阅读说明：本技术 在工业工艺中快速检测细菌孢子的方法 (Method for rapidly detecting bacterial spores in industrial process ) 是由 L·伦德 L·赖斯 于 2017-07-12 设计创作，主要内容包括：描述一种通过测量随时间变化的微生物代谢活性来检测细菌孢子存在的方法。通过检测指示孢子萌发的代谢活性的爆发,将孢子与营养细胞和其它微生物区分开来。这种方法可用于在典型工作班次的时间范围内检测诸如造纸系统的商业工艺系统中的细菌孢子。(A method for detecting the presence of bacterial spores by measuring the metabolic activity of the microorganism over time is described. Spores are distinguished from vegetative cells and other microorganisms by detecting bursts of metabolic activity indicative of spore germination. This method can be used to detect bacterial spores in commercial process systems, such as paper making systems, over the time frame of a typical work shift.)

在工业工艺中快速检测细菌孢子的方法

相关申请的交叉引用

本申请作为PCT国际专利申请于2017年7月12日提交，并且与本申请同时(在中国受理局)提交的美国专利申请“一种用于检测细菌孢子的快速方法”序列号(律师代理案号：00163.3220W001)所公开的主题有关，其主题通过引用并入本申请。

背景技术

内生孢子是由厚壁菌门中的特定细菌种类产生的休眠、坚韧、非生殖结构。当处于营养状态的细菌细胞受到胁迫或缺乏营养时，就会产生内生孢子或孢子。内生孢子具有非常低的代谢率，并因此不能通过典型地用于快速检测营养细菌细胞的方法进行检测。进一步地，孢子极难杀死，因为它们进化成能在诸如UV、热、消毒剂、干燥和饥饿等恶劣条件下生存。一旦暴露于有利的条件和营养下，所述孢子萌发产生营养细胞。

产孢子细菌是有问题的，因为它们会引起人类和动物疾病、食品和饮料变质并导致生物膜的持久化。引起特别关注的产孢子细菌菌株是在芽孢杆菌和梭状芽胞杆菌属中的产孢子细菌菌株。两者都是革兰氏阳性、杆状细菌，其包括对人类有害的种类。炭疽杆菌产生炭疽毒素，并且蜡状芽孢杆菌引起食品中毒。肉毒梭菌引起肉毒中毒(也被称为肉毒杆菌素)，艰难梭菌引起腹泻，产气荚膜梭菌引起食品中毒，并且破伤风杆菌引起破伤风。蜡状芽孢杆菌是最成问题的细菌之一，因为它已经被鉴定为对用于净化环境表面的杀菌化学品具有更高的抵抗力。

蜡状芽孢杆菌经常被诊断为胃肠道紊乱的病因，并已经被认为是多种食源性疾病发作的病因。由于蜡状芽孢杆菌具有快速的孢子形成能力，因此它很容易在环境中存活。这种细菌可以直接和间接污染食品。蜡状芽孢杆菌可以直接经由粪便和土壤污染生乳，并且可以在牛的肠道和巴氏灭菌工艺中存活。液体和食品包装中蜡状芽孢杆菌孢子的存在可以间接污染。与食品直接接触的材料中存在的孢子可以使孢子迁移到食品中，从而导致腐败。

考虑到人类摄入这些细菌的负面影响，政府机构制定了旨在减少孢子存在的标准或准则。当前的孢子检测方法需要48小时完成。测试用于细菌孢子的最常见方法是电镀技术。对于多种工业来说，这种两天的延迟是不切实际的。在产品测试的情况下，两天的延迟需要检疫大量产品，直到测试结果完成。例如，在造纸或纸板工业中，这是一个问题。

同样地，在测试食品和饮料加工设备时，仅定期拆除设备进行清洁，实际上不能保持离线两天。在等待诊断鉴定一例已经感染了梭状芽胞杆菌的患者已经出院后病房表面上存在孢子的测试结果时，医院不能让病房空置两天。而且在检疫下保持食品或水的数量是不切实际的，尤其是在等待期间水或液体不断变化的地方(例如，在牛奶加工期间冷却塔水、饮料、牛奶)食品可能变质。

在此背景下做出了本公开。

发明内容

一般而言，本发明涉及快速检测细菌孢子并将其与营养细胞区分开来的方法。

一方面，本发明提供一种检测样品中的细菌孢子并将其与营养细胞和其它微生物区分开来的方法。制备供测试细菌孢子的存在的样品。测量样品中微生物代谢活性的基线水平。在启动萌发的条件下孵育样品，并监测样品中随后的微生物代谢活性的水平。在孵育约5至约8小时后，检测样品中是否存在微生物代谢活性的爆发。

在一些方面，检测样品中的细菌孢子并将其与营养细胞和其它微生物区分开来的方法包括附加步骤。在一些实施例中，制备样品包括收集包含未知量的孢子、营养细胞或孢子和营养细胞两者的样品。分解样品并放置在盘或容器中。

在一些方面，从硬表面、液体、浆液(淀粉、碳酸盐、粘土或TiO₂)或纸制品中收集样品。在一些实施例中，从硬表面收集样品，诸如食品和饮料加工设备、管道、储罐、蒸发器、喷嘴、乳品加工设备、储奶罐、牛奶车、挤奶设备、工作台面、烹调器具表面、浴室表面(诸如洗脸盆和马桶把手)、照明开关面板、门把手、呼叫按钮、电话手柄、遥控器、台式机、患者围栏、抓杆、手术器械、造纸厂内的设备(包括管道、箱、压头箱、断流塔、节约装置叶片以及成型网)。在其它实施方案中，样品取自于液体，诸如工艺水、进水、冷却塔水、处理和未处理废水、纸料、稀原料和稠原料、白水、吸水箱水、塔盘水、水果和蔬菜水槽水、蛋白质工艺水、水培水或海鲜养殖水以及农业用水。在其它实施例中，样品取自于诸如用于食品接触和非食品接触等级的成品纸制品和成品板制品的纸制品；用于手术或医疗用途的盖布；无菌包装容器；塑料食品和饮料容器；食品罐；铝和PET饮料容器；袋、薄膜以及气调包装。

在一些实施例中，样品中的营养细胞被灭活。在此类实施例中，可以通过在约80℃至约110℃的温度下加热样品约5至15分钟使营养细胞灭活。

在一些实施例中，通过测量三磷酸腺苷(ATP)确定微生物代谢活性。在此类实施例中，可以通过将荧光素酶和荧光素添加到样品中并以相对光单位(RLU)测量光发射来测量ATP。ATP也可以通过HPLC测量。在其它实施例中，通过代谢染料检测微生物代谢活性。

在一些实施例中，孵育样品涉及向样品提供营养液体培养基和萌发增强剂。任选地添加杀生物剂中和剂。在约30℃至约45℃的温度下孵育样品。在一些方面，营养液体培养基是2X营养液体培养基，并且萌发增强剂是L-丙氨酸。

在一些方面，通过向样品中添加荧光素酶和荧光素并在8小时孵育期间的多个时间点测量光发射来监测样品的微生物代谢活性。在一些实施例中，测量每小时发生一次。

在一些方面，孵育后，当在样品中测量到比样品的初始测量值高至少10倍的微生物代谢活性时，检测到微生物代谢活性的爆发发生。检测到该爆发导致确定样品中存在孢子。在一些实施例中，所述方法可以在制备样品的8小时内确定样品中是否存在细菌孢子，并且将孢子与营养细胞区分开来。

在一些方面，所述方法进一步包括基于是否存在孢子、营养细胞或孢子和营养细胞两者来选择抗微生物处理。在这种方面，当检测到孢子时，抗微生物处理可以选自由二氧化氯、臭氧、戊二醛、次氯酸钠、过酸、UV、极热和辐射组成的组。当仅检测到营养细胞时，抗微生物处理选自由异噻唑啉、戊二醛、二溴氮基丙酰胺、氨基甲酸酯、季铵化合物、次氯酸钠、二氧化氯、过乙酸、臭氧、氯胺、溴-磺酸盐、溴-氯-二甲基乙内酰脲、二氯-二甲基乙内酰脲、一氯胺、与铵盐和稳定剂(包括二甲基乙内酰脲氨基酸、氰尿酸、琥珀酰亚胺和尿素)结合使用的次氯酸钠及其组合组成的组。在一些实施例中，所述方法进一步包括将选择的抗微生物处理物施加到硬表面、液体或纸制品上。

在一个实施例中，一种检测细菌孢子并将其与营养细胞和其它微生物区分开来的方法开始于从硬表面、液体或纸制品选取具有未知量的营养细胞和孢子的样品。所述样品可以取自于硬表面(诸如食品和饮料加工设备、管道、储罐、蒸发器、喷嘴、乳品加工设备、储奶罐、牛奶车、挤奶设备、工作台面、烹调器具表面、浴室表面(诸如洗脸盆和马桶把手)、照明开关面板、门把手、呼叫按钮、电话手柄、遥控器、台式机、患者围栏、抓杆、手术器械、造纸厂内的设备(包括管道、箱、压头箱、断流塔、节约装置叶片以及成型网)。样品还可以取自于液体，诸如工艺水、进水、冷却塔水、处理和未处理废水、纸料、稀原料和稠原料、白水、吸水箱水、塔盘水、水果和蔬菜水槽水、蛋白质工艺水、水培水或海鲜养殖水以及农业用水。并且样品可取自于诸如用于食品接触和非食品接触等级的成品纸制品和成品板制品的纸制品；用于手术或医疗用途的盖布；无菌包装容器；塑料食品和饮料容器；食品罐；铝和PET饮料容器；袋、薄膜以及气调包装。通过在约80℃至约110℃、约85℃至约105℃或约90℃至约100℃的温度下加热样品约5至15分钟、7至13分钟或9至11分钟使样品中的营养细胞灭活。通过测量样品中的ATP水平确定代谢活性的基线水平。通过向样品中添加荧光素酶和荧光素并以RLU测量光发射来测量ATP水平。将样品在约30℃至约45℃的温度下与2X营养液体培养基和L-丙氨酸萌发增强剂一起孵育至启动萌发。通过向样品中添加荧光素酶和荧光素并在8小时孵育期间的多个时间点测量光发射来监测样品的微生物代谢活性。孵育约5至约8小时后，比基线水平高至少10倍的微生物代谢活性的爆发的存在表明存在孢子。不存在微生物代谢活性的爆发表明不存在孢子。如果检测到孢子，则选择抗微生物处理以处理孢子，并将其施加到硬表面、液体或纸制品中。如果未检测到孢子，则选择抗微生物处理以处理营养细胞，并将其施加到硬表面、液体或纸制品中。

附图说明

图1是在无热处理、无萌发增强剂以及无营养物的工业水样品中随时间变化的产生ATP的图表。

图2是在无热处理、有萌发增强剂以及无营养物的工业水样品中随时间变化的产生ATP的图表。

图3是在无热处理、有萌发增强剂以及有营养物的工业水样品中随时间变化的产生ATP的图表。

图4A是在有热处理、有萌发增强剂以及有营养物的工业水样品中随时间变化的产生ATP(以RLU表示)的图表。

图4B是在有热处理、有萌发增强剂以及有营养物的工业水样品中产生ATP(以RLU生产随时间变化的商表示)的图表。

图5是在经热处理、有萌发增强剂以及有营养物的7种工业水样品中产生ATP的时程图。

具体实施方式

本公开涉及检测细菌孢子的方法。具体地，实施例涉及一种快速地将细菌孢子的存在与其它微生物的存在区分开来并确定孢子污染源的方法。此外，本公开区分了孢子形成细菌的营养状态和孢子状态。

提供以下定义以确定如何解释在本申请中使用的术语，并且具体地是如何解释权利要求。这些定义的组织仅为了方便起见，并非旨在将任何定义限制为任何特定类别。

如本文所使用，术语“细菌孢子”或“内生孢子”是指通过一些种类的细菌(诸如芽孢杆菌和梭状芽胞杆菌种类)产生的结构。孢子能够使细菌在恶劣的条件下(诸如极端温度、干旱和化学处理)保持休眠。

如本文所使用，术语“萌发”是指来自休眠细菌孢子的营养细胞的生长。当孢子暴露在营养细胞生长的有利条件下时发生萌发。

如本文所使用，术语“营养细菌细胞”是指生长活跃、表现出代谢活性和***的细菌细胞。

如本文所使用，术语“杀生物剂”是指旨在通过化学或生物手段破坏或中和任何有害微生物的化学物质或微生物。杀生物剂可包括防腐剂、杀虫剂、消毒剂和农药，其用于控制有害于人类或动物健康或对天然或制成品造成损害的有机体。

如本文所使用，术语“杀孢子剂”是指具有引起蜡状芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的孢子群体减少大于90％(1-log降阶)的能力的物理或化学试剂或工艺。优选地，本公开的杀孢子组合物提供大于99％的减少(2-log降阶)，更优选大于99.99％的减少(4-log降阶)，并且最优选大于99.999％的减少(5-log降阶)。

术语“检疫”是指分离和隔离可能被或可能不被微生物污染或感染的物体。

如本文所使用，术语“快速检测”是指在少于48小时内检测细菌和细菌孢子的方法。优选地，“快速检测”是指在少于24小时内检测细菌。最优选地，“快速检测”是指在少于12小时内检测细菌。

如本文所使用，术语“工艺水”是与技术厂和生产工艺结合使用的水。工艺水被认为是不可饮用的，并且被用于促进制造工艺。

术语“三磷酸腺苷”(ATP)是指用于在细胞内传输化学能量的分子。ATP包含腺嘌呤、核糖和三个磷酸基团。ATP分解为二磷酸腺苷(ADP)和磷酸盐以释放能量。

如本文所使用，术语“微生物”是指单细胞或多细胞的微观有机体。这些有机体可能包括细菌、病毒、真菌和藻类。

如本文所使用，术语“代谢活性”是指在活体中发生的化学反应。

如本文所使用，术语“生物发光”是指由活体生产和发射的光。荧光素酶催化荧光素的氧化，产生光。

如本文所使用，术语“高效液相色谱法”(HPLC)是指用于分离、鉴定和定量混合物中的每种组分的分析化学技术。

如本文所使用，术语“阳离子”是指带正电的离子。

如本文所使用，术语“休眠”是指具有悬浮一段时间的正常物理功能的有机体。

如本文所使用，术语“菌落形成单位”(CFU)是指样品中活细菌或真菌细胞数量的估计值。活细胞能够在受控条件下繁殖。提供CFU作为用于液体的CFU/mL或用于固体的CFU/g的测量。

如本文所使用，术语“相对光单位”(RLU)是指由光度计测量的光量。

如本文所使用，术语“萌发条件”是指有利于细菌孢子(内生孢子)的活化、萌发和生长的条件。

在多种工业中，检测细菌和细菌孢子的存在是重要的。当涉及人类健康时，指南指定了可能存在的最大细菌量。例如，“乳品商标准”提供了每克用于乳制品的纸或纸板中可能存在的菌落形成单位(CFU)数量的要求。从待测纸或纸板上切割样品，并将其放置在密封的包膜中。然后将样品切割成小方块，并存放在无菌搅拌器中。将无菌磷酸盐稀释水添加到搅拌器中的切碎的纸样品中，以帮助分解样品。分解后立即将样品转移到一个或多个培养皿中。将融化的琼脂倒入培养皿中的样品上，并使其凝固。凝固后，将平板在36℃下孵育48小时。孵育后，用菌落计数器检查平板中CFU的存在和数量。

工业指南限制与乳制品一起使用的纸或纸板产品上存在的菌落形成单位(CFU)的数量为每克少于250个。一些最终用户可能需要或多或少的严格的依从性(<100->1000CFU/g)。为了符合乳品、食品和医疗保健工业的孢子指南，重要的是在它们处于最脆弱、营养状态时检测并适当地处理可以形成孢子的细菌。

孢子由多个保护层组成，所述保护层使其对氧化和化学侵蚀具有抗性。杀死孢子需要比营养细胞更高的杀生物剂剂量。将杀生物剂施加到活性的营养细胞始终更为有效。孢子控制程序必须足够强壮以侵蚀处于营养状态的细胞并防止孢子形成。剂量必须足够高以在它们发育成孢子前杀死营养细胞。

检测微生物的一种方法取决于测量微生物的活性。可以使用三磷酸腺苷(ATP)浓度作为活性指标来测量微生物的活性。微生物的活性也可以使用代谢染料测量，所述代谢染料包括氧化还原染料(例如刃天青和2-(对碘苯基)-3-(对硝基苯基)5-苯基氯化四唑(INT))、荧光氧化还原染料(例如5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑(CTC)和酶活性指标(例如，羧乙酸二乙酸酯)。

三磷酸腺苷(ATP)测量已用于在各种工业中检测微生物。细胞将ATP用作能量来源，并且是代谢活性的指标。可以在营养细菌中测定ATP，但细菌孢子几乎不包含或不包含ATP。

通常，ATP水平通过生物发光测定测量，所述生物发光测定涉及与用光度计定量的荧光素酶的反应。其它方法包括利用甘油的磷酸化作用和高效液相色谱(HPLC)的比色法或荧光法测定。

在利用生物发光的方法中，来自萤火虫的荧光素酶和荧光素在氧的存在下与具有阳离子(诸如镁)的样品混合。如果存在ATP，将在产生光的氧化反应中引起荧光素酶(底物)和荧光素(催化剂)之间的反应。用光度计检测光发射，并以相对光单位(RLU)报告。产生的光量与存在的微生物的代谢活性成正比，但不表明存在的有机体的数量。荧光素酶/荧光素反应在本领域中是众所周知的，并且有必要试剂的商业来源以及其使用的方案。例如，多种荧光素酶/荧光素试剂连同荧光素酶可从例如美国普洛麦格公司(Promega Corp.)(麦迪逊，威斯康辛州)和超璐明科技有限公司(LuminUltra)(弗雷德里顿，新不伦瑞克省)的商业试剂盒中获得。市售荧光素酶包括萤火虫荧光素酶(Photinus pyralis，“Ppy荧光素酶”)。纯化的甲虫荧光素也可从普洛麦格商业获得。

根据本公开，当将孢子放置到包含萌发增强剂的营养液体培养基中并孵育时，孢子将萌发成营养细菌。在萌发期间，ATP生产将快速增加，并且对ATP活性峰的测量将提供存在孢子萌发的指示。此外，取决于样品中孢子的浓度，该工艺在孵育约5至8小时的相对短的时间内发生。任选地，包含高水平营养细胞的样品在测试方案的早期表现出高ATP值，通常在第一个小时内。由于残留杀生物剂的存在，样品中的ATP可能会随着孵育的延长而降低。可以利用杀生物剂中和溶液的使用。

可以通过在添加营养物和萌发增强剂前测量样品中的初始ATP，并然后在测定的孵育时间内定期测量ATP来直接观察孢子的萌发。在此期间，营养细胞产生稳定水平的ATP，而孢子则表现出ATP生产的爆发，这可以在测定中5至8小时进行测量，取决于样品中孢子存在的浓度。在100-200CFU/mL范围内的孢子浓度将在7至8小时之间产生ATP爆发，而在1,000-100,000CFU/mL的高孢子浓度将在约5小时表现出ATP爆发。

在一些样品中，高水平的营养细菌细胞可能会模糊萌发孢子的ATP读数。为了缓和这种情况，在测定开始时可以包括在80至95℃下的任选的10至15分钟的加热步骤。该加热步骤使营养细胞灭活，从而消除了它们对ATP水平的影响。同时，孢子在休眠状态下可以在高温下生存。添加营养物和萌发增强剂后，孢子将然后产生ATP爆发(如果存在)。

为了在工业工艺中实施这种用于快速检测细菌孢子的方法，必须首先制备样品，所述样品将被测试细菌孢子的存在。样品可以从任何可能被细菌孢子污染的来源中收集。样品可能被细菌孢子污染、被营养细菌细胞污染，或未被细菌孢子和营养细菌细胞两者污染，或被细菌孢子和营养细菌细胞两者污染。样品可以取自于硬表面、浆液(淀粉、碳酸盐，粘土或TiO₂)、原料纤维、食品或饮料产品、液体或包装或纸板产品样品。

具有硬表面的设施的非限制性实例包括食品和饮料厂、乳品厂、农场和乳制品厂、酿酒厂、乙醇厂、全方位服务和速食餐厅、杂货店、仓库和零售店、商业或办公空间、酒店、汽车旅馆、医院、造纸厂、工业制造厂(包括汽车厂)、冷却塔、水处理厂、炼油厂、油气田和管道以及钻井平台。硬表面的实例包括食品和饮料加工设备(包括管道、储罐、蒸发器、喷嘴等)、乳品加工设备、储奶罐、牛奶车、挤奶设备、工作台面、烹调器具表面、浴室表面(诸如洗脸盆和马桶把手)、照明开关面板、门把手、呼叫按钮、电话手柄、遥控器、台式机、患者围栏、抓杆、手术器械、造纸厂内的设备(包括管道、箱、压头箱、断流塔、节约装置叶片以及成型网等)。

硬表面上的样品可取自于无菌拭子或其它可用于从硬表面收集微生物的无菌装置，诸如：医用胶带、棉布、纤维素布等。如果表面干燥，则可用拭子施加溶剂以溶解可能存在的任何细菌残留物，并将残留物悬浮在溶剂中进行测试。溶剂的实例可包括但不限于：无菌水、无菌磷酸盐缓冲液、无菌Tris EDTA(TE)缓冲液、稀释的洗涤剂溶液(诸如吐温)等。

液体的非限制性实例包括工艺水、进水、冷却塔水、处理和未处理废水、纸料(稀原料和稠原料)、白水、吸水箱水、塔盘水、水果和蔬菜水槽水、蛋白质(例如，家禽肉、猪肉、红肉、海鲜)加工水、水培水或海鲜养殖水以及农业用水。可以将液体样品从潜在污染源中等分到无菌容器中。

食品和饮料产品的非限制性实例包括牛奶、啤酒、葡萄酒、饮用水、水果和蔬菜、蛋白质(诸如家禽肉、猪肉、红肉或海鲜)、即食肉、奶酪、预制食品、冷冻食品、冰淇淋。

包装和产品的非限制性实例包括：纸制品(诸如用于食品接触和非食品接触等级的成品纸制品和成品板制品)；用于手术或医疗用途的盖布；无菌包装容器；塑料食物和饮料容器(例如，酸奶容器、牛奶容器、熟食容器)；食品罐；铝或PET饮料容器；袋或薄膜或气调包装。所述产品可以在其离开制造厂前进行测试，例如在造纸厂，或在使用点(诸如在食品或饮料厂)进行测试。纸制品样品可以根据乳品商标准(TAPPI测试方法纸和纸板的T449细菌学检查，或ISO8784纸浆和板的微生物学检查)中所描述的程序进行测试。

根据一些实施例，对样品进行任选的初始ATP测量。如上所描述，样品可以与荧光素酶和荧光素连同阳离子、氧以及三羟甲基氨基甲烷缓冲液或类似物结合。反应产生的光以相对光单位(RLU)进行测量。可以用光度计进行测量。任选地，可以通过HPLC进行初始ATP测量。在一些实施例中，可以用任选的加热步骤使营养细胞灭活。通过加热样品约5至约15分钟、约7至约13分钟或约9至约11分钟可以使营养细胞灭活。可以将细胞在约80℃至约110℃、约85℃至约105℃或约90℃至约100℃的温度下加热。优选地，将样品在约95℃的温度下加热10分钟。将样品加热到80℃是从样品中消除营养细胞的公认方法，然而，实验室测试表明，一些营养细胞在这种热水平下存活。

在一些实施例中，样品在引发细菌孢子萌发的条件下孵育。这通常涉及至少为孢子提供营养和合适的温度条件。可以将包括任选的萌发增强剂的营养液体培养基添加至样品中，并在约30℃至约45℃、约35℃至约40℃或约36℃至约38℃的温度下孵育以有效地引发孢子萌发。商业可获得的营养液体培养基的实例包括营养液体培养基、胰蛋白酶大豆液体培养基、溶原性液体培养基、Luria液体培养基、牛肉提取液体培养基和极品液体培养基。有效的萌发增强剂包括L-丙氨酸、肌苷、葡萄糖、氨基酸和溴化钾。优选地，萌发增强剂是L-丙氨酸。在一个实施例中，样品在37℃下孵育以诱导孢子萌发。

在样品孵育时，通过以指定时间间隔采集ATP读数来随时间监测ATP水平。在整个孵育期间均用光度计在一定间隔内测量光发射。在每个时间间隔采集新样品，并与ATP试剂结合以产生每个发光读数。可以每2小时、每1小时、每30分钟、每15分钟或每5分钟采集ATP测量值。优选地，在5至8小时期间至少每小时采集一次ATP测量值。任选地，可利用HPLC测量样品中的ATP水平。还可以至少每小时采集一次HPLC测量值以监测ATP水平。可以使用染料处理相同的程序，以基于氧化还原变化或代谢活性检测微生物活性。可以通过分光光度法或通过测量荧光来检查样品的颜色变化的视觉证据。

如上所讨论，当孢子萌发时，由于代谢活性的增加导致其产生ATP爆发。这种ATP产生的爆发可以在孵育期间的不同时间点观察到，这取决于孢子存在的浓度，但通常将会在孵育开始后5至8小时之间出现。在100-200CFU/mL(每毫升菌落形成单位)范围内的孢子浓度将在7至8小时之间产生ATP爆发，而在1,000-100,000CFU/mL的高孢子浓度将在5小时左右表现出信号。如果样品中存在营养细胞(并且未加热灭活)，则在整个孵育期间将检测到稳定水平的ATP产生。营养细胞的典型测量值可在约5,000至200,000RLU的范围。然而，细菌孢子的萌发将表现出更高的ATP量，其RLU测量至少比初始测量值高500倍。取决于样品中存在的孢子浓度，典型的ATP爆发可以在比初始测量值高10至500倍的RLU范围内进行测量。因此，ATP爆发的存在表明孢子存在于样品中，而不存在ATP爆发则表明孢子不存在样品中。如果样品中未测量到ATP，则根本不存在微生物。

一旦已经确定样品中存在孢子，选择抗微生物处理。如果检测到孢子，则可从以下选择处理：次氯酸盐、二氧化氯、臭氧、戊二醛、次氯酸钠、一氯胺、过氧乙酸、2,2-二溴-3-亚硝基丙酰胺(DBNPA)、5,5-二甲基乙内酰脲(DMH)、醇类、过酸及其组合。

在造纸厂中，次氯酸钠(漂白剂)在pH 6.0至7.5之间的工艺和水系统中有效，并且需要至少20分钟的接触时间。在有效的pH范围内，大部分氯以次氯酸的形式存在，其容易被氧化剂需求所消耗。在高需求系统中，可能需要施加高剂量以达到所期望的目标残留。当在0.4到0.5ppm之间剂量达到目标残留时，游离氯可以有效地对抗孢子。在0.5ppm以上的残留的游离氯可对机器效率产生负面影响，因为它会氧化染料、OBA、毛毡和机器表面。因此，建议对原料系统良好控制以最小化湿端上所需的残留物。次氯酸钠可连续地施加到混合箱。对于断流槽，次氯酸钠必须与非氧化性杀生物剂(诸如戊二醛)结合施加。

二氧化氯在造纸厂pH 5至10的系统中也有效，并且比漂白剂更不可能被氧化剂的需求所消耗。此外，二氧化氯不像氯一样有助于AOX(可吸收的有机卤化物，即，氯酚，二恶英)的形成。这使得它成为当地法规限制氯的使用的一种合适的替代。作为溶解在水中的气体递送，二氧化氯在暴露于户外时倾向于快速挥发。必须仔细考虑进料点以避免挥发。具有良好混合的大的混合箱或白水存储箱是二氧化氯的理想进料点。与漂白剂一样，对原料系统的良好控制将最小化湿端上所需的处理并改善机器相容性。当将二氧化氯用作孢子控制程序的基干时，最好用非氧化性杀生物剂(诸如戊二醛)处理断流槽。

一氯胺(MCA)(可获得并已注册为杀生物剂)在pH值为7至9的系统中有效，并且比漂白剂更不可能被氧化剂的需求所消耗。MCA通过在受控条件下将氨源与氯混合生产。这通常是通过在pH值为9至10的情况下将稀释的次氯酸钠与硫酸铵溶液反应生成最终MCA浓度为3,000至6,000ppm来现场生成的。MCA不是一种很好的杀孢剂，但是它在控制包括营养状态下的孢子形成细菌在内的广谱细菌方面可能非常有效。关键是要在原料系统和进水中维持一致的生物控制。MCA不能迅速响应工艺异常，因此建议补充戊二醛。在造纸厂中，具有良好混合的原料槽是MCA的理想进料点。可以将MCA注入白水中，但残留浓度应维持在2至3ppm之间，以最小化腐蚀可能性。原料系统和进水的良好控制将使湿端上所需的处理最小化，并改善机器的相容性。

过氧乙酸在平衡下以过氧乙酸(PAA)、过氧化氢和乙酸的溶液形式递送。尽管高剂量的过氧化氢可有效杀死孢子，但在平衡溶液中，PAA被认为是主要的活性成分。PAA将不导致AOX的形成，并可以在当地法规限制氯的使用的地方使用。PAA在pH值5至7的系统中最有效，可能需要更高剂量才能达到pH高于7的效果。尽管被认为是强氧化剂，但PAA可能比漂白剂或二氧化氯花费更长的接触时间，并且需要更高的剂量。PAA可以与二氧化氯结合使用，但可以中和次氯酸盐程序。如果仔细考虑进料点以避免两者混合，那么PAA和次氯酸盐只能用于处理同一台机器。在相同的工艺流中，PAA与DBNPA(2,2二溴-3-硝基三丙酰胺)互补时最有效。PAA的目标浓度是接触时间1小时为5.0ppm、接触时间20至60分钟为15ppm。

用非杀生物的前体化学物质稳定氯，诸如二甲基乙内酰脲、尿素、氨基磺酸、氨基磺酸钠、氨基甲酸铵、硫酸铵、氯化铵和溴化铵。对于用DMH稳定的氯进行孢子控制，建议在Cl₂:DMH(5,5-二甲基乙内酰脲)为4:1的情况下的持久性和快速杀灭之间的平衡。

通常，需要非氧化剂作为氧化剂程序的补充。戊二醛对孢子形成细菌和细菌孢子的营养细胞均有影响。它在pH为6.0至9.0的范围内的系统中有效。

也可以使用像极端热和UV辐射的非化学处理。当它们处于其营养状态时，靶向孢子形成细菌扩大了有效杀生物剂的列表以包括DBNPA、异噻唑啉、季胺等。一旦已经选择了适当的处理，它就被施加到在未检测到孢子时孢子形成细菌在营养状态下存在的工艺的部分中。这可能包括在已检测到污染的生产点的硬表面、食品或饮料产品、液体、包装、或纸制品。由于所述方法完成时间不超过8个小时，因此可以迅速消除细菌污染，从而防止下游孢子形成。另外，可以在设备脱机用于清洁时进行处理，或不检疫产品用于多次轮班，并且可以更迅速地纠正生产问题。应用处理后，应进行下一轮测试以确保已消除孢子。与正确的化学物质一起在生产中的正确位置起作用的能力可以节省成本和时间。

为了更完整地理解本公开，给出以下实例以举例说明一些实施例。这些实例和实验应理解为是说明性的而不非限制性的。除非另有表明，否则所有部件均以重量计。

实例

实例1：在各种条件下在营养细胞和孢子的混合群体中ATP产生的比较。

使用LuminUltra QuenchGone21工业ATP试剂盒测量包含营养细胞和孢子的混合物的样品中的ATP水平。确定来自造纸厂的工业水样品具有营养细胞和细菌的混合物。通过在R2A琼脂上铺板来确定两种细菌形式的确认和定量。在各种条件下，在6小时的过程中测量ATP的产生。

在不存在消除营养细菌的加热步骤、萌发增强剂和营养物的情况下，ATP生产时程类似于图1所示。在不存在加热步骤和营养物但存在萌发增强剂的情况下，ATP生产时程类似于图2所示。在存在萌发增强剂和营养物但不存在加热步骤的情况下，ATP生产时程类似于图3所示。在存在营养物和萌发增强剂的情况下，ATP生产在6小时内稳定增加。当在添加萌发增强剂和营养物之前包括加热步骤时，ATP生产时程类似于图4A(RLU)和图4B(RLU生产随时间变化的商)所示。

通过热灭活去除营养细胞产生的ATP，并且仅观察到了孢子产生的ATP。添加营养物和萌发增强剂加速孢子的萌发，并且也促进营养细胞中ATP的生产。对于消除营养细胞产生的ATP，热灭活步骤是必要的，以便能够检测出由萌发孢子生成的ATP。将数据绘制为随时间变化的RLU生产的商，以便于轻松比较多个样品。

实例2：工艺水样品中的孢子检测。

从有两台造纸机的造纸厂中收集七个工艺水样品。每个样品具有未知量的营养细胞和孢子。在添加营养物和萌发增强剂前，先对样品进行热处理。使用LuminUltraQuenchGone21工业ATP试剂盒，在6小时内每小时测量一次ATP生产(图5)。

确定七个样品中有三个存在孢子：密封槽2、断流A和断流B。基于在相对于t＝0时6小时的信号强度，断流A和B的孢子水平最高。密封槽中的孢子显著性地少于断流A和B。为了补救此工艺中的孢子，已确定最有效的杀生物剂添加点是两个断流塔。

以上说明、实例和数据提供了所述组合物的制造和使用的完整描述。由于可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下实施多种实施例，因此本发明属于权利要求中。