阅读说明：本技术 酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用 (Yeast two-hybrid vector, construction method and application thereof in protein interaction ) 是由 言普 沈文涛 庹德财 黎小瑛 周鹏 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,特别涉及酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用。该酵母双杂交载体包括：pNC-GADT7载体和pNC-GBKT7载体；所述pNC-GADT7载体于pGADT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框；所述pNC-GBKT7载体于pGBKT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框。该Nimble Cloning的酵母双杂交载体,以方便目标基因克隆到载体。具有操作简单、克隆效率高、可标准化克隆等优点。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to a yeast two-hybrid vector, a construction method and application thereof in protein interaction. The yeast two-hybrid vector comprises: pNC-GADT7 vector and pNC-GBKT7 vector; the pNC-GADT7 vector inserts a Nimble Cloning frame into the pGADT7 vector at the Cloning site; the pNC-GBKT7 vector was inserted into a Nimble Cloning frame at the Cloning site of the pGBKT7 vector. The yeast two-hybrid vector of Nimble Cloning is used to facilitate the Cloning of target genes into the vector. Has the advantages of simple operation, high cloning efficiency, standardized cloning and the like.)

酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用。

背景技术

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。

酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。目前使用的酵母双杂交载体主要是基于酶切-连接和Gateway这两种克隆技术，存在操作繁琐或试剂昂贵等问题。

因此，提供一种操作简单、克隆效率高、可标准化克隆的酵母双杂交载体具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用。本发明构建了一套基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体。使用该套载体，可利用NimbleCloning克隆技术将目标基因克隆到载体上，进而用于蛋白互作研究。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了酵母双杂交载体，包括：pNC-GADT7载体和pNC-GBKT7载体；

所述pNC-GADT7载体于pGADT7载体的克隆位点处***Nimble Cloning克隆框；

所述pNC-GBKT7载体于pGBKT7载体的克隆位点处***Nimble Cloning克隆框；

所述Nimble Cloning克隆框由如SEQ ID No.1所示的第一接头序列、SfiI酶切位点、ccdB基因、SfiI酶切位点和如SEQ ID No.2所示的第二接头序列依次连接组成。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的酵母双杂交载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：根据酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7的克隆位点处的序列，分别扩增获得***到pGADT7的Nimble Cloning克隆框AD-NC和***到pGBKT7的Nimble Cloning克隆框BD-NC；

步骤2：取pGADT7经NdeI和XhoI双酶切，回收的线性化载体pGADT7与AD-NC混合，反应产物转化大肠杆菌DB3.1感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得含NC克隆框的酵母双杂交载体pNC-GADT7；

步骤3：取pGBKT7经NdeI和PstI双酶切，回收的线性化载体pGBKT7与BD-NC混合，反应产物转化大肠杆菌DB3.1感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得含NC克隆框的酵母双杂交载体pNC-GBKT7。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中扩增获得***到pGADT7的NimbleCloning克隆框AD-NC的引物组包括如SEQ ID No.3所示的正向引物NC-ADF以及如SEQ IDNo.4所示的逆向引物NC-ADR；

步骤1中扩增获得***到pGBKT7的Nimble Cloning克隆框BD-NC的引物组包括如SEQ ID No.5所示的正向引物NC-BDF以及如SEQ ID No.6所示逆向引物NC-BDR。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述扩增的条件为：94℃2分钟；再94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环；最后72℃延伸5分钟。

本发明还提供了所述的酵母双杂交载体或所述构建方法获得的酵母双杂交载体在蛋白互作研究中的应用。

在上述研究的基础上，本发明提供了不同蛋白互作的鉴定方法，以所述的酵母双杂交载体或所述构建方法获得的酵母双杂交载体作为克隆载体，步骤包括：

步骤1、分别扩增获得所述不同蛋白的基因；

步骤2、分别将所述不同蛋白的基因、所述克隆载体和Nimble Mix混合后反应，反应产物转化感受态细胞，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，分别获得含有不同蛋白基因的重组质粒；

步骤3、转化酵母感受态细胞并使用选择培养基培养，若转化菌株均能生长，表明所述不同蛋白之间发生互作，否则，所述不同蛋白不能发生互作。

在本发明的一些具体实施方案中，提供的鉴定方法所述步骤2中的反应为50℃反应1h；

所述Nimble Mix包含SfiI限制性内切酶、T5核酸外切酶和Phusion DNA聚合酶；

步骤2中所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞；

步骤3中所述感受态细胞为酵母AH109感受态细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述基因包括murine p53基因、SV40large T-antigen基因和Human lamin C基因；

扩增所述murine p53基因的引物组包括如SEQ ID No.7所示的正向引物BD-53F以及如SEQ ID No.8所示的逆向引物BD-53R；

扩增所述Human lamin C基因的引物组包括如SEQ ID No.9所示的正向引物BD-LamF以及如SEQ ID No.10所示逆向引物BD-LamR；

扩增所述SV40 large T-antigen基因的引物组包括如SEQ ID No.11所示的正向引物AD-TF以及如SEQ ID No.12所示的逆向引物AD-TR。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述扩增的反应条件为：94℃2分钟；再94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒，30个循环；最后72℃延伸5分钟。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述选择培养基为SD/-Leu/-Trp和/或SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade。

具体的，将回收的murine p53和Human lamin C分别与pNC-GBKT7混合，SV40large T-antigen与pNC-GADT7混合，加入Nimble Mix(海南壹田生物有限公司)，50℃反应1h。反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得的重组质粒分别命名为pNC-BD-53、pNC-BD-Lam和pNC-AD-T。

将质粒组合pNC-AD-T和pNC-BD-53、pNC-AD-T和pNC-BD-Lam，以及用于对比的pAD-T和pBD-53、pAD-T和pBD-Lam转化酵母AH109感受态细胞。转化步骤为：取100μl冰上融化的感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-1μg，鲑鱼精DNA 10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)；将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)；5000rpm离心40s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清；ddH2O 100μl重悬，分别取50μl涂SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板，29℃培养48-96h。转化结果见图5，在二缺SD/-Leu/-Trp平板上，4个组合的转化菌株均能生长，且基于NimbleCloning的pNC组合与对照组合没有差异；在四缺SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板上，pNC-AD-T和pNC-BD-53，以及pAD-T和pBD-53的转化菌株能生长，表明目标蛋白SV40 large T-antigen和murine p53发生互作，而pNC-AD-T和pNC-BD-Lam，以及pAD-T和pBD-Lam的转化菌株不能生长，表明目标蛋白SV40 large T-antigen和Human lamin C不能发生互作。

本发明构建了一套基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体，以方便目标基因克隆到载体。具有操作简单、克隆效率高、可标准化克隆等优点。

Nimble Cloning和Gibson克隆操作的主要区别在于，Nimble Cloning直接使用环状质粒，而Gibson克隆需要先将环状质粒进行线性化酶切，回收后才能用于克隆反应。两种克隆方式的克隆效率见图6，3个目标基因的克隆中，Nimble Cloning的克隆效率均高于Gibson克隆。因此，使用基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体，不仅操作简单，而且克隆效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示NC克隆框的扩增；其中，M：DNA marker；1：AD-NC；2：BD-NC；

图2示pNC-GADT7的图谱；其中，NC Frame为适用于Nimble Cloning的NC克隆框；

图3示pNC-GBKT7的图谱；其中，NC Frame为适用于Nimble Cloning的NC克隆框；

图4示用于酵母双杂交的基因的扩增；其中，1：murine p53；2：Human lamin C；3：SV40 large T-antigen；M：DNA marker；

图5示基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体用于蛋白互作研究；

图6示基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体两种克隆方式的克隆效率比较。

具体实施方式

本发明公开了酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明构建了一套基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体。使用该套载体，可利用Nimble Cloning克隆技术将目标基因克隆到载体上。

具体的，本发明以酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7为框架，设计两对引物，分别PCR扩增NC克隆框，并将NC克隆框分别***到pGADT7和pGBKT7的多克隆位点处，获得一套基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体pNC-GADT7和pNC-GBKT7。

使用该套载体，可利用Nimble Cloning克隆技术将目标基因克隆到载体上，进而用于蛋白互作研究。

图5示本专利申请的载体与现在载体平行使用(对比)的情况，结果是它们在蛋白互作研究中的表现一致，其目的是要证明现有载体经改造后的载体在蛋白表达上的表现没有影响。而本专利申请的载体的特点是它们具有Nimble Cloning的克隆框序列，可以使用Nimble Cloning将目标基因克隆到载体上。本专利申请的载体与现在载体的优势在于克隆方法上的优势，包括操作简单、克隆效率高、可标准化克隆等优点。

本发明提供的酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体的构建

本发明提供的Nimble Cloning克隆框由如SEQ ID No.1所示的第一接头序列、SfiI酶切位点、ccdB基因、SfiI酶切位点和如SEQ ID No.2所示的第二接头序列依次连接组成。

1.1NC克隆框的扩增

根据酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7的克隆位点处的序列，设计两对引物(表1)，其中引物对NC-ADF和NC-ADR用于扩增***到pGADT7的NC克隆框AD-NC，引物对NC-BDF和NC-BDR用于扩增***到pGBKT7的NC克隆框BD-NC。PCR扩增以含NC克隆框的质粒pNC-UC为模板，使用高保真酶PrimeSTAR(大连宝生物)，反应条件为：94℃2分钟；再94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环；最后72℃延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。电泳结果显示扩增获得位于500bp和750bp之间的2个条带，与预期大小符合。将扩增条带进行回收，回收利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(大连宝生物)，按照说明书进行。

表1引物序列

1.2NC克隆框***到载体克隆位点处

将pGADT7使用NdeI和XhoI进行双酶切，pGBKT7使用NdeI和PstI进行双酶切，反应条件为37℃1h。酶切后进行琼脂糖凝胶电泳和回收。回收后的线性化载体pGADT7与AD-NC混合，pGBKT7与BD-NC混合，加入Gibson克隆反应液(NEB)后50℃1h。反应产物转化大肠杆菌DB3.1感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得含NC克隆框的酵母双杂交载体pNC-GADT7和pNC-GBKT7。pNC-GADT7和pNC-GBKT7的图谱分别见图2和图3。

实施例2基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体在蛋白互作研究中的应用

本发明选用的是酵母双杂交系统中常用的对照蛋白，murine p53和SV40large T-antigen互作，作为阳性；Human lamin C和SV40 large T-antigen不互作，作为阴性。

2.1目标基因的扩增

根据用于酵母双杂交实验阳性和阴性对照的3个基因murine p53、Human lamin C和SV40 large T-antigen的核酸序列，设计3对引物(表1)，其中BD-53F和BD-53R用于扩增克隆到pNC-GBKT7的murine p53基因，BD-LamF和BD-LamR用于扩增克隆到pNC-GBKT7的Human lamin C基因，AD-TF和AD-TR用于扩增克隆pNC-GADT7的SV40 large T-antigen基因。3对引物分别以含目标基因的质粒pGBKT7-53(pBD-53)、pGBKT7-Lam(pBD-Lam)和pGADT7-T(pAD-T)为模板，使用高保真酶PrimeSTAR(大连宝生物)，反应条件为：94℃2分钟；再94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒，30个循环；最后72℃延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4。电泳结果显示扩增获得与预期大小符合的目标条带。将扩增条带进行回收，用于后续克隆反应。

2.2目标基因克隆到载体

由于pNC-GADT7和pNC-GBKT7是基于Nimble Cloning的载体，因此可以采用简单、高效的Nimble Cloning技术将目标基因克隆到载体。将上述回收的murine p53和Humanlamin C分别与pNC-GBKT7混合，SV40 large T-antigen与pNC-GADT7混合，加入Nimble Mix(海南壹田生物有限公司)，50℃反应1h。反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得的重组质粒分别命名为pNC-BD-53、pNC-BD-Lam和pNC-AD-T。

2.3转化酵母

将质粒组合pNC-AD-T和pNC-BD-53、pNC-AD-T和pNC-BD-Lam，以及用于对比的pAD-T和pBD-53、pAD-T和pBD-Lam转化酵母AH109感受态细胞。转化步骤为：取100μl冰上融化的感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-1μg，鲑鱼精DNA 10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)；将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)；5000rpm离心40s弃上清，ddH₂O 400μl重悬，离心30s弃上清；ddH₂O 100μl重悬，分别取50μl涂SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板，29℃培养48-96h。转化结果见图5，在二缺SD/-Leu/-Trp平板上，4个组合的转化菌株均能生长，且基于Nimble Cloning的pNC组合与对照组合没有差异；在四缺SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板上，pNC-AD-T和pNC-BD-53，以及pAD-T和pBD-53的转化菌株能生长，表明目标蛋白SV40 large T-antigen和murine p53发生互作，而pNC-AD-T和pNC-BD-Lam，以及pAD-T和pBD-Lam的转化菌株不能生长，表明目标蛋白SV40 large T-antigen和Human lamin C不能发生互作。

实施例3基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体两种克隆方式的克隆效率比较

利用基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体pNC-GADT7和pNC-GBKT7，目标基因选用murine p53、Human lamin C和SV40 large T-antigen，分别采用Nimble Cloning和目前广泛使用的Gibson克隆，将目标基因克隆到载体，比较它们的克隆效率。两种克隆方法的引物设计相同，均为表1所列序列。Nimble Cloning的操作同2.2所述。Gibson克隆的操作为，先将载体pNC-GADT7和pNC-GBKT7用SfiI酶切，酶切反应条件为50℃酶切1h，随后进行琼脂糖凝胶电泳回收；回收的线性化载体分别与目标基因片段混合，加入Gibson Mix(NEB)，50℃反应1h，反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，过夜培养后统计菌落数量，计算克隆效率。Nimble Cloning和Gibson克隆操作的主要区别在于，Nimble Cloning直接使用环状质粒，而Gibson克隆需要先将环状质粒进行线性化酶切，回收后才能用于克隆反应。两种克隆方式的克隆效率见图6，3个目标基因的克隆中，Nimble Cloning的克隆效率均高于Gibson克隆。因此，使用基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体，不仅操作简单，而且克隆效率高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用

<130> MP1924847

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtggtctc tgtccagtcc t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggtctcagc agaccacaag t 21

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacgtacca gattacgctc atcagtggtc tctgtccagt cct 43

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtttttcag tatctacgat tcacggtctc agcagaccac aagt 44

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctcagagga ggacctgcat cagtggtctc tgtccagtcc t 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaaggggtt atgctagtta cggtctcagc agaccacaag t 41

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtggtctct gtccagtcct cctgtcaccg agacccctgg 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtctcagca gaccacaagt tcagtctgag tcaggcccca 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtggtctct gtccagtcct tctgaagagg tggtcagccg 40

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtctcagca gaccacaagt ttagtcaatc tccaccagtc gg 42

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agtggtctct gtccagtcct ggaactgatg aatgggagc 39

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtctcagca gaccacaagt ttatgtttca ggttcagggg g 41