阅读说明：本技术 一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养的效率的方法 (Method for improving in-vitro suspension culture efficiency of human multifunctional stem cells ) 是由 段玉友 唐湘莲 吴海滨 陈洪林 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于细胞培养的技术领域,公开了一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养的效率的方法。所述提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法：将人多功能干细胞用含聚乙烯醇或葡聚糖硫酸酯与聚乙烯醇的培养基进行三维培养；所述葡聚糖硫酸酯在培养基中的浓度为10～100ug/ml；所述聚乙烯醇在培养基中的浓度为0.1～1mg/ml。本发明的方法不仅能够减少细胞聚集体的大小且得到尺寸均一的聚集体,还能达到较高的细胞数量以满足体外扩增人多功能干细胞的需求,提高了人多功能干细胞的培养效率。(The invention belongs to the technical field of cell culture, and discloses a method for improving the efficiency of in-vitro suspension culture of human multifunctional stem cells. The method for improving the in vitro suspension culture efficiency of the human pluripotent stem cells comprises the following steps: carrying out three-dimensional culture on the human pluripotent stem cells by using a culture medium containing polyvinyl alcohol or dextran sulfate and polyvinyl alcohol; the concentration of the dextran sulfate in the culture medium is 10-100 ug/ml; the concentration of the polyvinyl alcohol in the culture medium is 0.1-1 mg/ml. The method of the invention not only can reduce the size of the cell aggregate and obtain the aggregate with uniform size, but also can reach higher cell number to meet the requirement of in vitro amplification of the human pluripotent stem cells, thereby improving the culture efficiency of the human pluripotent stem cells.)

一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养的效率的方法

技术领域

本发明属于细胞培养的技术领域，具体涉及一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法。

背景技术

人胚胎干细胞(hESC)和人诱导的多功能干细胞(hiPSC)统称人多功能干细胞(hPSC))，在细胞治疗、组织工程和再生医学以及药物研发和生物技术应用上有着巨大的前景。传统的利用塑料培养板和异源培养基进行细胞扩增的二维(2D)培养技术扩增细胞效率有限，且长期传代扩增后，细胞会失去干性和分化能力。为了获得高数量和高质量的人多功能干细胞，应用了以生物反应器为基础的模拟生物体内三维环境(3D)培养技术进行人多功能干细胞的大规模扩增。目前，在生物反应器中以单细胞形式接种后以细胞聚集体形式进行扩增的策略与微载体培养策略相比，具有节约成本且细胞易于回收等优势，但该策略形成了尺寸较大且大小不均匀的团聚体。由于大聚集体(＞300μm)直径较大，营养物质及氧分难以扩散到聚集体中心而导致细胞分化或死亡。

聚集体大小控制是以聚集体方式培养细胞策略的一个关键参数，可以通过控制剪切力的物理方法以及加入小分子等化学方法控制聚集体尺寸以获得较均一的细胞聚集体产物。聚硫酸化合物广泛应用于生物制药行业，它们不仅能够通过调节细胞表面的电荷来减少细胞聚集，而且对细胞具有抗凋亡作用。同时有文献报道葡聚糖硫酸酯(DS)可以减少hPSCs的细胞聚集而不降低其多能性。Lipsitz YY等人[1Lipsitz YY，Tonge PD，ZandstraPW.Chemically controlled aggregation of pluripotent stem cells.BiotechnolBioeng 2018；115(8)：2061-6.]报道了40000kDA(D40)、100ug/mlDS条件下悬浮培养细胞能使得hPSCs聚集体保持较小、均一的尺寸进行扩增且多能性、核型保持稳定。Nogueira等人[Nogueira，D.E.S.，Rodrigues，C.A.V.，Carvalho，M.S.et al.Strategies for theexpansion of human induced pluripotent stem cells as aggregates in single-useVertical-Wheel^TM bioreactors.J Biol Eng 2019；13，74.]报道了利用一次性立式滚轮反应器结合100ug/mlDS获得(2.3±0.2)×10⁶cells/mL的细胞且收获平均直径346±11μm的细胞聚集体，其多能性、核型保持稳定。虽然使用DS能通过调节细胞表面的电荷来减少细胞聚集，有利于得到尺寸均一、利于回收的高质量小细胞聚集体，但细胞扩增倍数未能得到提升即细胞数量仍然达不到要求。

本发明将DS(葡聚糖硫酸酯)与PVA组合使用，提高了干细胞体外悬浮培养的效率，在以细胞聚集体形式扩增策略中控制了细胞聚集体尺寸的大小并且提高了细胞的扩增倍数，所回收的细胞多能性能够得到维持，满足体外扩增的需求。PVA和DS的结合使用不仅能够得到尺寸均一的聚集体，还能达到较高的细胞数量以满足临床需求。

发明内容

针对以上技术的不足之处，本发明的目的是提供一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法。本发明使用PVA能够对hPSCs具有促增殖的作用，进一步地将DS(葡聚糖硫酸酯)与PVA组合使用，不仅能够得到尺寸均一的聚集体，还能达到较高的细胞数量，提高了干细胞体外悬浮培养的效率。本发明的方法能够大规模体外悬浮培养hPSC。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法，包括以下步骤：将人多功能干细胞用含PVA(聚乙烯醇)或DS(葡聚糖硫酸酯)与PVA(聚乙烯醇)的培养基进行三维培养。

所述DS(葡聚糖硫酸酯)在培养基中的浓度为10～100ug/ml，其分子量为40000kDA(D40)；

所述PVA在培养基中的浓度为0.1～1mg/ml。

当选用含DS(葡聚糖硫酸酯)与PVA(聚乙烯醇)的培养基进行三维培养时，DS(葡聚糖硫酸酯)在培养基中的浓度优选为100ug/ml，PVA在培养基中的浓度优选为1mg/ml。

所述培养基为无血清完全培养基，优选为mTeSR1培养基。

所述培养基中还添加了Y-27632(Rocki)。

三维培养48h后用含PVA的培养基进行换液，每天60％量换液一次。

所述提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法，具体包括以下步骤：

S1单细胞传代人多功能干细胞(hPSC)：在hPSC传代后，选取覆盖率达70％-80％，克隆边缘规整且无分化的细胞，并将其制成单细胞悬浮液；

S2细胞接种：在培养装置中依次加入培养基、Y-27632(Rocki)，随后加入终浓度为0.1～1mg/ml PVA或终浓度10-100ug/mLDS和O.1～1mg/ml PVA，将单细胞悬浮液接种至培养装置中，摇晃培养装置使细胞均匀悬浮在培养液中；

S3细胞换液：培养48h后，用含PVA的培养基进行换液，每天60％量换液一次；

S4收获细胞：培养5～6天，收集细胞。

步骤S2中所述培养装置为低粘附培养装置，如：商业化的低粘附孔板，采用常规方法制备的低粘附孔板：所述常规方法制备的粘附孔板具体步骤：采用DMEM/F12培养基稀释Pluronic-F68，获得稀释的Pluronic-F68(DMEM/F12∶Pluronic-F68＝1∶1(体积比))；将稀释的Pluronic-F68铺在孔板中，将孔板置于CO₂培养箱中孵育。

步骤S1中所述单细胞悬浮液具体制备步骤：在hPSC传代时，选取覆盖率达70％-80％，克隆边缘规整且无分化细胞的培养孔，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1mL GCDR(细胞解离试剂)，放回CO₂培养箱中孵育5-10分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1mL mTeSR1培养基，将细胞吹打下来并用移液器吹成单细胞悬液。

步骤S2中单细胞悬浮液为50万单细胞的细胞悬液。步骤S2中所述培养基为无血清完全培养基，优选为mTeSR1培养基。

Y-27632(Rocki)的加入量为10uM。

步骤S3中所述培养基为无血清完全培养基，优选为mTeSR1培养基。

含PVA的培养基中PVA的终浓度为0.1～1mg/ml。

步骤S4中培养完成后，离心，弃上清液，加入PBS清洗细胞聚集体，离心，弃上清液后加入胰蛋白酶，室温消化9～12分钟，加入含血清培养基终止消化，获得细胞。所述离心的条件为1500rpm离心5分钟；所述胰蛋白酶选用0.25％胰蛋白酶。

本发明将低浓度PVA与40000kDA(D40)、100ug/ml DS相结合使用体外悬浮培养hPSCs，两者的结合使用能够提高细胞扩增的效率，使得所收获的细胞聚集体保持较小、均一的尺寸，这种细胞聚集体质量较高，聚集体中心不会因为尺寸较大而缺乏养分以及氧气，并且所回收的聚集体易于消化成单细胞进而进行传代或者临床使用。

相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

现有技术使用DS，通过调节细胞表面的电荷来减少细胞聚集，得到尺寸均一、利于回收的高质量小细胞聚集体，但是该技术细胞扩增倍数未能得到提升即细胞数量仍然达不到要求。而本发明使用低浓度的PVA与40000kDA(D40)、100ug/ml DS，不仅能够减少细胞聚集体的大小且得到尺寸均一的聚集体，还能达到较高的细胞数量以满足体外扩增人多功能干细胞的需求。

附图说明

图1为实施例1中3D悬浮培养+100ug/mL DS+1mg/mL PVA所获得细胞的表征图；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图；

图2为实施例2中3D悬浮培养+100ug/mL DS+0.1mg/mL PVA所获得细胞的表征图；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图；

图3为实施例3中3D悬浮培养+10ug/mL DS+1mg/mL PVA所获得细胞的表征图；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图；

图4为对比例1中3D悬浮培养hPSC+葡聚糖硫酸酯所获得细胞的表征图，对照组不加DS，实验组1加10ug/mL DS，实验组2加100ug/mL DS；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图；E为培养5天qPCR检测干性基因表达结果对比图；

图5为对比例2中3D悬浮培养hPSC+聚乙烯醇(PVA)所获得细胞的表征图，对照组不加PVA，实验组加入1mg/mL PVA；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图；E为培养5天qPCR检测干性基因表达结果对比图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。葡聚糖硫酸酯DS：厂商：SIGMA，Mr(相对分子质量)～10000，使用浓度：100ug/ml储存浓度：100mg/ml即500mgDS充分溶于5ml无菌水中4度保存。DS在接种细胞时添加入培养基中，细胞培养至48h时更换60％培养基，更换的培养基无需再添加使用浓度的DS即DS仅作用48h。

PVA：厂商：ALDRICH，Mw 31000-500000，水解度87％-89％。

使用浓度：0.1mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml。储存浓度：100mg/ml即1gPVA充分溶于1ml无菌水中常温保存。低浓度PVA(0.1-1mg/ml)在接种细胞时添加入培养基中，细胞培养至48h时更换60％培养基，更换的培养基持续添加使用浓度的PVA即PVA作用于整个培养周期。

实验材料：六孔板；mTeSR1；GCDR；PBS；台盼蓝；Y-27632；0.25％胰酶；Pluronic-F68；PVA；DS。

实施例1：3D悬浮培养+100ug/mL DS+1mg/mL PVA

一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法，具体包括以下步骤：

S1.预铺Pluronic-F68制备低粘附孔：在六孔板中以2mL/孔的体积预铺稀释好的Pluronic-F68(DMEM/F12∶Pluronic-F68＝1∶1)，将孔板放回CO₂培养箱中孵育1小时以上；

S2.单细胞传代hPSC：选取状态良好的hPSC一孔(状态良好：在hPSC传代后4-5天时，细胞覆盖率达70％-80％左右，克隆边缘规整且无分化细胞的hPSC)，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1mL GCDR，放回CO₂培养箱中孵育5-10分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1mL mTeSR1培养基，将细胞吹打下来并用移液器吹成单细胞悬液；

S3.细胞接种：吸取20ul单细胞悬液，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；取出预铺好Pluronic-F68的孔板，吸弃Pluronic-F68稀释液，加入5mL mTeSR1并加入10uM的Y-27632(Rocki)以提高单细胞接种的存活率，另外在孔中分别加入终浓度100ug/mL的DS溶液+1mg/mL PVA溶液；吸取含有50万单细胞的细胞悬液并接种到孔中，十字交叉摇晃孔板以使细胞均匀悬浮在培养液中；

S4.细胞换液：在48h后每孔每天换液60％即3mL mTeSR1培养基以及加入对应浓度的PVA溶液(1mg/mL)，DS溶液不再加入培养基中；

S5.细胞收获：培养到第5天时，对聚集体进行拍照，统计聚集体直径；之后收集细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL PBS清洗细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL 0.25％胰酶，室温消化10分钟后加入1mL含血清培养基终止消化，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；每孔取样3次并计数三次，最终细胞总数取平均数。

实验结果见图1，图1中对照组不加入PVA+DS，实验组加入100ug/mL的DS溶液+1mg/mL PVA。图1为实施例1中，3D悬浮培养+100ug/mL DS+1mg/mL PVA所获得细胞的表征图；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图。

实施例2：3D悬浮培养+100ug/mL DS+0.1mg/mL PVA

一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法，具体包括以下步骤：

S1.预铺Pluronic-F68制备低粘附孔：在六孔板中以2mL/孔的体积预铺稀释好的Pluronic-F68(DMEM/F12∶Pluronic-F68＝1∶1)，将孔板放回CO2培养箱中孵育1小时以上；

S2.单细胞传代hPSC：选取状态良好的hPSC一孔，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1mL GCDR，放回CO2培养箱中孵育5-10分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1mL mTeSR1培养基，将细胞吹打下来并用移液器吹成单细胞悬液；

S3.细胞接种：吸取20ul单细胞悬液，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；取出预铺好Pluronic-F68的孔板，吸弃Pluronic-F68稀释液，加入5mL mTeSR1并加入10uM的Y-27632(Rocki)以提高单细胞接种的存活率，另外在孔中分别加入终浓度100ug/mL的DS溶液+0.1mg/mL PVA溶液；吸取含有50万单细胞的细胞悬液并接种到孔中，十字交叉摇晃孔板以使细胞均匀悬浮在培养液中；

S4.细胞换液：在48h时每孔每天换液60％即3mL mTeSR1培养基以及加入对应浓度的PVA溶液，DS溶液不再加入培养基中；

S5.细胞收获：培养到第5天时，对聚集体进行拍照，统计聚集体直径；之后收集细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL PBS清洗细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL 0.25％胰酶，室温消化10分钟后加入1mL含血清培养基终止消化，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；每孔取样3次并计数三次，最终细胞总数取平均数。

实验结果见图2，对照组不加入PVA+DS，实验组加入100ug/mL的DS溶液+0.1mg/mLPVA。图2为实施例2中，3D悬浮培养+100ug/mL DS+0.1mg/mL PVA所获得细胞的表征图；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图。

实施例3：3D悬浮培养+10ug/mL DS+1mg/mL PVA

一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法，具体包括以下步骤：

S1.预铺Pluronic-F68制备低粘附孔：在六孔板中以2mL/孔的体积预铺稀释好的Pluronic-F68(DMEM/F12∶Pluronic-F68＝1∶1)，将孔板放回CO2培养箱中孵育1小时以上；

S2.单细胞传代hPSC：选取状态良好的hPSC一孔，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1mL GCDR，放回CO2培养箱中孵育5-10分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1mL mTeSR1培养基，将细胞吹打下来并用移液器吹成单细胞悬液；

S3.细胞接种：吸取20ul单细胞悬液，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；取出预铺好Pluronic-F68的孔板，吸弃Pluronic-F68稀释液，加入5mL mTeSR1并加入10uM的Y-27632(Rocki)以提高单细胞接种的存活率，另外在孔中分别加入终浓度10ug/mL的DS溶液+1mg/mL PVA溶液；吸取含有50万单细胞的细胞悬液并接种到孔中，十字交叉摇晃孔板以使细胞均匀悬浮在培养液中；

S4.细胞换液：在48h时每孔每天换液60％即3mL mTeSR1培养基以及加入对应浓度的PVA溶液，DS溶液不再加入培养基中；

S5.细胞收获：培养到第5天时，对聚集体进行拍照，统计聚集体直径；之后收集细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL PBS清洗细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL 0.25％胰酶，室温消化10分钟后加入1mL含血清培养基终止消化，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；每孔取样3次并计数三次，最终细胞总数取平均数。

实验结果见图3，对照组不加入PVA+DS，实验组加入10ug/mL的DS溶液+1mg/mLPVA。图3为实施例3中，3D悬浮培养+10ug/mL DS+1mg/mL PVA所获得细胞的表征图；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图。

对比例1：3D悬浮培养hPSC+葡聚糖硫酸酯(DS)

实验材料：六孔板；mTeSR1；GCDR；PBS；台盼蓝；Y-27632；0.25％胰酶；Pluronic-F68；DS；

实验流程：1.配置DS储存溶液：称取500mg DS至15mL离心管中，加入5mL灭菌三蒸水，37℃水浴溶解，0.22um滤头过滤除菌，存于4℃冰箱待用；

2.预铺Pluronic-F68制备低粘附孔：在六孔板中以2mL/孔的体积预铺稀释好的Pluronic-F68(DMEM/F12∶Pluronic-F68＝1∶1)，将孔板放回CO₂培养箱中孵育1小时以上；

3.单细胞传代hPSC：选取状态良好的hPSC一孔，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1mL GCDR，放回CO2培养箱中孵育5-10分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1mL mTeSR1培养基，将细胞吹打下来并用移液器吹成单细胞悬液；

4.细胞接种：吸取20ul单细胞悬液，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；取出预铺好Pluronic-F68的孔板，吸弃Pluronic-F68稀释液，加入5mL mTeSR1并加入10uM的Y-27632(Rocki)以提高单细胞接种的存活率，另外在2孔中分别加入终浓度为10ug/mL以及100ug/mL的DS溶液；吸取含有50万单细胞的细胞悬液并接种到孔中，十字交叉摇晃孔板以使细胞均匀悬浮在培养液中；

5.细胞换液：48h时每孔每天换液60％即3mL mTeSR1培养基以及加入对应浓度的DS溶液；

6.细胞收获：培养到第5天时，对聚集体进行拍照，统计聚集体直径；之后收集细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL PBS清洗细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL 0.25％胰酶，室温消化10分钟后加入1mL含血清培养基终止消化，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；每孔取样3次并计数三次，最终细胞总数取平均数；计数后剩余细胞提取RNA，逆转录为cDNA后进行qPCR检测干性基因表达水平。

实验结果见图4。图4为对比例1中3D悬浮培养hPSC+葡聚糖硫酸酯所获得细胞的表征图，对照组不加DS，实验组1加10ug/mL DS，实验组2加100ug/mL DS；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图；E为培养5天qPCR检测干性基因表达结果对比图。

对比例2：3D悬浮培养hPSC+聚乙烯醇(PVA)

实验材料：六孔板；mTeSR1；GCDR；PBS；台盼蓝；Y-27632；0.25％胰酶；Pluronic-F68；PVA；

实验流程：1.配置PVA储存溶液：称取1g PVA至15mL离心管中，加入10mL灭菌三蒸水，高压灭菌，常温储存待用；

2.预铺Pluronic-F68制备低粘附孔：在六孔板中以2mL/孔的体积预铺稀释好的Pluronic-F68(DMEM/F12∶Pluronic-F68＝1∶1)，将孔板放回CO2培养箱中孵育1小时以上；

3.单细胞传代hPSC：选取状态良好的hPSC一孔，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1mL GCDR，放回CO2培养箱中孵育5-10分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1mL mTeSR1培养基，将细胞吹打下来并用移液器吹成单细胞悬液；

4.细胞接种：吸取20ul单细胞悬液，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；取出预铺好Pluronic-F68的孔板，吸弃Pluronic-F68稀释液，加入5mL mTeSR1并加入10uM的Y-27632(Rocki)以提高单细胞接种的存活率，另外在孔中加入终浓度为1mg/mL的PVA溶液；吸取含有50万单细胞的细胞悬液并接种到孔中，十字交叉摇晃孔板以使细胞均匀悬浮在培养液中；

4.细胞换液：48h时每孔每天换液60％即3mL mTeSR1培养基以及加入对应浓度的PVA溶液；

5.细胞收获：培养到第5天时，对聚集体进行拍照，统计聚集体直径；之后收集细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL PBS清洗细胞聚集体，1500rpm离心5分钟，弃上清后加入1mL 0.25％胰酶，室温消化10分钟后加入1mL含血清培养基终止消化，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；每孔取样3次并计数三次，最终细胞总数取平均数；计数后剩余细胞提取RNA，逆转录为cDNA后进行qPCR检测干性基因表达水平。

实验结果见图5。图5为对比例2中3D悬浮培养hPSC+聚乙烯醇(PVA)所获得细胞的表征图，对照组不加PVA，实验组加入1mg/mL PVA；A为培养5天聚集体图像，B为培养5天细胞总数对比图，C为培养5天聚集体平均直径对比图，D为培养5天聚集体分布分布区间统计对比图；E为培养5天qPCR检测干性基因表达结果对比图。