氨基吡啶衍生物化合物的盐、其结晶形式、以及用于制备它们的方法
阅读说明：本技术 氨基吡啶衍生物化合物的盐、其结晶形式、以及用于制备它们的方法 (Salts of aminopyridine derivative compounds, crystalline forms thereof, and processes for preparing the same ) 是由 S.H.吴 J.G.金 S-W.吴 T.D.韩 S.Y.钟 S.R.李 K.B.金 Y 于 2018-04-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的新型甲磺酸盐、其新型结晶形式、以及用于制备它们的方法。更具体地,本发明涉及N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐、其结晶形式、以及用于制备它们的方法,该甲磺酸盐不仅在其被单独施用时而且在联合其它药物施用时均具有优异的稳定性、溶解度和生物利用率,并且具有高纯度。(The present invention relates to novel mesylate salts of N- (5- (4- (4- ((dimethylamino) methyl) -3-phenyl-1H-pyrazol-1-yl) pyrimidin-2-ylamino) -4-methoxy-2-morpholinophenyl) acrylamide, novel crystalline forms thereof, and processes for preparing them. More particularly, the present invention relates to a methanesulfonic acid salt of N- (5- (4- (4- ((dimethylamino) methyl) -3-phenyl-1H-pyrazol-1-yl) pyrimidin-2-ylamino) -4-methoxy-2-morpholinophenyl) acrylamide, which has excellent stability, solubility and bioavailability not only when it is administered alone but also when it is administered in combination with other drugs, and has high purity, a crystalline form thereof, and a method for producing the same.)
技术领域
本发明涉及N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的化合物的甲磺酸(甲烷磺酸)盐、其结晶形式、以及用于制备它们的方法，该化合物呈由下式2表示的游离碱形式。更具体地，本发明涉及由下式2表示的化合物的甲磺酸盐、其结晶形式、以及用于制备它们的方法，该甲磺酸盐具有优异的稳定性、溶解度和生物利用率并且具有高纯度。
[式2]
背景技术
在全球范围内，肺癌占癌症死亡原因的约三分之一，并且非小细胞肺癌占全部肺癌的约80％。患有非小细胞肺癌的患者中的仅一些预计能够通过手术而治愈，并且大多数患者被诊断为患有局部晚期癌症或转移性癌症。晚期非小细胞肺癌的治疗取决于是否存在特定突变的分子标记物。如果表皮生长因子受体(EGFR)突变为阳性的，则一线治疗为EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。具有这些突变的患者对EGFR TKI敏感。然而，响应EGFR TKI(例如，厄洛替尼和吉非替尼)的大多数患者最终变得对其具有耐受性，并且恶化成晚期肺癌。在这些原因中，T790M(其为酪氨酸激酶(TK)域的“卡口”残基(gatekeeper residue)中的点突变)占所获得耐受性的约50％至60％。因此，正在开发用于该突变的分子靶向治疗剂。此外，尽管具有EGFR突变的患有非小细胞肺癌的患者中的约50％在诊断后3年内出现脑转移，但迄今开发的EGFR TKI在脑中具有低渗透性，使得脑转移灶的治疗受到限制。
如上所述呈游离碱形式的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的化合物已知对野生型EGFR具有极少影响，并且因对T790M的单突变和双突变(EGFRm)具有强抑制活性而为高度选择性且不可逆的EGFR TKI。该化合物预计在患有晚期非小细胞肺癌作为原发性癌症和出现脑转移的晚期非小细胞肺癌的患者的治疗中具有治疗有效功效。
就这一点而言，国际专利公布WO 2016-060443公开了由上式2表示的化合物及其制备方法，其中该化合物可用作药物以抑制蛋白激酶介导的病症的活性，尤其是抑制相比于野生型EGFR具有一个或多个突变的EGFR。因此，该化合物有潜力成为候选物以开发用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物。
技术问题
当化合物被开发成药物的潜力得到确定时，高药理学活性和良好的药理学特征并非需要考虑的仅有因素。良好的药物候选物必须具有少量的杂质，为物理和化学稳定的，并且示出容许的生物利用率水平。由于游离碱形式的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的化合物不仅在水中具有低溶解度，而且在酸性环境中具有低溶解度，因此该化合物的缺点在于其被用作药物时其溶解度和生物利用率并非为优异的。因此，挑战在于制备该化合物的制剂，该制剂相比于游离碱形式具有优异的溶解度和生物利用率。
因此，本发明的目的在于提供N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的化合物的药学上可接受的盐，其中各种物理化学问题诸如溶解度和吸湿性得到改善，以便提高游离碱形式的化合物的溶解度和生物利用率。即，由于具有低溶解度的游离碱形式的化合物的动物测试，仍存在下述问题：观察到药物的低吸收速率和个体之间的吸收速率变化。因此，为了解决该问题，本发明的目的在于提供游离碱形式的化合物的药学上可接受的盐及其结晶形式，该盐及其结晶形式的溶解度和生物利用率得到改善。
同时，患有蛋白激酶介导的病症的大多数患者伴有诸如回反流性食管炎、消化不良和胃炎之类的胃肠道疾病。在此类情况下，为了预防胃酸刺激，经常联合用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物来开药，例如，质子泵抑制剂诸如埃索美拉唑或H2-受体拮抗剂诸如西米替丁。
然而，在其中用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物与用于预防胃酸刺激的药物联合施用的情况下，存在下述问题：用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物的吸收速率可通过药物之间的相互作用而发生变化。
具体地，在其中用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物与用于预防胃酸刺激的药物联合施用的情况下，存在下述问题：用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物的血药浓度降低，使得其血药浓度低于其有效治疗范围。
因此，本发明的另一个目的在于提供游离碱形式的化合物的药学上可接受的盐及其结晶形式，该盐及其结晶形式具有优异的生物利用率，即使当它们与下述药物一起施用时也是如此，该药物可能在临床实践中与用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物联合施用并且防止胃酸刺激(例如，质子泵抑制剂或H2受体拮抗剂)。
由于实现上述目的，可以降低患者所服用的食物或抗酸剂对药物吸收的影响，这原本可为临床实践中的问题。
问题的解决方案
根据本发明的一个方面，提供了由下式1表示的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐：
[式1]
此外，根据本发明的另一方面，提供了一种用于制备由下式1表示的甲磺酸盐的方法，该方法包括：(1)将由下式2表示的化合物与单一有机溶剂或混合溶剂混合，然后向其添加甲磺酸，以制备由式1表示的甲磺酸盐的混合物；以及
(2)将有机溶剂添加到该混合物以使由式1表示的甲磺酸盐结晶：
[式1]
[式2]
根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物组合物，该药物组合物包含甲磺酸盐和药学上可接受的添加剂。
此外，根据本发明的另一方面，提供了一种用于抑制相比于野生型EGFR具有一个或多个突变的表皮生长因子受体(EGFR)的活性的药物组合物，该药物组合物包含甲磺酸盐和药学上可接受的添加剂。
本发明的有益效果
由本发明提供的甲磺酸盐化合物及其结晶形式的优点在于，它们相比于其它药学上可接受的盐具有优异的稳定性、溶解度和生物利用率，具有高纯度，并且如上所述不仅在其被单独施用时而且在联合抗酸剂施用时均产生优异的生物利用率。此外，由本发明提供的制备方法的优点在于其可以大规模地制备具有上述优点的甲磺酸盐化合物。
附图说明
图1为本发明的实施例1中制备的化合物的粉末X射线衍射(PXRD)图。
图2为本发明的实施例1中制备的化合物的差示扫描量热法(DSC)图。
图3为示出比较例1(左)中制备的化合物的溶解度测试和实施例1(右)中制备的化合物的溶解度测试的结果的图(FaSSGF：人工胃液，FaSSIF：人工肠液)。
图4为示出实施例1中制备的化合物在应力条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，2周：2周之后，4周：4周之后)。
图5为示出比较例2中制备的化合物在应力条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，2周：2周之后，4周：4周之后)。
图6为示出比较例3中制备的化合物在应力条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，2周：2周之后，4周：4周之后)。
图7为示出比较例4中制备的化合物在应力条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，2周：2周之后，4周：4周之后)。
图8为示出实施例1中制备的化合物在加速条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，1个月：1个月之后，3个月：3个月之后，6个月：6个月之后)。
图9为示出比较例2中制备的化合物在加速条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，1个月：1个月之后，3个月：3个月之后，6个月：6个月之后)。
图10为示出比较例3中制备的化合物在加速条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，1个月：1个月之后，3个月：3个月之后，6个月：6个月之后)。
图11为示出比较例4中制备的化合物在加速条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，1个月：1个月之后，3个月：3个月之后，6个月：6个月之后)。
图12为示出在测试实施例4中对正常大鼠进行的药代动力学比较测试的结果的图。
图13为示出在测试实施例4中对用埃索美拉唑处理的大鼠进行的药代动力学比较测试的结果的图。
图14为示出在测试实施例5中对比格犬进行的药代动力学比较测试的结果的图。
用于实施本发明的最佳模式
术语描述
除非另外指明或定义，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义。
除非另外指明，否则所有百分比、份数、比率均按重量计。
在本说明书中，当部件被称为“包括”元件时，应当理解，该部件也可包括其它元件，而非排除其它元件，除非另外具体指明。
本文所用的表示结合组分的量、特性诸如分子量、反应条件等的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。
在下文中，将详细地描述本发明。
本发明涉及由下式1表示的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐。
[式1]
本发明人已新合成了N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的化合物的甲磺酸盐，该甲磺酸盐相比于游离碱形式的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的化合物具有优异的溶解度和生物利用率，相比于该化合物的其它药学上可接受的盐具有优异的稳定性、溶解度和生物利用率，并且具有高纯度，从而完成本发明。
通常，盐酸盐占由FDA批准的可商购获得的化合物的盐的最大比例。然后，硫酸盐、溴化物、亚氯酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和苹果酸盐按照它们的顺序占较大比例。甲磺酸盐仅占约2％。即，特定化合物的甲磺酸盐通常并非为可选的盐。但是，本发明人通过反复研究已发现，N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐相比于其它药学上可接受的盐具有优异的稳定性、溶解度和生物利用率，并且具有高纯度。此外，本发明人已对其大规模制备进行了大量研究。因此，本发明人已完成了本发明。
在本发明的一个方面，由上式1表示的甲磺酸盐的特征在于其为结晶形式，并且结晶形式落在本发明的范围内。药物化合物的结晶形式在合适制剂的开发中可为重要的。某些结晶形式相比于其它结晶形式可具有改善的溶解度、稳定性和生物利用率，并且具有高纯度。因此，它们可被选择为良好的药物候选物。某些结晶形式的优点在于其具有改善的热力学稳定性。
在本发明的一个方面，由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式可为结晶形式(I)。优选的是，PXRD图中的衍射峰存在于5.614±0.2、12.394±0.2、14.086±0.2、17.143±0.2、18.020±0.2、19.104±0.2、21.585±0.2、22.131±0.2和22.487±0.2度的2θ(theta)角度处；并且更优选的是，PXRD图中的衍射峰存在于5.614、12.394、14.086、17.143、18.020、19.104、21.585、22.131和22.487度的2θ角度处。但本发明并不局限于此。
在本发明的另一方面，由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)在DSC(差示扫描量热法)图中可具有位于210℃至230℃，优选地217℃±2℃处的吸热转变峰值；并且优选的是，起始点为214℃±2℃。但本发明并不局限于此。
此外，本发明涉及一种用于制备由下式1表示的甲磺酸盐的方法，该方法包括：(1)将由下式2表示的化合物与单一有机溶剂或混合溶剂混合，然后向其添加甲磺酸，以制备由式1表示的甲磺酸盐的混合物；以及
(2)将有机溶剂添加到该混合物以使由式1表示的甲磺酸盐结晶：
[式1]
[式2]
由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)可通过该制备方法制备。但本发明并不局限于此。
在本发明的一个方面，步骤(1)的单一有机溶剂并未具体限定，只要其适用于本发明即可。并且其优选地为选自丙酮、甲基乙基酮和乙酸乙酯中的一种。如果使用这种单一有机溶剂，则有利的是可稳定地制备由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)。
在本发明的另一方面，步骤(1)的混合溶剂可为水与至少一种合适有机溶剂的混合溶剂。具体地，其优选地为水与选自丙酮和甲基乙基酮中的至少一种有机溶剂的混合溶剂。但本发明并不局限于此。如果使用这种混合溶剂，则有利的是可稳定地制备由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)。
在本发明的另一方面，水与有机溶剂的混合比率按体积计可为1∶1至1∶10，具体地1∶4至1∶6。但本发明并不局限于此。
在本发明的一个方面，步骤(1)可在20℃至70℃的温度下，优选地在45℃至60℃的温度下进行。在上述温度范围内，有利的是能够改善由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)的质量。
同时，步骤(2)为通过将有机溶剂添加到它们的混合物来使由式1表示的甲磺酸盐结晶的步骤。具体地，在步骤(2)中，可通过将有机溶剂添加到它们的混合物、搅拌所得混合物、冷却和过滤混合物、以及干燥所得固体来使由式1表示的甲磺酸盐结晶。
在本发明的一个方面，用于步骤(2)中的有机溶剂可与用于步骤(1)中的单一有机溶剂相同和不同。具体地，用于步骤(2)中的有机溶剂可为选自丙酮、甲基乙基酮和乙酸乙酯中的至少一种。但本发明并不局限于此。
此外，在步骤(2)中，可基于1g由式2表示的化合物以在3mL至20mL范围内的体积添加有机溶剂。具体地，在步骤(2)中，可基于1g由式2表示的化合物以在5mL至20mL范围内的体积，更具体地以在5mL至10mL范围内的体积添加有机溶剂。但本发明并不局限于此。当以上述体积添加有机溶剂时，有利的是可最小化由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)的收率的降低。
在本发明的另一方面，可在步骤(2)中将混合物冷却到0℃至30℃的温度，优选地冷却到0℃至10℃的温度。如果将混合物冷却到上述温度范围，则有利的是可最小化由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)的收率的降低。
在本发明的另一方面，可在步骤(2)中的冷却之后在30℃至70℃的温度下干燥残余混合物。如果在上述温度范围下干燥残余混合物，则有利的是可有效地除去溶剂残余物。
此外，本发明提供了一种用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物组合物，该药物组合物包含由上式1表示的甲磺酸盐和药学上可接受的添加剂。
此外，本发明提供了一种用于抑制相比于野生型EGFR具有一个或多个突变的表皮生长因子受体(EGFR)的药物组合物，该药物组合物包含由上式1表示的甲磺酸盐和药学上可接受的添加剂。
在本发明的一个方面，突变可为Del E746-A750、L858R或T790M，并且其可为选自Del E746-A750/T790M或L858R/T790M的双突变。
在本发明的一个方面，药物组合物可用于预防或治疗同种异体移植排斥、移植物抗宿主病症、糖尿病性视网膜病变、因年龄相关性年龄相关性黄斑变性产生的脉络膜新生血管、银屑病、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、关节炎中的滑膜血管翳形成、多发性硬化症、重症肌无力、糖尿病、糖尿病血管病症、早产儿视网膜病变、婴幼儿血管瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、头颈癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、纤维症、动脉粥样硬化、再狭窄、自体免疫病症、过敏症、呼吸病症、哮喘、移植排斥、炎症、血栓形成、视网膜血管增生、炎症性肠病症、克隆氏病、溃疡性结肠炎、骨病症、移植物或骨髓移植排斥、狼疮、慢性胰腺炎、恶病质、脓毒症性休克、纤维增生性和差异性皮肤疾病或病症、中枢神经系统病症、神经退化性病症、阿尔茨海默病、帕金森氏病、与脑或脊髓损伤或者外显子变性之后的神经损伤相关联的病症或病况、急性或慢性癌、眼部病症、病毒感染、心脏病症、肺病症或肾病症、以及支气管炎。优选地，药物组合物可用于预防或治疗急性或慢性癌，更优选地肺癌，最优选地非小细胞肺癌或脑转移性非小细胞肺癌，但并不局限于此。
在本发明的一个方面，药物组合物可抑制相比于野生型EGFR具有至少一个突变的表皮生长因子受体(EGFR)，并且因此可用于预防或治疗该疾病。
本发明的化合物可以治疗有效量单独施用或作为药物组合物的一部分施用，并且药物组合物有利于将化合物施用到生物体中。此外，化合物和组合物可单独施用或者与一种或多种附加的治疗剂联合施用。存在多种用于施用化合物和组合物的技术，该技术包括静脉施用、吸入、口服、直肠施用、肠胃外施用、玻璃体内施用、皮下施用、肌内施用、鼻内施用、透皮施用、局部施用、眼部施用、口腔施用、气管施用、支气管施用、舌下施用或视神经施用，但并不局限于此。本文提供的化合物以公开已知的药物剂型施用，例如，用于口服的片剂、胶囊或酏剂，用于直肠施用的栓剂，用于肠胃外或肌内施用的无菌溶液或悬浮液，用于局部施用的洗剂、凝胶、软膏或霜膏等。
包含在本发明的药物组合物中的由式(1)表示的甲磺酸盐的优选剂量根据患者的病况和体重、疾病的程度、药物的类型、施用的途径和持续时间而变化，但该剂量可由本领域的普通技术人员适当地选择。一般来讲，由式(I)表示的甲磺酸盐的优选剂量可在约10mg/天至约1000mg/天的范围内。
作为用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的添加剂，可使用至少一种常用的稀释剂或赋形剂，诸如润湿剂、崩解剂、润滑剂、粘结剂、表面活性剂等。
药学上可接受的添加剂可包括科利当、紫胶、***树胶、滑石、氧化钛、糖(例如，蔗糖)、明胶、水、多糖诸如乳糖或葡萄糖、石蜡(例如，石油馏分)、植物油(例如，花生油或芝麻油)、以及药学上可接受的有机溶剂诸如醇(例如，乙醇或甘油)、天然矿物粉末(例如，高岭土、粘土、滑石和白垩)、合成矿物粉末(例如，高度分散的硅酸和硅酸盐)、乳化剂(例如，木素、亚硫酸盐溶液、甲基纤维素、淀粉和聚乙烯基吡咯烷酮)、硬脂酸镁、硬脂酸、月桂基硫酸钠等，但并不局限于此。
本发明提供了由上式1表示的甲磺酸盐的用途，该甲磺酸盐用于制造药剂，该药剂用于治疗蛋白激酶介导的病症。
另外，本发明提供了由上式1表示的甲磺酸盐的用途，该甲磺酸盐用于制造药剂，该药剂用于抑制相比于野生型EGFR具有至少一个突变的表皮生长因子受体(EGFR)的活性。
本发明提供了一种用于治疗蛋白激酶介导的病症的方法，该方法包括将由上式1表示的甲磺酸盐施用给受检者的步骤。
另外，本发明提供了一种用于抑制相比于野生型EGFR具有至少一个突变的表皮生长因子受体(EGFR)的活性的方法，该方法包括将由上式1表示的甲磺酸盐施用给受检者的步骤。
本发明的模式
在下文中，将提供本发明的优选的实施例，以便于理解本发明。然而，这些实施例仅示出了本发明，并且对于本领域的技术人员将显而易见的是，可在本发明及其技术构思的范围内作出各种变化和修改，并且此类变化和修改在所附权利要求书的范围内。
实施例
实施例1：N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐的制备
向反应器中装入通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺(1,100.0g，1,983.2mmol)、丙酮(4.4L)和纯化水(1.1L)，同时在加热到45℃至55℃的情况下进行搅拌。将甲磺酸(186.8g，1,943.6mmol)在纯化水(0.55L)中稀释，将其滴加到上述混合物同时保持在45℃或更高温度。然后，将混合物搅拌30分钟或更长时间，以制备N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐的混合物。
然后，为了使混合物中的甲磺酸盐结晶，在40℃至50℃下滴加丙酮(8.8L)，搅拌30分钟或更长时间，冷却到0℃至5℃，并且搅拌3小时或更长时间。将丙酮(8.8L)滴加到混合物同时保持在40℃至50℃，并且将混合物搅拌30分钟或更长时间，冷却到0至5℃，并且搅拌3小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且然后用丙酮(5.5L)洗涤湿滤饼。将由此获得的固体在55℃下进行真空干燥以获得1,095.8g的标题化合物(收率：84.9％)。
用1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)测量标题化合物的结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.79(s，1H)，9.35(s，1H)，9.21(s，1H)，8.78(s，1H)，8.59(d，1H)，8.33(s，1H)，7.77(d，2H)，7.55(m，3H)，7.34(d，1H)，6.94(s，1H)，6.71-6.76(q，1H)，6.28-6.31(d，1H)，5.81-5.83(d，1H)，4.48(s，2H)，3.90(s，3H)，3.81-3.83(t，4H)，2.86-2.88(t，4H)，2.66(s，6H)，2.35(s，3H)。
通过差示扫描量热法(DSC)测量标题化合物。因此，DSC图具有位于约217℃处的吸热转变峰。使用Mettler Toledo DSC 1STAR(样品容器：99％氮气条件下的密封铝盘并且温度以10℃/min的速率从30℃升高到300℃)执行DSC测量。
通过PXRD测量标题化合物，由此显示出PXRD图中的衍射峰存在于5.614、12.394、14.086、17.143、18.020、19.104、21.585、22.131和22.487度的2θ角度处(参见图1)。使用Bruker D8 advance(X射线源：CuKα，管电压：40kV/管电流：40mA，发散狭缝：0.3，和散射狭缝：0.3)获得化合物的PXRD谱。
比较例1：游离碱形式的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的制备
通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备游离碱形式的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺。
比较例2：N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的盐酸盐的制备
向反应器中装入通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺(50.00g，90.1mmol)、丙酮(450mL)和纯化水(50mL)，将它们冷却到0℃至5℃。将盐酸(9.39g，90.1mmol)在丙酮(50mL)中稀释，将其滴加到上述混合物同时保持在0℃至5℃。然后，将混合物调节到20℃至25℃，并且搅拌2小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且将由此获得的固体进行真空干燥以获得49.91g的标题化合物(收率：93.7％)。
在与实施例1相同的条件下测量标题化合物。用1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)测量的结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.82(s，1H)，9.36(s，1H)，9.26(s，1H)，8.69(s，1H)，8.57(d，1H)，8.39(s，1H)，7.77(d，2H)，7.49-7.57(m，3H)，7.33(d，1H)，6.94(s，1H)，6.69-6.76(q，1H)，6.28(d，1H)，5.78(d，1H)，4.42(d，2H)，3.89(s，3H)，3.81(s，4H)，2.88(s，4H)，2.58(d，6H)
比较例3：N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的柠檬酸盐的制备
向反应器中装入通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺(15.00g，27.0mmol)以及乙酸乙酯(600mL)，将它们在回流下进行搅拌以溶解反应混合物。将柠檬酸(5.68g，29.6mmol)溶解于丙酮(25mL)中，将其滴加到50℃至70℃下的上述混合物。然后，将反应混合物冷却到20℃至30℃，并且搅拌2小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且然后周乙酸乙酯(300mL)洗涤湿滤饼。将由此获得的固体进行真空干燥以获得20.15g的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸盐作为粗制化合物(收率：99.8％)。
向反应器中装入N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸盐的粗制化合物(18.70g)和纯化水(187mL)，将它们在20℃至30℃下搅拌2小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且将由此获得的固体进行真空干燥以获得15.67g的标题化合物(收率：83.8％)。
在与实施例1相同的条件下测量标题化合物。用1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)测量的结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.22(s，1H)，9.17(s，1H)，8.97(s，1H)，8.54(d，1H)，8.24(s，1H)，7.93(d，2H)，7.43-7.53(m，3H)，7.33(d，1H)，6.95(s，1H)，6.71-6.78(q，1H)，6.36(d，1H)，5.82(d，1H)，3.90(s，3H)，3.82(s，6H)，2.86(s，4H)，2.50-2.71(d，4H)，2.37(s，6H)
比较例4：N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的乙磺酸盐的制备
向反应器中装入通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺(15.00g，27.0mmol)以及四氢呋喃(300mL)，将它们进行搅拌。将乙磺酸(2.98g，27.1mmol)在四氢呋喃(45mL)中稀释，将其滴加到上述混合物同时保持在20℃至25℃。然后，将反应混合物在室温下搅拌11小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且将由此获得的固体进行真空干燥以获得16.20g的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的乙磺酸盐(收率：90.1％)作为标题化合物。
在与实施例1相同的条件下测量N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺乙磺酸盐的标题化合物。用1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)测量的结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.69(s，1H)，9.34(s，1H)，9.22(s，1H)，8.75(s，1H)，8.58(d，1H)，8.36(s，1H)，7.77(d，2H)，7.52-7.58(q，3H)，7.33(d，1H)，6.94(s，1H)，6.69-6.76(q，1H)，6.26(d，1H)，5.80(d，1H)，4.46(s，2H)，3.89(s，3H)，3.82(s，4H)，2.87(s，4H)，2.65(s，6H)，2.34-2.39(q，2H)，1.03-1.06(t，3H)
测试实施例
测试实施例1：溶解度测试
测试实施例1和比较例1中制备的化合物的随pH而变化的溶解度，并且将人工胃液、人工肠液、水和乙醇中的溶解度进行比较。
将实施例1中制备的120mg化合物(对应于100mg式2的化合物)添加到5mL缓冲液(其具有下表1所述的pH中的每一个)、人工胃液、人工肠液、水或乙醇中，将其在37℃水浴中以50rpm的条件搅拌12小时。此外，在与上述相同的条件下测试比较例1中制备的100mg化合物。搅拌之后，测量由式2表示的溶解化合物的浓度，并且将实施例1和比较例1中制备的化合物的溶解度进行比较。结果示于图3和下表1中。
[表1]
如图3和上表1中所示，相比于比较例1中制备的游离碱形式的化合物，实施例1中制备的甲磺酸盐形式的化合物具有至少20,000倍的水中溶解度、约10倍的人工胃液(FaSSGF)中溶解度、和约25倍的人工肠液(FaSSIF)中溶解度。
测试实施例2和3：稳定性测试
各自测试实施例1和比较例2至4中制备的化合物的稳定性。测试五种化合物在应力条件和加速条件下的稳定性。这两种条件具体地示于下表2中。
[表2]
测试实施例2：实施例1和比较例2至4中制备的化合物在应力条件下的稳定性测试
在如上表2中给定的应力条件下，各自测试实施例1和比较例2至4中制备的化合物的稳定性。结果示于图4至7以及下表3和4中。PXRD和DSC测量的条件与实施例1中所述的条件相同。
[表3]
此外，高性能液相色谱法(HPLC)测量的结果示于下表4中，并且测量条件如下：
流动相缓冲液：250mM乙酸铵水溶液(流动相A：缓冲液/水/乙腈，流动相B：乙腈，柱：Xbridge BEH C18 XP)。
[表4]
测试实施例3：实施例1和比较例2至4中制备的化合物在加速条件下的稳定性测试
在如上表2中给定的加速条件下，各自测试实施例1和比较例2至4中制备的化合物的稳定性。结果示于图8至11以及下表5和6中。PXRD和DSC测量的条件与实施例1中所述的条件相同。
[表5]
W：白色，Y：黄色，LY：浅黄色，V：紫色，LV：浅紫色
此外，高性能液相色谱法(HPLC)测量的结果示于下表6中，并且测量条件如测试实施例2中所述：
[表6]
根据上述稳定性测试的结果，实施例1中制备的化合物具有优异的稳定性，因为其在稳定性测试开始和结束时示出极少的纯度和水含量变化，不存在PXRD图案变化，并且不存在以颜色观察的外观变化。相比之下，比较例2至4的化合物具有较差的稳定性，因为它们相比于实施例1中制备的化合物示出较大的纯度和水含量变化，并且观察到PXRD图案和外观的一些变化。
测试实施例4：实施例1和比较例1中制备的化合物在正常大鼠和用埃索美拉唑处理的大鼠中的药代动力学比较测试
各自测试实施例1和比较例1中制备的化合物在正常大鼠和用埃索美拉唑(其为质子泵抑制剂)处理的大鼠中的药代动力学。具体地，比较正常大鼠和用埃索美拉唑处理的大鼠中的最大血药浓度(Cmax)和血药浓度曲线下方的面积(AUClast)，以评估药物在实际动物中的吸收。
为了比较药代动力学参数，将体重为约250g的8周龄雄性大鼠(SD大鼠)用作测试动物。并且将实施例1和比较例1中制备的化合物各自悬浮于0.5％甲基纤维素中，并且以30mg/5mL/kg的剂量口服施用给正常大鼠。
同时，将埃索美拉唑(埃索美拉唑镁二水合物，Sigma Aldrich)以5mg/2mL/kg的剂量静脉施用给体重为约250g的8周龄雄性大鼠并持续3天，并且将实施例1和比较例1中制备的化合物各自以与施用给正常大鼠的剂量相同的剂量(即，30mg/5mL/kg)口服施用给大鼠。由其计算出的药代动力学参数(即，最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积)的比较示于表7以及图12和13中。
[表7]
如上述结果所示，在正常大鼠中，游离碱形式的化合物(比较例1)的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别比甲磺酸盐形式的化合物(实施例1)的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积低11.0％和10.4％。在用埃索美拉唑处理的大鼠中，前者的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别比后者的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积低47.8％和49.4％。即，已得到确认的是，相比于实施例1中制备的化合物，比较例1中制备的化合物对大鼠具有较低的暴露量。
此外，相比于正常大鼠，实施例1中制备的化合物的在用埃索美拉唑处理的大鼠中的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别降低47.6％和36.0％。相比之下，相比于正常大鼠，比较例1中制备的化合物的在用埃索美拉唑处理的大鼠中的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别降低69.3％和63.8％。根据这些结果得到确认的是，实施例1中制备的化合物相比于比较例1中制备的化合物具有较低的因埃索美拉唑施用而产生的药代动力学变化；因此，前者在大鼠中保持高血药浓度。
测试实施例5：实施例1和比较例1中制备的化合物在比格犬中的药代动力学比较测试
为了比较药代动力学参数，将体重为约10kg的15至17月龄雄性比格犬用作测试动物，并且将实施例1和比较例1中制备的化合物各自悬浮于0.5％甲基纤维素中并以5mg/2mL/kg的剂量口服施用给比格犬。由其计算出的药代动力学参数(即，最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积)的比较示于表8和图14中。
[表8]
实施例1
比较例1
最大血药浓度(C<sub>max</sub>，ng/mL)
134.7
80.7
血药浓度曲线下方的面积(AUC<sub>last</sub>，ng·h/mL)
811.5
379.1
如上述结果所示，在比格犬中，游离碱形式的化合物(比较例1)的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别比甲磺酸盐形式的化合物(实施例1)的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积低40.1％和50.4％。根据这些结果得到确认的是，相比于比较例1中制备的化合物，实施例1中制备的化合物在比格犬中示出较高的暴露量。
如上所述，根据本发明的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐化合物产生了优异的效果，因为其相比于N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的游离碱化合物具有优异的溶解度和生物利用率，其相比于其它药学上可接受的盐具有改善的稳定性、溶解度和生物利用率，并且其具有高纯度。
在上文中，已基于优选的实施例解释了本发明。然而，对于本领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离如权利要求中所述的本发明的技术构思的情况下通过添加、修改和删除构成元件来作出各种变化和修改，并且此类变化和修改在本发明的范围内。
具体实施方式
图1为本发明的实施例1中制备的化合物的粉末X射线衍射(PXRD)图。
图2为本发明的实施例1中制备的化合物的差示扫描量热法(DSC)图。
图3为示出比较例1(左)中制备的化合物的溶解度测试和实施例1(右)中制备的化合物的溶解度测试的结果的图(FaSSGF：人工胃液，FaSSIF：人工肠液)。
图4为示出实施例1中制备的化合物在应力条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，2周：2周之后，4周：4周之后)。
图5为示出比较例2中制备的化合物在应力条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，2周：2周之后，4周：4周之后)。
图6为示出比较例3中制备的化合物在应力条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，2周：2周之后，4周：4周之后)。
图7为示出比较例4中制备的化合物在应力条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，2周：2周之后，4周：4周之后)。
图8为示出实施例1中制备的化合物在加速条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，1个月：1个月之后，3个月：3个月之后，6个月：6个月之后)。
图9为示出比较例2中制备的化合物在加速条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，1个月：1个月之后，3个月：3个月之后，6个月：6个月之后)。
图10为示出比较例3中制备的化合物在加速条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，1个月：1个月之后，3个月：3个月之后，6个月：6个月之后)。
图11为示出比较例4中制备的化合物在加速条件下进行的稳定性测试的结果的照片(初始：开始时，1个月：1个月之后，3个月：3个月之后，6个月：6个月之后)。
图12为示出在测试实施例4中对正常大鼠进行的药代动力学比较测试的结果的图。
图13为示出在测试实施例4中对用埃索美拉唑处理的大鼠进行的药代动力学比较测试的结果的图。
图14为示出在测试实施例5中对比格犬进行的药代动力学比较测试的结果的图。
用于实施本发明的最佳模式
术语描述
除非另外指明或定义，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义。
除非另外指明，否则所有百分比、份数、比率均按重量计。
在本说明书中，当部件被称为“包括”元件时，应当理解，该部件也可包括其它元件，而非排除其它元件，除非另外具体指明。
本文所用的表示结合组分的量、特性诸如分子量、反应条件等的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。
在下文中，将详细地描述本发明。
本发明涉及由下式1表示的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐。
[式1]
本发明人已新合成了N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的化合物的甲磺酸盐，该甲磺酸盐相比于游离碱形式的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的化合物具有优异的溶解度和生物利用率，相比于该化合物的其它药学上可接受的盐具有优异的稳定性、溶解度和生物利用率，并且具有高纯度，从而完成本发明。
通常，盐酸盐占由FDA批准的可商购获得的化合物的盐的最大比例。然后，硫酸盐、溴化物、亚氯酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和苹果酸盐按照它们的顺序占较大比例。甲磺酸盐仅占约2％。即，特定化合物的甲磺酸盐通常并非为可选的盐。但是，本发明人通过反复研究已发现，N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐相比于其它药学上可接受的盐具有优异的稳定性、溶解度和生物利用率，并且具有高纯度。此外，本发明人已对其大规模制备进行了大量研究。因此，本发明人已完成了本发明。
在本发明的一个方面，由上式1表示的甲磺酸盐的特征在于其为结晶形式，并且结晶形式落在本发明的范围内。药物化合物的结晶形式在合适制剂的开发中可为重要的。某些结晶形式相比于其它结晶形式可具有改善的溶解度、稳定性和生物利用率，并且具有高纯度。因此，它们可被选择为良好的药物候选物。某些结晶形式的优点在于其具有改善的热力学稳定性。
在本发明的一个方面，由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式可为结晶形式(I)。优选的是，PXRD图中的衍射峰存在于5.614±0.2、12.394±0.2、14.086±0.2、17.143±0.2、18.020±0.2、19.104±0.2、21.585±0.2、22.131±0.2和22.487±0.2度的2θ(theta)角度处；并且更优选的是，PXRD图中的衍射峰存在于5.614、12.394、14.086、17.143、18.020、19.104、21.585、22.131和22.487度的2θ角度处。但本发明并不局限于此。
在本发明的另一方面，由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)在DSC(差示扫描量热法)图中可具有位于210℃至230℃，优选地217℃±2℃处的吸热转变峰值；并且优选的是，起始点为214℃±2℃。但本发明并不局限于此。
此外，本发明涉及一种用于制备由下式1表示的甲磺酸盐的方法，该方法包括：(1)将由下式2表示的化合物与单一有机溶剂或混合溶剂混合，然后向其添加甲磺酸，以制备由式1表示的甲磺酸盐的混合物；以及
(2)将有机溶剂添加到该混合物以使由式1表示的甲磺酸盐结晶：
[式1]
[式2]
由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)可通过该制备方法制备。但本发明并不局限于此。
在本发明的一个方面，步骤(1)的单一有机溶剂并未具体限定，只要其适用于本发明即可。并且其优选地为选自丙酮、甲基乙基酮和乙酸乙酯中的一种。如果使用这种单一有机溶剂，则有利的是可稳定地制备由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)。
在本发明的另一方面，步骤(1)的混合溶剂可为水与至少一种合适有机溶剂的混合溶剂。具体地，其优选地为水与选自丙酮和甲基乙基酮中的至少一种有机溶剂的混合溶剂。但本发明并不局限于此。如果使用这种混合溶剂，则有利的是可稳定地制备由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)。
在本发明的另一方面，水与有机溶剂的混合比率按体积计可为1∶1至1∶10，具体地1∶4至1∶6。但本发明并不局限于此。
在本发明的一个方面，步骤(1)可在20℃至70℃的温度下，优选地在45℃至60℃的温度下进行。在上述温度范围内，有利的是能够改善由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)的质量。
同时，步骤(2)为通过将有机溶剂添加到它们的混合物来使由式1表示的甲磺酸盐结晶的步骤。具体地，在步骤(2)中，可通过将有机溶剂添加到它们的混合物、搅拌所得混合物、冷却和过滤混合物、以及干燥所得固体来使由式1表示的甲磺酸盐结晶。
在本发明的一个方面，用于步骤(2)中的有机溶剂可与用于步骤(1)中的单一有机溶剂相同和不同。具体地，用于步骤(2)中的有机溶剂可为选自丙酮、甲基乙基酮和乙酸乙酯中的至少一种。但本发明并不局限于此。
此外，在步骤(2)中，可基于1g由式2表示的化合物以在3mL至20mL范围内的体积添加有机溶剂。具体地，在步骤(2)中，可基于1g由式2表示的化合物以在5mL至20mL范围内的体积，更具体地以在5mL至10mL范围内的体积添加有机溶剂。但本发明并不局限于此。当以上述体积添加有机溶剂时，有利的是可最小化由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)的收率的降低。
在本发明的另一方面，可在步骤(2)中将混合物冷却到0℃至30℃的温度，优选地冷却到0℃至10℃的温度。如果将混合物冷却到上述温度范围，则有利的是可最小化由上式1表示的甲磺酸盐的结晶形式(I)的收率的降低。
在本发明的另一方面，可在步骤(2)中的冷却之后在30℃至70℃的温度下干燥残余混合物。如果在上述温度范围下干燥残余混合物，则有利的是可有效地除去溶剂残余物。
此外，本发明提供了一种用于治疗蛋白激酶介导的病症的药物组合物，该药物组合物包含由上式1表示的甲磺酸盐和药学上可接受的添加剂。
此外，本发明提供了一种用于抑制相比于野生型EGFR具有一个或多个突变的表皮生长因子受体(EGFR)的药物组合物，该药物组合物包含由上式1表示的甲磺酸盐和药学上可接受的添加剂。
在本发明的一个方面，突变可为Del E746-A750、L858R或T790M，并且其可为选自Del E746-A750/T790M或L858R/T790M的双突变。
在本发明的一个方面，药物组合物可用于预防或治疗同种异体移植排斥、移植物抗宿主病症、糖尿病性视网膜病变、因年龄相关性年龄相关性黄斑变性产生的脉络膜新生血管、银屑病、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、关节炎中的滑膜血管翳形成、多发性硬化症、重症肌无力、糖尿病、糖尿病血管病症、早产儿视网膜病变、婴幼儿血管瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、头颈癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、纤维症、动脉粥样硬化、再狭窄、自体免疫病症、过敏症、呼吸病症、哮喘、移植排斥、炎症、血栓形成、视网膜血管增生、炎症性肠病症、克隆氏病、溃疡性结肠炎、骨病症、移植物或骨髓移植排斥、狼疮、慢性胰腺炎、恶病质、脓毒症性休克、纤维增生性和差异性皮肤疾病或病症、中枢神经系统病症、神经退化性病症、阿尔茨海默病、帕金森氏病、与脑或脊髓损伤或者外显子变性之后的神经损伤相关联的病症或病况、急性或慢性癌、眼部病症、病毒感染、心脏病症、肺病症或肾病症、以及支气管炎。优选地，药物组合物可用于预防或治疗急性或慢性癌，更优选地肺癌，最优选地非小细胞肺癌或脑转移性非小细胞肺癌，但并不局限于此。
在本发明的一个方面，药物组合物可抑制相比于野生型EGFR具有至少一个突变的表皮生长因子受体(EGFR)，并且因此可用于预防或治疗该疾病。
本发明的化合物可以治疗有效量单独施用或作为药物组合物的一部分施用，并且药物组合物有利于将化合物施用到生物体中。此外，化合物和组合物可单独施用或者与一种或多种附加的治疗剂联合施用。存在多种用于施用化合物和组合物的技术，该技术包括静脉施用、吸入、口服、直肠施用、肠胃外施用、玻璃体内施用、皮下施用、肌内施用、鼻内施用、透皮施用、局部施用、眼部施用、口腔施用、气管施用、支气管施用、舌下施用或视神经施用，但并不局限于此。本文提供的化合物以公开已知的药物剂型施用，例如，用于口服的片剂、胶囊或酏剂，用于直肠施用的栓剂，用于肠胃外或肌内施用的无菌溶液或悬浮液，用于局部施用的洗剂、凝胶、软膏或霜膏等。
包含在本发明的药物组合物中的由式(1)表示的甲磺酸盐的优选剂量根据患者的病况和体重、疾病的程度、药物的类型、施用的途径和持续时间而变化，但该剂量可由本领域的普通技术人员适当地选择。一般来讲，由式(I)表示的甲磺酸盐的优选剂量可在约10mg/天至约1000mg/天的范围内。
作为用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的添加剂，可使用至少一种常用的稀释剂或赋形剂，诸如润湿剂、崩解剂、润滑剂、粘结剂、表面活性剂等。
药学上可接受的添加剂可包括科利当、紫胶、***树胶、滑石、氧化钛、糖(例如，蔗糖)、明胶、水、多糖诸如乳糖或葡萄糖、石蜡(例如，石油馏分)、植物油(例如，花生油或芝麻油)、以及药学上可接受的有机溶剂诸如醇(例如，乙醇或甘油)、天然矿物粉末(例如，高岭土、粘土、滑石和白垩)、合成矿物粉末(例如，高度分散的硅酸和硅酸盐)、乳化剂(例如，木素、亚硫酸盐溶液、甲基纤维素、淀粉和聚乙烯基吡咯烷酮)、硬脂酸镁、硬脂酸、月桂基硫酸钠等，但并不局限于此。
本发明提供了由上式1表示的甲磺酸盐的用途，该甲磺酸盐用于制造药剂，该药剂用于治疗蛋白激酶介导的病症。
另外，本发明提供了由上式1表示的甲磺酸盐的用途，该甲磺酸盐用于制造药剂，该药剂用于抑制相比于野生型EGFR具有至少一个突变的表皮生长因子受体(EGFR)的活性。
本发明提供了一种用于治疗蛋白激酶介导的病症的方法，该方法包括将由上式1表示的甲磺酸盐施用给受检者的步骤。
另外，本发明提供了一种用于抑制相比于野生型EGFR具有至少一个突变的表皮生长因子受体(EGFR)的活性的方法，该方法包括将由上式1表示的甲磺酸盐施用给受检者的步骤。
本发明的模式
在下文中，将提供本发明的优选的实施例，以便于理解本发明。然而，这些实施例仅示出了本发明，并且对于本领域的技术人员将显而易见的是，可在本发明及其技术构思的范围内作出各种变化和修改，并且此类变化和修改在所附权利要求书的范围内。
实施例
实施例1：N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐的制备
向反应器中装入通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺(1,100.0g，1,983.2mmol)、丙酮(4.4L)和纯化水(1.1L)，同时在加热到45℃至55℃的情况下进行搅拌。将甲磺酸(186.8g，1,943.6mmol)在纯化水(0.55L)中稀释，将其滴加到上述混合物同时保持在45℃或更高温度。然后，将混合物搅拌30分钟或更长时间，以制备N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐的混合物。
然后，为了使混合物中的甲磺酸盐结晶，在40℃至50℃下滴加丙酮(8.8L)，搅拌30分钟或更长时间，冷却到0℃至5℃，并且搅拌3小时或更长时间。将丙酮(8.8L)滴加到混合物同时保持在40℃至50℃，并且将混合物搅拌30分钟或更长时间，冷却到0至5℃，并且搅拌3小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且然后用丙酮(5.5L)洗涤湿滤饼。将由此获得的固体在55℃下进行真空干燥以获得1,095.8g的标题化合物(收率：84.9％)。
用1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)测量标题化合物的结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.79(s，1H)，9.35(s，1H)，9.21(s，1H)，8.78(s，1H)，8.59(d，1H)，8.33(s，1H)，7.77(d，2H)，7.55(m，3H)，7.34(d，1H)，6.94(s，1H)，6.71-6.76(q，1H)，6.28-6.31(d，1H)，5.81-5.83(d，1H)，4.48(s，2H)，3.90(s，3H)，3.81-3.83(t，4H)，2.86-2.88(t，4H)，2.66(s，6H)，2.35(s，3H)。
通过差示扫描量热法(DSC)测量标题化合物。因此，DSC图具有位于约217℃处的吸热转变峰。使用Mettler Toledo DSC 1STAR(样品容器：99％氮气条件下的密封铝盘并且温度以10℃/min的速率从30℃升高到300℃)执行DSC测量。
通过PXRD测量标题化合物，由此显示出PXRD图中的衍射峰存在于5.614、12.394、14.086、17.143、18.020、19.104、21.585、22.131和22.487度的2θ角度处(参见图1)。使用Bruker D8 advance(X射线源：CuKα，管电压：40kV/管电流：40mA，发散狭缝：0.3，和散射狭缝：0.3)获得化合物的PXRD谱。
比较例1：游离碱形式的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的制备
通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备游离碱形式的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺。
比较例2：N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的盐酸盐的制备
向反应器中装入通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺(50.00g，90.1mmol)、丙酮(450mL)和纯化水(50mL)，将它们冷却到0℃至5℃。将盐酸(9.39g，90.1mmol)在丙酮(50mL)中稀释，将其滴加到上述混合物同时保持在0℃至5℃。然后，将混合物调节到20℃至25℃，并且搅拌2小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且将由此获得的固体进行真空干燥以获得49.91g的标题化合物(收率：93.7％)。
在与实施例1相同的条件下测量标题化合物。用1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)测量的结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.82(s，1H)，9.36(s，1H)，9.26(s，1H)，8.69(s，1H)，8.57(d，1H)，8.39(s，1H)，7.77(d，2H)，7.49-7.57(m，3H)，7.33(d，1H)，6.94(s，1H)，6.69-6.76(q，1H)，6.28(d，1H)，5.78(d，1H)，4.42(d，2H)，3.89(s，3H)，3.81(s，4H)，2.88(s，4H)，2.58(d，6H)
比较例3：N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的柠檬酸盐的制备
向反应器中装入通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺(15.00g，27.0mmol)以及乙酸乙酯(600mL)，将它们在回流下进行搅拌以溶解反应混合物。将柠檬酸(5.68g，29.6mmol)溶解于丙酮(25mL)中，将其滴加到50℃至70℃下的上述混合物。然后，将反应混合物冷却到20℃至30℃，并且搅拌2小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且然后周乙酸乙酯(300mL)洗涤湿滤饼。将由此获得的固体进行真空干燥以获得20.15g的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸盐作为粗制化合物(收率：99.8％)。
向反应器中装入N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸盐的粗制化合物(18.70g)和纯化水(187mL)，将它们在20℃至30℃下搅拌2小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且将由此获得的固体进行真空干燥以获得15.67g的标题化合物(收率：83.8％)。
在与实施例1相同的条件下测量标题化合物。用1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)测量的结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.22(s，1H)，9.17(s，1H)，8.97(s，1H)，8.54(d，1H)，8.24(s，1H)，7.93(d，2H)，7.43-7.53(m，3H)，7.33(d，1H)，6.95(s，1H)，6.71-6.78(q，1H)，6.36(d，1H)，5.82(d，1H)，3.90(s，3H)，3.82(s，6H)，2.86(s，4H)，2.50-2.71(d，4H)，2.37(s，6H)
比较例4：N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的乙磺酸盐的制备
向反应器中装入通过WO 2016-060443中所公开的相同方法制备的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺(15.00g，27.0mmol)以及四氢呋喃(300mL)，将它们进行搅拌。将乙磺酸(2.98g，27.1mmol)在四氢呋喃(45mL)中稀释，将其滴加到上述混合物同时保持在20℃至25℃。然后，将反应混合物在室温下搅拌11小时或更长时间。在减压下过滤反应混合物，并且将由此获得的固体进行真空干燥以获得16.20g的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的乙磺酸盐(收率：90.1％)作为标题化合物。
在与实施例1相同的条件下测量N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺乙磺酸盐的标题化合物。用1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)测量的结果如下：
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.69(s，1H)，9.34(s，1H)，9.22(s，1H)，8.75(s，1H)，8.58(d，1H)，8.36(s，1H)，7.77(d，2H)，7.52-7.58(q，3H)，7.33(d，1H)，6.94(s，1H)，6.69-6.76(q，1H)，6.26(d，1H)，5.80(d，1H)，4.46(s，2H)，3.89(s，3H)，3.82(s，4H)，2.87(s，4H)，2.65(s，6H)，2.34-2.39(q，2H)，1.03-1.06(t，3H)
测试实施例
测试实施例1：溶解度测试
测试实施例1和比较例1中制备的化合物的随pH而变化的溶解度，并且将人工胃液、人工肠液、水和乙醇中的溶解度进行比较。
将实施例1中制备的120mg化合物(对应于100mg式2的化合物)添加到5mL缓冲液(其具有下表1所述的pH中的每一个)、人工胃液、人工肠液、水或乙醇中，将其在37℃水浴中以50rpm的条件搅拌12小时。此外，在与上述相同的条件下测试比较例1中制备的100mg化合物。搅拌之后，测量由式2表示的溶解化合物的浓度，并且将实施例1和比较例1中制备的化合物的溶解度进行比较。结果示于图3和下表1中。
[表1]
如图3和上表1中所示，相比于比较例1中制备的游离碱形式的化合物，实施例1中制备的甲磺酸盐形式的化合物具有至少20,000倍的水中溶解度、约10倍的人工胃液(FaSSGF)中溶解度、和约25倍的人工肠液(FaSSIF)中溶解度。
测试实施例2和3：稳定性测试
各自测试实施例1和比较例2至4中制备的化合物的稳定性。测试五种化合物在应力条件和加速条件下的稳定性。这两种条件具体地示于下表2中。
[表2]
测试实施例2：实施例1和比较例2至4中制备的化合物在应力条件下的稳定性测试
在如上表2中给定的应力条件下，各自测试实施例1和比较例2至4中制备的化合物的稳定性。结果示于图4至7以及下表3和4中。PXRD和DSC测量的条件与实施例1中所述的条件相同。
[表3]
此外，高性能液相色谱法(HPLC)测量的结果示于下表4中，并且测量条件如下：
流动相缓冲液：250mM乙酸铵水溶液(流动相A：缓冲液/水/乙腈，流动相B：乙腈，柱：Xbridge BEH C18 XP)。
[表4]
测试实施例3：实施例1和比较例2至4中制备的化合物在加速条件下的稳定性测试
在如上表2中给定的加速条件下，各自测试实施例1和比较例2至4中制备的化合物的稳定性。结果示于图8至11以及下表5和6中。PXRD和DSC测量的条件与实施例1中所述的条件相同。
[表5]
W：白色，Y：黄色，LY：浅黄色，V：紫色，LV：浅紫色
此外，高性能液相色谱法(HPLC)测量的结果示于下表6中，并且测量条件如测试实施例2中所述：
[表6]
根据上述稳定性测试的结果，实施例1中制备的化合物具有优异的稳定性，因为其在稳定性测试开始和结束时示出极少的纯度和水含量变化，不存在PXRD图案变化，并且不存在以颜色观察的外观变化。相比之下，比较例2至4的化合物具有较差的稳定性，因为它们相比于实施例1中制备的化合物示出较大的纯度和水含量变化，并且观察到PXRD图案和外观的一些变化。
测试实施例4：实施例1和比较例1中制备的化合物在正常大鼠和用埃索美拉唑处理的大鼠中的药代动力学比较测试
各自测试实施例1和比较例1中制备的化合物在正常大鼠和用埃索美拉唑(其为质子泵抑制剂)处理的大鼠中的药代动力学。具体地，比较正常大鼠和用埃索美拉唑处理的大鼠中的最大血药浓度(Cmax)和血药浓度曲线下方的面积(AUClast)，以评估药物在实际动物中的吸收。
为了比较药代动力学参数，将体重为约250g的8周龄雄性大鼠(SD大鼠)用作测试动物。并且将实施例1和比较例1中制备的化合物各自悬浮于0.5％甲基纤维素中，并且以30mg/5mL/kg的剂量口服施用给正常大鼠。
同时，将埃索美拉唑(埃索美拉唑镁二水合物，Sigma Aldrich)以5mg/2mL/kg的剂量静脉施用给体重为约250g的8周龄雄性大鼠并持续3天，并且将实施例1和比较例1中制备的化合物各自以与施用给正常大鼠的剂量相同的剂量(即，30mg/5mL/kg)口服施用给大鼠。由其计算出的药代动力学参数(即，最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积)的比较示于表7以及图12和13中。
[表7]
如上述结果所示，在正常大鼠中，游离碱形式的化合物(比较例1)的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别比甲磺酸盐形式的化合物(实施例1)的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积低11.0％和10.4％。在用埃索美拉唑处理的大鼠中，前者的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别比后者的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积低47.8％和49.4％。即，已得到确认的是，相比于实施例1中制备的化合物，比较例1中制备的化合物对大鼠具有较低的暴露量。
此外，相比于正常大鼠，实施例1中制备的化合物的在用埃索美拉唑处理的大鼠中的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别降低47.6％和36.0％。相比之下，相比于正常大鼠，比较例1中制备的化合物的在用埃索美拉唑处理的大鼠中的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别降低69.3％和63.8％。根据这些结果得到确认的是，实施例1中制备的化合物相比于比较例1中制备的化合物具有较低的因埃索美拉唑施用而产生的药代动力学变化；因此，前者在大鼠中保持高血药浓度。
测试实施例5：实施例1和比较例1中制备的化合物在比格犬中的药代动力学比较测试
为了比较药代动力学参数，将体重为约10kg的15至17月龄雄性比格犬用作测试动物，并且将实施例1和比较例1中制备的化合物各自悬浮于0.5％甲基纤维素中并以5mg/2mL/kg的剂量口服施用给比格犬。由其计算出的药代动力学参数(即，最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积)的比较示于表8和图14中。
[表8]
实施例1
比较例1
最大血药浓度(C<sub>max</sub>，ng/mL)
134.7
80.7
血药浓度曲线下方的面积(AUC<sub>last</sub>，ng·h/mL)
811.5
379.1
如上述结果所示，在比格犬中，游离碱形式的化合物(比较例1)的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积分别比甲磺酸盐形式的化合物(实施例1)的最大血药浓度和血药浓度曲线下方的面积低40.1％和50.4％。根据这些结果得到确认的是，相比于比较例1中制备的化合物，实施例1中制备的化合物在比格犬中示出较高的暴露量。
如上所述，根据本发明的N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的甲磺酸盐化合物产生了优异的效果，因为其相比于N-(5-(4-(4-((二甲基氨基)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-2-吗啉代苯基)丙烯酰胺的游离碱化合物具有优异的溶解度和生物利用率，其相比于其它药学上可接受的盐具有改善的稳定性、溶解度和生物利用率，并且其具有高纯度。
在上文中，已基于优选的实施例解释了本发明。然而，对于本领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离如权利要求中所述的本发明的技术构思的情况下通过添加、修改和删除构成元件来作出各种变化和修改，并且此类变化和修改在本发明的范围内。