治疗的药物的缺陷，提供一种新的中药组合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于缓解骨关节炎炎症反应的中药组合物及制备方法，本发明将伸筋草、透骨草、独活、威灵仙、当归、冰片、川牛膝按特定比例进行复配，通过降低COX-2(Cyclo-oxygenase 2，环氧化酶2)的相关基因的表达，从而来起到抗炎的作用，同时该药物组合无有毒药材，同时进行了肝肾细胞毒性评价无毒，可长期服用。

本发明针对非甾体类抗炎药的存在不良反应的问题，采用肝肾细胞对开发的组合物进行细胞毒性评价；针对中药方剂中含有有毒方剂以及中药的疗效机制不明确的问题，该中药组合物选取药典中没有毒性的药材，并采用转录组测序的方法对炎症反应中的关键基因的表达进行评估，最终筛选出无毒且有效的组合物。

具体地，本发明所提供的缓解骨关节炎炎症反应的中药组合物，由下述质量份的组分制成：

伸筋草 100～140份；

透骨草 100～140份；

独活 100～140份；

威灵仙 100～140份；

当归 100～140份；

冰片 100～140份；

川牛膝 100～140份。

具体地，所述中药组合物由下述质量份的组分制成：

伸筋草 100份；

透骨草 100份；

独活 100份；

威灵仙 100份；

当归 100份；

冰片 100份；

川牛膝 100份。

本发明中药组合物按照下述方法制备：

称取伸筋草、透骨草、独活、威灵仙、当归、冰片和川牛膝并混合作为原料，然后采用乙醇水溶液或水进行回流提取，所得提取液过滤后经浓缩得到浸膏，即为所述中药组合物。

上述的制备方法中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为85～95％；

所述乙醇水溶液的体积用量为所述原料质量的10～15倍，单位为mL/g；

所述水的体积用量为所述原料质量的10～15倍，单位为mL/g。

上述的制备方法中，所述回流提取的时间为2～3h；

所述浓缩的温度为40～45℃；浓缩的倍数为0.2～1。

以本发明中药组合物为活性成分可制成缓解骨关节炎炎症反应的药物，其剂型可为片剂、丸剂、膏剂、胶囊或颗粒剂。

本发明采用转录组测序技术对中药组合物的细胞药理学进行评估，通过对影响炎症反应的关键基因COX-2表达的评估，最终得到了一种中药组合物，该中药组合物的特点是可以显著降低软骨细胞中COX-2的相关表达。

本发明中药组合物中不含有药典标明的毒性中药材成分，并且在肝肾细胞中对该药物组合进行了细胞毒性评价，发现对肝肾细胞的活性无明显的抑制作用。

本发明中药组合物的抗炎作用确切，且无肝肾细胞毒性，适合长期服用。

相较于之前报道过的方剂中重合的部分，本发明方剂具有更好的抗炎效果。同时，本发明方剂也与组成本发明方剂的部分方剂方案(对比方剂一：伸筋草、透骨草、独活、川牛膝；对比方剂二：威灵仙、当归、独活)进行效果比较，经过相关细胞实验验证，对比方剂对于炎症的逆转效果显著低于本发明方案，因而本发明方剂具有更优的缓解骨关节炎效果。

附图说明

图1为本发明方剂的细胞毒性结果。

图2为骨关节炎细胞模型的通路富集结果(正常细胞vs骨关节炎细胞)。

图3为加药模型的通路富集结果(加药处理的骨关节炎细胞vs骨关节炎细胞)。

图4为加药模型的炎症基因分析(COX-2)。

图5为本发明方剂与对比方剂的加药模型的通路富集结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、方剂的配制及提取

1)称量待要提取的方剂

伸筋草100份，透骨草100份，独活100份，威灵仙100份，当归100份，冰片100份，川牛膝100份。

2)提取

醇提：用无水乙醇配置体积百分含量95％的乙醇水溶液，每个方剂准备10质量体积倍(g/mL)的乙醇水溶液。

水提：每个方剂准备10质量体积倍(g/mL)的去离子水。

3)放入药材

打开索氏提取仪的电源，仪器型号为B811。将滤纸包好的药材放入玻璃样品管底部。

4)放入提取试剂

将萃取溶剂(体积百分含量95％的乙醇水溶液或去离子水)倒入溶剂杯中。将溶剂杯固定在索式提取仪下端接口处。

5)调节仪器

调节液位感应器，高于药包0.5cm。

将冷凝管下压，逆时针旋转固定，关闭防护门。

6)萃取过程

a)设置程序提取时间3h，醇提的加热级别选择16，水提的加热级别选择20；设置干燥时间20min，加热级别10。

b)打开冷凝管水龙头。

c)按start键，开始萃取。

d)萃取过程中，观察有无漏液，报错的情况。

7)萃取结束后，将盛有浓缩样品的溶剂杯取出。换新溶剂杯，点击SOLVENT键将废液排出。

取出药包。

关闭循环水和电源。

8)烘干浓缩

a)将盛有浓缩样品的溶剂杯放入烘干箱45℃烘干，仪器型号HPX-9162MBE。

b)直至溶剂杯中液体挥发至每100份原料浓缩至20份浸膏。

9)提取后保存

将浓缩样品用1mL移液器转至10mL棕色小瓶中。同时粘贴带样本名称标签一份、二维码标签一份，-80℃保存。

10)方剂冻干

将冻干机置物架放入-80℃冰箱预冷30min。

将装有样本的棕色小瓶从冰箱取出，将置物架转移至冻干机处。

主干燥时间+∞，真空度0.08kpa。

待24h后，关闭冻干机电源，打开空气连接阀，待真空度显示为Atm时，将冻干机玻璃罩取下。

取出冻干机中样本瓶，对应原瓶盖，盖紧瓶盖。

当伸筋草140份，透骨草140份，独活140份，威灵仙140份，当归140份，冰片140份，川牛膝140份时，也可以采用同样的方法制备得到冻干粉。

实施例2、肝肾及软骨细胞毒性实验

1)方剂浓缩液的配制：

取实施例1制备的50mg冻干粉，加入1mL DMSO(醇提)或1mL去离子水(水提)，配置成50mg/mL的浓缩液。

2)方剂实验工作液的配置：

依据实验要求，将用培养基浓缩液稀释为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的工作液。

3)细胞铺板：

对于肝细胞毒性试验，使用HepG2细胞(人肝癌细胞)作为细胞模型；对于肾细胞毒性试验，使用HK-2细胞(人肾皮质近曲小管上皮细胞)作为细胞模型；对于软骨细胞毒性试验，使用C28-I2细胞(人正常软骨细胞)作为细胞模型。

从培养箱中取两种细胞的培养瓶，各加1mL胰酶至培养瓶，轻晃使整个细胞面都被胰酶覆盖到，放入培养箱消化至细胞部分漂浮，加2mL完全培养基终止消化，使用巴氏吸管吹打培养基，使细胞脱落，离心，弃上清，加2mL培养基将细胞轻轻吹打混匀，细胞计数板计数。按照8000cells/孔进行细胞铺板。置于培养箱中培养24h。

4)细胞加药：

从培养箱拿出细胞培养板，缓慢弃掉培养基。

设置实验孔和对照孔，醇提药物以DMSO为对照孔，水提药物以培养基为对照孔。

实验孔中加入不同浓度梯度的方剂实验工作液100μL。培养箱中培养24h。

5)CCK-8检测：

从培养箱拿出细胞培养板，缓慢弃掉培养基。

加入已配置的CCK8完全培养基110μL。

在培养箱孵育3h后用酶标仪测量(波长450nm)。

整理实验结果如图1所示，可以看出，在100ug/mL以下的方剂浓度下，该方剂对肝肾及软骨细胞均无明显细胞毒性(细胞活力>80％)。

实施例3、方剂缓解骨关节炎炎症反应的实验

1、骨关节炎炎症模型建立：

(1)配置人软骨细胞培养基：

DMEM/F12培养基，加入10％的胎牛血清，50μm/ml双抗，50μm/ml抗坏血酸。

(2)人软骨细胞培养：

人软骨细胞(第3到5代)接种于6孔细胞培养板中，接种密度为2×10⁶细胞/孔，加入人软骨细胞培养基，培养箱培养48小时。

(3)软骨细胞炎症诱导模型：

在人软骨细胞培养基中加入1ng/ml人重组IL-1β，培养箱培养72小时，每24小时换液一次。

2、方剂药筛的细胞实验：

1)采用炎症诱导成功的骨关节炎细胞模型进行药筛，将细胞以8000cells/孔的细胞密度铺板，培养6h。同时设置正常细胞的对照孔。

2)向骨关节炎细胞孔中加入醇提方剂工作液，使终浓度为100ug/ml和400ug/ml。继续培养48h。

3、转录组测序及分析：

1)药筛细胞的裂解，反转录及扩增建库参照相关试剂盒的使用说明进行。

2)样品进行上机测序，采用Illumina HiSeq X10，每个样本测1M reads，对下机数据进行分析。

4、骨关节炎建模分析：

对骨关节炎下机数据进行KEGG通路富集分析，从通路富集的结果(图2)可以看到，相较于骨关节炎建模细胞，正常细胞与IL-17、TNF、类风湿性关节炎相关的信号通路相关的基因表达，均为下调。证明骨关节建模细胞激活了相关的炎症通路，骨关节炎细胞模型建模成功。

5、加药模型的通路富集分析：

对加药模型数据进行KEGG通路富集分析，从通路富集的结果(图3)可以看到，相较于骨关节炎建模细胞，加药处理的细胞TNF、类风湿性关节炎相关的信号通路相关的基因表达，大多数出现了下调表达，说明该方剂组合对于炎症相关通路具有抑制作用。

6、加药模型的炎症基因分析：

对加药模型数据的基因表达(FPKM)进行分析，如图4所述，发现加入方剂处理后COX-2的基因表达被显著抑制(p<0.05)，证明该组合物通过降低COX-2(Cyclo-oxygenase2，环氧化酶2)的相关基因的表达，从而来起到抗炎的作用。

实施例4、本发明方剂与组成本方剂的部分方剂的抗炎效果比较

对比方剂一：伸筋草、透骨草、独活、川牛膝，各组分的质量配比为1：1：1：1。

对比方剂二：威灵仙、当归、独活，各组分的质量配比为1：1：1。

将对比方剂一和二经过实施例1中的醇提后，与本发明实施例1中的方剂(醇提)分别对骨关节炎细胞进行处理，通过转录组测序及后续通路富集分析，得到对比结果，如图5所示。从图5可以看出，纵坐标标示的为与炎症反应相关通路，纵坐标由上到下为差异通路显著性由高到低(显著性差异越高，证明方剂对该通路的影响越显著)，灰色表示与炎症相关的基因的高表达(加重炎症反应)，黑色示与炎症相关的基因的低表达(减轻炎症反应)，相较于两个对比方剂，本发明方剂可以显著调节炎症相关通路相关基因的低表达，因而本发明方剂相较于对比方剂具有更好的抗炎效果。

将本发明实施例1的方剂(醇提)，制成传统的外敷膏药，招募一批具有关节疼痛症状的志愿者进行试用，贴敷时间为12小时，依据其贴敷前后的感受填写问卷，问卷内容包含是否有不良反应、症状是否缓解等，得到结果如表1所示：

表1本发明方剂试用结果

测试人数	不良反应率	症状缓解率
			21	0％	76％