阅读说明：本技术 一种pH敏感脂质材料及其制备方法和用途 (pH-sensitive lipid material and preparation method and application thereof ) 是由 徐缓 杜为昂 朱彩丽 王凯乾 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于有机化学合成、生物医药材料技术领域,公开了一种pH敏感脂质材料及其制备方法和用途。本发明提供的pH敏感脂质材料以2-甲基-2-噁唑啉为单体通过阳离子开环聚合反应合成一端为羟基的聚(2-甲基-2-噁唑啉),并将其与胆固醇甲酰氯酯化偶联合成制得。利用本发明制备的pH敏感脂质材料修饰的脂质体包封率高,稳定性好,表现出一定的pH敏感性。本发明的反应起始物价格低廉,反应条件温和,收率高,适合工业化生产。(The invention belongs to the technical field of organic chemical synthesis and biomedical materials, and discloses a pH sensitive lipid material and a preparation method and application thereof. The pH-sensitive lipid material provided by the invention is prepared by synthesizing poly (2-methyl-2-oxazoline) with one end being hydroxyl by taking 2-methyl-2-oxazoline as a monomer through a cationic ring-opening polymerization reaction, and performing esterification coupling on the poly (2-methyl-2-oxazoline) and cholesterol formyl chloride. The liposome modified by the pH sensitive lipid material prepared by the invention has high entrapment rate, good stability and certain pH sensitivity. The invention has the advantages of low price of reaction starting materials, mild reaction conditions and high yield, and is suitable for industrial production.)

一种pH敏感脂质材料及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于有机化学合成、生物医药材料技术领域，本发明涉及一种pH敏感脂质材料及其制备方法和用途。

背景技术

癌症，本就是人人谈之色变的疾病，其高发病率和高死亡率的不断增长，更让人们胆战心惊。于是，不少人都渐渐加入了“防癌大军”，但尽管如此，癌症依然在全球高发。

美国癌症学会官方期刊发表了《2018年全球癌症统计数据》报告，这篇文章评估了185个国家36种癌症的发病率和死亡率。

2018年，全球预计有1810万癌症新发病例，960万癌症死亡病例。这是全球所有年龄段、性别，包括非黑色素瘤皮肤癌在内的所有癌症发病比例的推算数据。相比于其他国家，我国癌症发病率、死亡率均为全球第一！在1810万新增癌症病例中，我国占380.4万例；在960万癌症死亡病例中，我国占229.6万例。

这组数据意味着：全球每新增的100个癌症患者中，就有21个中国人。也就是说，我国平均每分钟有7个人确诊癌症，每分钟就有将近5人死于癌症！中国，肺癌的发病率是最高的，因此，癌症治疗研究显得尤为紧迫。

传统的癌症治疗方式包括：手术、放疗和化疗。虽然这些方法针对癌症有一定作用，但是众所周知，手术切除对癌症患者来说相当痛苦，同时还存在一定风险，然而无论是放疗或是化疗都存在生物利用度低、毒副作用大等缺点。随着科学技术的不断发展，研究人员致力于开发新型药物递送系统，以增加抗癌药物在生物体内的利用率并降低毒副作用。脂质体由磷脂和胆固醇组成，结构中包含极性的亲水头基和两条具有疏水作用的非极性碳链，亲水部分裸露于水相，而疏水部分则避开水相形成完整的封闭囊泡。其结构与生物膜相似，因此作为药物递送载体，可在生物体内被降解，具有低免疫原性的同时又可延长药物在体内的半衰期，降低毒副作用。与正常细胞相比肿瘤细胞处在缺氧环境中并且糖酵解活跃产生大量的酸性产物，另一方面肿瘤细胞过表达碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)促进CO₂和H₂O反应生成大量碳酸，导致肿瘤部位呈现微酸性，因此，如何利用低pH触发脂质体释放药物成为科研人员面对的技术难题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种制备脂质体pH敏感脂质材料，为构建酸敏型脂质体提供可能。本发明的第二个目的是提供了该pH敏感脂质材料的制备方法，该方法条件温和，收率高，操作方便，适合工业化大生产。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种pH敏感脂质材料，为通式(I)所示化合物E：

上述pH敏感脂质材料制备方法，以通式(II)所示化合物A为原料，以通式(III)所示化合物B为引发剂，在有机溶剂中发生聚合反应得到以通式(IV)所示化合物C，以通式(IV)所示化合物与以通式(V)所示化合物D酯化偶联，最终得到pH敏感脂质材料为通式(I)所示化合物E。

其中化合物A：化合物B的物质的量之比为5～100:1，化合物C：化合物D的物质的量之比1:1-10。

化合物C的制备：所述化合物A在搅拌的条件下，溶于有机溶剂中，按化合物A：化合物B为5～100:1的比例加入化合物B，50～120℃加热搅拌12～72小时后降至室温，加入KOH甲醇溶液，0.5～16小时停止反应，产物经硅胶过滤后，滴加至***中，得到化合物C，聚合度范围5-100。

化合物E的制备：所述化合物C溶于有机溶剂中，搅拌条件下加入酰化作用的催化剂，在氮气保护下加入三乙醇胺，缓缓滴加含有化合物D的有机溶液；冰浴中搅拌0.5～2小时，室温12～72小时；将粗品倒入分液漏斗中，加入0.01～1M盐酸连续洗2～5次，然后用饱和碳酸氢钠调节pH至5～8，最后用水洗涤、萃取2～6次；产物加入无水硫酸镁处理后，利用柱层析进行分离提纯，洗脱液为二氯甲烷与甲醇的混合液，体积比为1～10:1。

进一步的，所述化合物C的制备中，所述有机溶剂为甲醇，乙醇，***，乙腈，氯仿，石油醚，丙酮，NN-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜中的任一种或几种组合。

进一步的，所述化合物E的制备中，所述催化剂为：吡啶、DMF、DMAP、三氯化铝中的任一种或几种组合。

进一步的，所述化合物E的制备中，所述有机溶剂为二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，溴苯，二硫化碳中的任一种或几种组合。

进一步的，所述的化合物C分子量范围为500～10000。

所述的化合物E可在制备抗肿瘤药物制剂中应用。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

本发明中的化合物A为五元杂环化合物，经过阳离子开环聚合得到的化合物C，化合物C由含碳和其他原子的重复单元组成的长链结构，长链末端的羟基表明其具有较强的反应活性。本发明通过亲电取代反应将化合物C与化合物D相连，得到一种新的聚合物化合物E。本发明制备得到的聚合物化合物E收率高，分子量分布窄，稳定性好，可防止药物的突释，抗癌效果显著。本发明提供的pH敏感脂质材料以2-甲基-2-噁唑啉为单体通过阳离子开环聚合反应合成一端为羟基的聚(2-甲基-2-噁唑啉)，并将其与胆固醇甲酰氯酯化偶联合成制得。利用本发明的pH敏感脂质材料修饰的脂质体包封率高，稳定性好，表现出一定的pH敏感性。本发明的反应起始物价格低廉，反应条件温和，收率高，适合工业化生产。

附图说明

图1为实施例1中化合物C的红外光谱图。

图2为实施例1中化合物C的¹H-NMR图。

图3为实施例1中化合物E的红外光谱图。

图4为实施例1中化合物E的¹H-NMR图。

图5为不同修饰脂质体药物渗漏百分率图。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。

实施例1

化合物E的合成

1、该聚合反应需要在干燥的环境中进行，将洗净烘干的玻璃仪器趁热按顺序组装，反应体系连接真空泵抽真空后充入氮气以排净空气。

2、在氮气保护下向体系中加入15mL无水处理过的乙腈，搅拌下加入一定量的化合物A(10mmoL)使之完全溶解后加入引发剂化合物B(化合物A：化合物B＝20:1)，100℃搅拌24h后降至室温，加入预先配制的KOH甲醇溶液(0.1M)。12h停止反应，产物经粗硅胶过滤后，滴加至20mL冰***中，得到的目标产物化合物C为白色固体。

3、化合物E的合成在避光条件下进行。

4、称取0.8g化合物C溶于10mL CH₂Cl₂，搅拌下加入DMAP(0.2mmoL)，快速称取化合物D(0.6mmoL)溶解于5mL CH₂Cl₂备用。体系抽真空后在氮气保护下加入75μL TEA，缓缓滴加化合物D CH₂Cl₂溶液，冰浴搅拌1h，室温24h；得粗产物。

5、将粗产物缓慢倒入分液漏斗中，1M盐酸连续洗3次，然后用饱和碳酸氢钠调pH至中性，最后用水洗涤、萃取3次。产物加入无水硫酸镁处理后，利用柱层析进行分离提纯，上样量1mL，洗脱液为CH₂Cl₂与CH₃OH的混合液，体积比为6:1。得到成品化合物E。化合物E总收率为82.7％。

化合物C的红外光谱中出现3300cm^-1(羟基，-OH)峰，1680cm^-1(羰基，C＝O)峰，1280cm^-1(碳氮，C-N)吸收峰。1527cm^-1(酰胺，-NH)峰由于羰基峰的影响向低波数移动。化合物C的¹H NMR(CDCl₃，δppm)：2.10(t，3H，H-3)，3.5(t，2H，H-2)，4.7(s，1H，H-1)；5.4(s，1H，H-4)，以上结果说明化合物C成功合成。见图1和图2。

凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography，GPC)测定化合物C分子量结果如下：数均分子量(Mn)为2198，重均分子量(Mw)为3159，PDI值为1.358。

化合物E的红外光谱中3456cm^-1(羟基，-OH)峰消失，同时兼具1627cm^-1(羰基，C＝O)，1580cm^-1(酰胺，-NH)，以及特征1150cm^-1和1211cm^-1(酯，C-O)酯基峰。化合物E的¹H NMR(CDCl₃，δppm)：0.79(d，3H，H-1)，0.80(d，3H，H-2)，0.94(d，3H，H-3)，0.43(s，3H，H-4)，1.32(s，3H，H-5)，2.28(s，3H，H-8)4.53(s，1H，H-6)，3.38(d，2H，H-7)，5.28(s，1H，H-9)，以上结果说明化合物E成功合成。见图3和图4。

实施例2

化合物E的合成

1、该聚合反应需要在干燥的环境中进行，将洗净烘干的玻璃仪器趁热按顺序组装，反应体系连接真空泵抽真空后充入氮气以排净空气。

2、在氮气保护下向体系中加入20mL无水处理过的甲醇，搅拌下加入一定量的化合物A(16mmoL)使之完全溶解后加入引发剂化合物B(化合物A：化合物B＝15:1)，80℃搅拌18h后降至室温，加入预先配制的KOH甲醇溶液(0.05M)。8h停止反应，产物经粗硅胶过滤后，滴加至50mL冰***中，得到的目标产物化合物C为白色固体。

3、化合物E的合成在避光条件下进行。

4、称取1.0g化合物C溶于20mL氯仿，搅拌下加入DMF(0.5mmoL)，快速称取化合物D(1.0mmoL)溶解于20mL氯仿中备用。体系抽真空后在氮气保护下加入50μL TEA，缓缓滴加化合物D氯仿溶液，冰浴搅拌0.5h，室温48h；得粗产物。

5、将粗产物缓慢倒入分液漏斗中，0.01M盐酸连续洗5次，然后用饱和碳酸氢钠调pH至6，最后用水洗涤、萃取5次。产物加入无水硫酸镁处理后，利用柱层析进行分离提纯(硅胶型号为200-300目，石油醚湿法装柱，柱长15cm)，上样量1mL，洗脱液为CH₂Cl₂与CH₃OH的混合液，体积比为4:1。得到成品化合物E。化合物E总收率为85.8％。

实施例3

化合物E的合成

1、该聚合反应需要在干燥的环境中进行，将洗净烘干的玻璃仪器趁热按顺序组装，反应体系连接真空泵抽真空后充入氮气以排净空气。

2、在氮气保护下向体系中加入25mL无水处理过的乙醇，搅拌下加入一定量的化合物A(19mmoL)使之完全溶解后加入引发剂化合物B(化合物A：化合物B＝10:1)，80℃搅拌18h后降至室温，加入预先配制的KOH甲醇溶液(0.05M)。8h停止反应，产物经粗硅胶过滤后，滴加至50mL冰***中，得到的目标产物化合物C为白色固体。

3、化合物E的合成在避光条件下进行。

4、称取1.0g化合物C溶于20mL氯仿，搅拌下加入DMF(0.5mmoL)，快速称取化合物D(1.0mmoL)溶解于20mL氯仿中备用。体系抽真空后在氮气保护下加入50μL TEA，缓缓滴加化合物D氯仿溶液，冰浴搅拌0.5h，室温48h；得粗产物。

5、将粗产物缓慢倒入分液漏斗中，0.01M盐酸连续洗5次，然后用饱和碳酸氢钠调pH至6，最后用水洗涤、萃取5次。产物加入无水硫酸镁处理后，利用柱层析进行分离提纯，上样量2mL，洗脱液为CH₂Cl₂与CH₃OH的混合液，体积比为9:1。得到成品化合物E。化合物E总收率为92.1％。

实施例4

化合物E的合成

1、该聚合反应需要在干燥的环境中进行，将洗净烘干的玻璃仪器趁热按顺序组装，反应体系连接真空泵抽真空后充入氮气以排净空气。

2、在氮气保护下向体系中加入25mL无水处理过的溴苯，搅拌下加入一定量的化合物A(16mmoL)使之完全溶解后加入引发剂化合物B(化合物A：化合物B＝30:1)，60℃搅拌72h后降至室温，加入预先配制的KOH甲醇溶液(0.02M)。16h停止反应，产物经粗硅胶过滤后，滴加至50mL冰***中，得到的目标产物化合物C为白色固体。

3、化合物E的合成在避光条件下进行。

4、称取1.0g化合物C溶于20mL氯仿，搅拌下加入DMF(0.5mmoL)，快速称取化合物D(1.0mmoL)溶解于20mL氯仿中备用。体系抽真空后在氮气保护下加入50μL TEA，缓缓滴加化合物D氯仿溶液，冰浴搅拌0.5h，室温48h；得粗产物。

5、将粗产物缓慢倒入分液漏斗中，0.05M盐酸连续洗4次，然后用饱和碳酸氢钠调pH至8，最后用水洗涤、萃取6次。产物加入无水硫酸镁处理后，利用柱层析进行分离提纯，上样量2mL，洗脱液为CH₂Cl₂与CH₃OH的混合液，体积比为5:1。得到成品化合物E。化合物E总收率为89.8％。

试验例1不同修饰的阿霉素脂质体制备及研究

一、药品与试剂

大豆卵磷脂(上海源聚生物科技有限公司)；PEG-DSPE(西安瑞禧生物科技有限公司)；化合物E(自制，实施例1)；胆固醇(上海政翔化学试剂研究所)；PBS(pH4.0，PH6.8，PH7.4，按照2015年版《中国药典》标准配制，其他PH值的由这3种以适当比例混合得到，离子浓度均为0.10)；阿霉素(浙江海正药业股份邮箱公司，批号：180405)，其他试剂均为分析纯。

二、仪器

R205系列旋转蒸发仪(上海申生科技仪器)；SY2200型超声波发生器(上海三友超声设备有限公司)；S54型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；

三、实验操作

1、普通阿霉素脂质体的制备

精密称取一定比例的磷脂、胆固醇溶于适量混合溶液(氯仿：甲醇，2：1)中，减压蒸干混合溶液至形成一层均匀的脂质薄膜。加适量ph4.0的PBS溶解后间歇超声(超声5s停5s地循环超声)3min成均匀乳液，用ph7.4的PBS调节pH至碱性，加入适量阿霉素溶液后再间歇超声数次，每次3min，水浴条件下水合3小时，0.22μm微孔滤膜过滤既得阿霉素纳米脂质体。

2、ph敏感脂质体的修饰

分别向上述制备的阿奇霉素纳米脂质体中加入PEG-DSPE和化合物E，水合0.5h，既得经过修饰的阿霉素纳米脂质体。

3、包封率的测定精密移取脂质体溶液1mL，以pH6.8 PBS 25mL稀释后作为外液，另精密量取pH6.8的PBS20ml，置PBS浸泡24h的透析袋中作内液，4℃恒温，每间隔30分钟搅拌一次，透析6h，每隔1小时从内液中取样5mL，同时补加同温同体积新鲜缓冲液，测定所得内液的吸收度，同一样品取3次实验的平均值。根据阿霉素标准曲线，可以换算出吸收度对应的游离阿霉素在所有内液中的浓度，可计算出游离的阿霉素量，按下式计算包封率(EE)：

EE＝(M_总-M_游)/M_总*100％

其中，M_总代表药物总浓度，M_游代表游离药物浓度。

不同修饰脂质体包封率见下表1。

表1不同修饰脂质体包封率(EE)(％)

4、pH敏感性实验

分别以pH5.0，5.5，6.0，6.1，6.3，6.5，7.0的PBS代替“包封率的测定”中pH6.8的PBS作外液，按“包封率的测定”所示方法测定包封率，按下式计算药物渗漏(RE)百分率：

RE(％)＝1-EE

其中EE代表包封率。

以阿霉素的RE对pH值作图，即得脂质体药物渗漏的pH敏感性曲线，见图5。

不同修饰脂质体药物渗漏(RE)百分率见下表2。

表2不同修饰脂质体药物渗漏(RE)百分率(％)

从实验结果可知，用化合物E修饰的脂质体其包封率明显优于PEG-DSPE修饰的脂质体和普通脂质体，形成显著性的差异。pH敏感性实验表明，化合物E修饰的脂质体可在ph低的环境下快速释放药物，释放速度优于PEG-DSPE修饰的脂质体和普通脂质体，说明本发明制备的化合物E具有明显的ph敏感性。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。