阅读说明：本技术 一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的tale-tf载体及其构建方法 (TALE-TF vector for increasing yield of epothilones of sorangium cellulosum and construction method thereof ) 是由 叶伟 刘桃妹 章卫民 朱牧孜 李赛妮 李浩华 孔亚丽 刘珊 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的TALE-TF载体及其构建方法。本发明首次公开了一种新型的靶向纤维堆囊菌埃博霉素生物合成基因启动子的新型TALE-TF元件,将其导入纤维堆囊菌,提高了埃博霉素生物合成基因表达水平及埃博霉素产量。本发明通过代谢工程手段提高了埃博霉素产量并降低埃博霉素的生产成本,能促进埃博霉素作为原料药物在肿瘤治疗方面的应用。(The invention discloses a TALE-TF vector for improving the yield of epothilone of sorangium cellulosum and a construction method thereof. The invention discloses a novel TALE-TF element of a novel target epothilone biosynthesis gene promoter of sorangium cellulosum, which is introduced into sorangium cellulosum, so that the expression level of the epothilone biosynthesis gene and the epothilone yield are improved. The invention improves the yield of the epothilone and reduces the production cost of the epothilone by means of metabolic engineering, and can promote the application of the epothilone as a raw material medicament in the aspect of tumor treatment.)

一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的TALE-TF载体及其构建 方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的TALE-TF载体及其构建方法。

背景技术

埃博霉素是一类由纤维堆囊菌产生的具有较强抗肿瘤活性的大环内酯类化合物，据报道，埃博霉素B的抗肿瘤活性是紫杉醇的10-100倍，而且埃博霉素对p-糖蛋白表达型的多药耐药性肿瘤细胞系中显示很强的抗肿瘤活性，因此肿瘤细胞不易对其产生耐药性。而人们对纤维堆囊菌的研究主要集中在通过优化发酵条件，紫外诱变等手段来提高埃博霉素的产量。目前通过物理和化学方法可以使埃博霉素A的产量达到18-22mg/L,埃博霉素B的产量达到8-9mg/L，距离规模化生产仍有一定距离。纤维堆囊菌SMP44和So ce90的埃博霉素基因簇已经被鉴定，但由于纤维堆囊菌的遗传操作较为困难，人们将埃博霉素基因簇克隆至橙黄色粘球菌、大肠杆菌和天蓝色链霉菌中进行表达，但由于埃博霉素的细胞毒性导致埃博霉素产异源表达的产量比较低。埃博霉素B的最高产量仅为2.5mg/L。纤维堆囊菌仍为最理想的埃博霉素表达宿主。因此，如能通过遗传操作手段对纤维堆囊菌进行改造以制备埃博霉素B高产工程菌株将可以促进高效抗癌新药的开发。

TALE是来自于植物致病细菌黄色单胞杆菌属的一类具有高度特异性的DNA结合蛋白(Sanjana NE,Cong L,Zhou Y,Cunniff MM,Feng G,Zhang F.A TAL effector toolboxfor genome engineering.Nature Protocols,2012,7:171-192.)，其特异性是由其重复单元中的重复可变区(Repeat Variable Diresidue,RVD)决定的。TALE元件主要包括TALEN元件和TALE-TF元件，TALE-TF元件由于其结合DNA的高度特异性和转录激活元件激活目的基因表达的特性广泛应用于哺乳动物细胞、酵母菌等宿主中目的基因的激活，而且取得了较好的效果。但目前TALE-TF技术尚未成功应用于纤维堆囊菌。

发明内容

发明人发现将TALE-TF元件应用于激活埃博霉素生物合成基因的表达能提升纤维堆囊菌埃博霉素生物合成效率，从而提高埃博霉素产量。

发明人之前从广东信宜土壤中分离得到了一株能生产埃博霉素的纤维堆囊菌Soce M4(GDIM 1.777)，并对纤维堆囊菌So ce M4埃博霉素生物合成基因启动子P3进行扩增。发明人发现通过利用TALE-TF元件靶向P3启动子序列能提升纤维堆囊菌埃博霉素生物合成效率。

因此，本发明的第一个目的是提供一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的TALE-TF载体及其构建方法。

本发明的提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的TALE-TF载体，其特征在于，是通过以下方法构建的：

根据纤维堆囊菌埃博霉素生物合成基因P3启动子核苷酸序列确定TALE-TF靶标序列，根据靶标序列构建TALE-TF元件，将编码TALE-TF元件的核苷酸序列***至载体PtalenR36中，然后用内切酶BamHI和SacI酶切该载体和上下游含有内切酶BamHI和SacI位点的VP64元件，再进行连接反应，使VP64元件代替FokI元件***到酶切位点BamHI和SacI之间，得到PTALE-VP64载体；用内切酶AscI和SpeI酶切PTALE-VP64载体和上下游含有内切酶AscI和SpeI位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动子代替pGPD启动子***到酶切位点AscI和SpeI之间，得到PTALE-VP64-P43重组载体即为提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的TALE-TF载体。

优选，所述的TALE-TF靶标序列如Seq ID No.5所示；

优选，所述的VP64元件是以VP64F和VP64R为引物，以pCDNA-dCas9/VP64载体为模板，经PCR扩增得到的；VP64F引物序列如Seq ID No.3所示，VP64R引物序列如Seq ID No.4所示；

优选，所述的P43启动子是以P43TALE F和P43TALE R为引物，以pBEP43载体为模板，经PCR扩增得到的；P43TALE F引物序列如Seq ID No.1所示，P43TALE R序列如Seq IDNo.2所示；

优选，所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌So ce M4。

本发明还提供一种产埃博霉素的纤维堆囊菌基因工程菌，其特征在于，是将所述的TALE-TF载体转入纤维堆囊菌So ce M4得到的。

发明人课题组前期从广东省信宜市土壤中分离得到纤维堆囊菌So ce M4，发现该菌能生产埃博霉素，但其产量相对较低。TALE-TF是一种能提升目的基因表达水平的转录调控元件。本发明构建了靶向埃博霉素生物合成基因启动子P3的TALE-TF元件，并将其通过电转化导入纤维堆囊菌So ce M4。通过荧光定量PCR分析埃博霉素生物合成基因的表达水平，并通过HPLC和LC-MS分析野生菌和重组菌中埃博霉素的产量。本发明提供了一种新型的通过转录调控提升纤维堆囊菌埃博霉素生物合成效率从而提高其埃博霉素产量的方法，从而为后期通过代谢工程手段大幅提高埃博霉素产量并降低埃博霉素的生产成本，促进埃博霉素作为原料药物在肿瘤治疗方面的应用。

本发明的纤维堆囊菌So ce M4埃博霉素生物合成基因P3启动子，其核苷酸序列已经公开于专利申请号为：201811486406.X，发明名称为：一种新型埃博霉素生物合成基因P3启动子及其制备方法和应用。

本发明的纤维堆囊菌So ce M4保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，其保藏编号为：GIM1.777，该菌株在本专利的申请日之前是对外销售的。

附图说明

图1为构建TALE-TF元件的测序验证图；

图2为靶向埃博霉素生物合成基因启动子的TALE-TF元件的载体：PTALEN R36；

图3为靶向重组载体构建的PCR验证图：其中，图A为将酶切后的VP64元件***至BamHI和SacI双酶切后的含有靶向P3启动子的TALE-TF元件的PtalenR36载体；lanes 1-10为不同菌落PCR产物鉴定；图B为将酶切后的P43启动子***酶切后的PTALE-VP64载体；lanes 1-4为不同菌落PCR产物鉴定；lane 5为阳性对照；

图4为PTALE-VP64-P43重组载体导入纤维堆囊菌So ce M4的导入验证图；

图5为荧光定量PCR分析埃博霉素生物合成基因epoA、epoC和epoK表达水平；其中dCas9-VP64代表转入pCDNA-dCas9/VP64载体的纤维堆囊菌So ce M4，RP3-TALE-VP64代表转入PTALE-VP64-P43重组载体纤维堆囊菌So ce M4；

图6为LC-MS分析野生纤维堆囊菌So ce M4和重组纤维堆囊菌So ce M4埃博霉素B产量图：A为产量对比分析图，其中So ce M4代表野生纤维堆囊菌So ce M4，TALE-So ce M4代表重组纤维堆囊菌So ce M4；B图、C图分别为为LC-MS分析野生纤维堆囊菌So ce M4和重组纤维堆囊菌So ce M4埃博霉素B。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

所用的G52液体培养基组分为：8g/L马铃薯淀粉，2g/L葡萄糖，2g/L大豆蛋白酶解物，2g/L酵母提取物，8mg/L EDTA铁钠，1g/L MgSO4.7H2O，1g/L CaCl2，0.5g/L Tris，溶剂为水，用盐酸调pH至7.4。

实施例1

靶向纤维堆囊菌So ce M4埃博霉素生物合成基因启动子TALE-TF元件载体(PTALE-VP64-P43重组载体)构建

在网站(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.htmL)上预测纤维堆囊菌So ce M4埃博霉素生物合成基因P3启动子的核心区域TGCGATCTTGTGATTCCCCTTCTGATCTTTAAAATTTCCCGATCCCCCAT，根据启动子序列寻找TALE-TF靶标，在核心区域选择靶标序列ATCTTGTGATTCCCCT(Seq ID No.5)，共16bp，根据靶标序列采用FastTALE TALEN试剂盒(上海斯丹赛生物科技有限公司)构建TALE-TF元件并进行测序验证(图1)，TALE元件单独模块是由34个氨基酸序列组成，由其第12个及13个氨基酸序列的不同而识别不同的碱基。可变区为NI时识别碱基A，可变区为NG时识别碱基T，可变区为NN时识别碱基G，可变区为HD时识别碱基C。然后将编码TALE-TF元件的核苷酸序列***至载体PtalenR36中(图2)。由于制备的含有靶向P3启动子的TALE-TF元件的PtalenR36载体中含有的是FokI元件，采用内切酶BamHI和SacI在37℃酶切该载体2h，双酶切去除FokI元件。然后以VP64 F(其序列如Seq IDNo.3所示)和VP64R(其序列如Seq ID No.4所示)为引物，以pCDNA-dCas9/VP64载体(Addgene，USA)为模板，扩增160bp左右的VP64元件，并在5’端引入BamHI酶切位点，在3’端引入SacI酶切位点，用BamHI和SacI在37℃酶切VP64片段10h，回收酶切产物。将酶切后的VP64片段和酶切后的含有靶向P3启动子的TALE-TF元件的PtalenR36载体以物质的量比(摩尔比)10：1在添加T4DNA连接酶条件下，于22℃连接3h。连接产物转化至DH5α感受态细胞，用Kana平板进行筛选。所得克隆扩大培养，用VP64F和VP64R进行菌液PCR验证(图3A)，所得160bp左右片段进行测序验证，即得到PTALE-VP64载体。

采用内切酶AscI和SpeI在37℃酶切PTALE-VP64载体1.5h，双酶切去除pGPD启动子。然后以P43TALE F(其序列如Seq ID No.1所示)和P43TALE R(其序列如Seq ID No.2所示)为引物，以pBEP43载体(华南理工大学郭勇教授惠赠)为模板，扩增367bp左右的P43启动子，并在5’端引入AscI酶切位点，在3’端引入SpeI酶切位点，用内切酶AscI和SpeI在37℃酶切P43启动子片段12h，回收酶切产物。将酶切后的P43启动子片段和酶切后的PTALE-VP64载体以物质的量比(摩尔比)10：1在添加T4DNA连接酶条件下，于22℃连接3h。连接产物转化至DH5α感受态细胞，用Kana平板进行筛选。所得克隆扩大培养，用P43TALE F和P43TALE R进行菌液PCR验证(图3B)，所得367bp左右片段进行测序验证，即得到PTALE-VP64-P43重组载体。

所采用引物如下所示：

实施例2

PTALE-VP64-P43重组载体导入纤维堆囊菌So ce M4及埃博霉素生物合成基因表达水平分析

采用电转化法将PTALE-VP64-P43重组载体导入至纤维堆囊菌So ce M4中，电转化条件为1.5kV，5.0ms。转化完毕立即加入6mLG52液体培养基中，30℃、150rpm恢复培养3h，加入PTALE-VP64-P43重组载体的菌液涂布至含有终浓度为50μg/ml Kan的G52平板上，37℃培养。挑取单克隆扩大培养，菌液PCR鉴定；用ColE1F和ColE1R通过ColE1复制子的扩增验证(图4A)，并进行测序验证，证实PTALE-VP64-P43重组载体成功导入纤维堆囊菌So ce M4，获得重组纤维堆囊菌So ce M4。采用Invitrogen蛋白提取试剂盒提取野生纤维堆囊菌So ceM4和重组纤维堆囊菌So ce M4的蛋白，离心后取上清，加入5×loading buffer制作SDS-PAGE样品。12％SDS-PAGE完成后转膜至NC膜。以1：5000稀释度加入anti-FLAG一抗(earthox,美国)，加入二抗，用ECL发光试剂盒进行自显影，以验证重组菌中TALE-TF元件的表达。结果如4B所示，重组纤维堆囊菌So ce M4中可检测到含有FLAG标签的目标TALE-VP64蛋白，大小约为110kDa，而野生纤维堆囊菌So ce M4中则没有此目标TALE蛋白。

所采用引物如下所示：

采用RNA提取试剂盒(Umagen,广州，中国)提取野生纤维堆囊菌So ce M4菌和重组纤维堆囊菌So ce M4的RNA，测定RNA浓度，并用DEPC水调整至相同浓度，采用Abm的逆转录试剂盒(Abm,加拿大)逆转录获得cDNA。

以野生纤维堆囊菌So ce M4和重组纤维堆囊菌So ce M4的cDNA为模板，设计埃博霉素生物合成基因epoA(epoA F和epoA R引物)、epoC(epoC F和epoC R引物)和epoK(epoKF和epoK R引物)的引物，荧光定量PCR退火温度为55℃，用QuantStudioTM 6Flex实时荧光定量PCR系统(Applied biosystems,Thermo scientific,USA)进行荧光定量PCR。以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定500bp左右的目标片段，并以GAPDH为内参基因，计算野生纤维堆囊菌Soce M4菌和重组纤维堆囊菌So ce M4菌中埃博霉素生物合成基因epoA,epoC和epoK的相对表达水平。结果表明，PTALE-VP64-P43重组载体的导入能显著提高纤维堆囊菌So ce M4中埃博霉素生物合成基因epoA,epoC和epoK的表达水平(图5)。PTALE-VP64-P43重组载体的导入能使epoA基因的表达水平提高14.89±2.36倍。本实施例所采用荧光定量PCR引物如下所示：

实施例3

野生纤维堆囊菌So ce M4和重组纤维堆囊菌So ce M4中埃博霉素产量的分析

将野生纤维堆囊菌So ce M4和重组纤维堆囊菌So ce M4以2％的接种量接种于含有5％经酸碱处理的XAD-16大孔吸附树脂的G52液体培养基中，于28℃，180rpm培养24h后，在培养基中分别加入终浓度为3mM的丙酸钠，于28℃，180rpm继续培养6天后用80％甲醇水溶液提取发酵产物，并采用旋转蒸发仪将最终产物浓缩至2.0mL。将产物进行过滤，上样至Agilent 6430高效液相色谱-质谱联用分析仪，并用埃博霉素B标准品(阿拉丁，上海)进行对比分析。所采用流动相为80％甲醇水溶液，流速为0.5mL/min。所采用色谱柱为C18柱(2.1×100mm,3.5μm，岛津，日本)。

根据离子峰面积计算埃博霉素的产量。埃博霉素B对应的离子峰为508.2，LC-MS检测结果表明，野生纤维堆囊菌So ce M4中埃博霉素B的产量为4.52±0.18mg/L，导入PTALE-VP64-P43重组载体的重组纤维堆囊菌So ceM4中埃博霉素B的产量为17.58±0.86mg/L(图6A)。PTALE-VP64-P43重组载体的导入能使埃博霉素B的产量提高2.89倍。野生纤维堆囊菌So ce M4和重组纤维堆囊菌So ce M4中埃博霉素B LC-MS分析图谱结果如图6B所示。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的TALE-TF载体及其构建方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ttggcgcgcc ggcggaattc tgataggtg 29

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cggactagtc gcaagcttaa ccttgaag 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cgcggatccg aacttcccat cgagtcgc 28

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cgagctctta gggggggggg agggag 26

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 纤维堆囊菌(Sorangium celluloseSo ce M4)

<400> 5

atcttgtgat tcccct 16