一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法
阅读说明：本技术 一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法 (Method for improving pluripotency of bovine embryonic stem cells ) 是由 李雪玲 李琛 韩雪洁 相金柱 岳永莉 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法,包括向牛胚胎干细胞体外培养体系中添加终浓度为10-40μg/mL的抗肿瘤药物naringenin进行维持培养。通过多能性检测,结果表明naringenin可显著增强牛胚胎干细胞多能因子的表达,同时naringenin可促进牛胚胎干细胞系原有的多种表观形态趋向均一。本发明提供的应用抗肿瘤药物naringenin体外培养牛胚胎干细胞多能性的方法,为转基因克隆牛的研究与生产提供了可用于基因转染和体外长期培养筛选的牛胚胎干细胞,并可用于进一步地牛胚胎干细胞相关研究。(The invention provides a method for improving the pluripotency of bovine embryonic stem cells, which comprises the step of adding an antitumor drug naringenin with the final concentration of 10-40 mug/mL into a bovine embryonic stem cell in-vitro culture system for maintenance culture. The results of the pluripotency detection show that the naringenin can obviously enhance the expression of pluripotent factors of the bovine embryonic stem cells, and simultaneously, the naringenin can promote various original apparent forms of the bovine embryonic stem cell line to tend to be uniform. The method for in vitro culture of bovine embryonic stem cell pluripotency by using the antitumor drug naringenin provides bovine embryonic stem cells which can be used for gene transfection and in vitro long-term culture screening for research and production of transgenic cloned cows, and can be used for further research related to bovine embryonic stem cells.)
技术领域
本发明涉及细胞生物学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)是来源于植入前胚胎内细胞团(Innercell mass，ICM)，保持未分化状态并能够自我更新的多能性细胞，具有分化为机体所有细胞的潜力，可用于早期胚胎发育的研究。
目前牛胚胎干细胞建系和维持的方法存在一定的问题，如获得的牛胚胎干细胞多能性不理想、表型不均一、可应用性较差等。提高牛胚胎干细胞多能性，使其具有更广泛的可应用能力，具有重要生物学意义。
Naringenin(柚皮素)，化学名称为4,5,7-三羟基黄酮，分子式为C15H12O5，是一种黄酮类化合物，广泛存在于柑橘类水果、番茄、樱桃、葡萄柚等植物中。柚皮素已被报道具有许多药理特性，包括抗肿瘤、抗癌、抗炎症、心脏保护、抗血脂、抗肥胖、抗糖尿病和抗纤维化等。同时也具有广泛的生物学活性，例如自由基清除活性、抗氧化、抗增殖等。目前尚未见将naringenin应用于牛胚胎干细胞体外培养研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供抗肿瘤药物naringenin在牛胚胎干细胞体外培养中的应用，其中，化合物naringenin的结构如式1)所示：
第二方面，本发明提供一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法，包括：向牛胚胎干细胞的体外培养液中添加终浓度为10-40μg/mL的naringenin(优选10μg/mL、40μg/mL)进行牛胚胎干细胞的体外培养和传代。
牛胚胎干细胞对naringenin具有浓度依赖性，naringenin浓度为10μg/mL时，可达到最佳长期培养效果，牛胚胎干细胞多能性标记基因有明显上调。naringenin浓度为40μg/mL时，可达到最佳短期培养效果，牛胚胎干细胞多能性标记基因上调程度较10μg/mL时高。naringenin浓度为60μg/mL时，对牛胚胎干细胞具有较强毒性，牛胚胎干细胞增殖受到明显抑制，牛胚胎干细胞多能性标记基因上调程度较40μg/mL时低，但较对照组(未用naringenin培养的牛胚胎干细胞)明显升高。naringenin浓度为80μg/mL时，对牛胚胎干细胞具有明显毒性。
本发明使用的提高牛胚胎干细胞多能性的方法，体外培养液为含有10-40μg/mLnaringenin、20ng/mL rhFGF2(重组人成纤维细胞生长因子-2)、13.28mg/mL low fattyacid BSA(低脂肪酸牛血清蛋白)、2.5μΜIWR-1的TeSR-E6(TeSRTM-E6)培养基。
IWR-1为Wnt通路抑制剂，分子式为C25H19N3O3，结构式如下：
前述的方法，体外培养牛胚胎干细胞所采用的培养条件为：37℃，5％CO2，每天更换一次培养液。培养过程中需与丝裂霉素处理C57小鼠胎儿成纤维细胞获得的饲养层细胞共培养。
本发明中，细胞传代方法包括：提前准备铺有饲养层细胞(新鲜配制)的孔板；用TripLE Select消化牛胚胎干细胞3min，用DMEM/F12基础培养液终止消化，传代比例为1:4。
饲养层细胞的制备方法包括：解冻原代C57小鼠胎儿成纤维细胞，在37℃，5％CO2条件下进行扩增培养至P3代，待细胞密度达80％-90％，用含有12μg/mL丝裂霉素的小鼠胎儿成纤维细胞培养液处理2.5h后冻存。
其中，小鼠胎儿成纤维细胞培养液为：含10％FBS(胎牛血清)和1％Penicillin-Streptomycin的DMEM培养液。
饲养层细胞的使用方法包括：使用前一天解冻处理好的饲养层细胞过夜贴壁恢复活力后，与牛胚胎干细胞共培养。
本发明提供的一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法，还包括对体外培养和传代的牛胚胎干细胞进行冷冻保存的步骤。
冻存方法包括：用mFreSR干细胞冻存液进行程序化冷冻保存。
本发明中，牛ESCs是从牛的体外受精胚胎中获得的牛胚胎干细胞。
利用本发明提高牛胚胎干细胞多能性的方法获得的牛胚胎干细胞可在体外长期稳定传代，且细胞克隆形态均一。通过多种干细胞多能性手段检测证明牛胚胎干细胞多能性确实有所提高。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明是体外培养获得牛胚胎干细胞后，在体外培养牛胚胎干细胞的培养体系中加入抗肿瘤药物naringenin可增加牛胚胎干细胞多能性，具体有效使用浓度为10-40μg/mL。添加naringenin体外培养获得的牛胚胎干细胞可进行胚胎干细胞传代、冻存和解冻等常规操作。本发明要求每天更换培养液一次，传代比例为1:4。传代过程中对添加naringenin体外培养获得的牛胚胎干细胞进行细胞多能性鉴定。通过多项多能性检测，最终得出结论，naringenin可显著增加牛胚胎干细胞多能因子的表达，同时naringenin可促进牛胚胎干细胞系原有的多种表观形态趋向均一。本发明阐述的应用抗肿瘤药物naringenin体外培养牛胚胎干细胞的方法，为转基因克隆牛的研究与生产提供了可用于基因转染和体外长期培养筛选的牛胚胎干细胞，并可用于进一步的牛胚胎干细胞相关研究。
本发明利用naringenin提高牛胚胎干细胞多能性。牛胚胎干细胞对naringenin的浓度依赖性，具体表现为，naringenin浓度为10μg/mL时，可达到最佳长期培养效果，naringenin浓度为40μg/mL时，可达到最佳短期培养效果，牛胚胎干细胞多能性标记基因上调程度较10μg/mL时高，naringenin浓度为60μg/mL时，对牛胚胎干细胞具有较强毒性，牛胚胎干细胞增殖受到明显抑制，牛胚胎干细胞多能性标记基因上调程度较40μg/mL时低，但较对照组(未用naringenin培养的牛胚胎干细胞)明显升高，naringenin浓度为80μg/mL时，对牛胚胎干细胞具有明显毒性，说明naringenin对牛胚胎干细胞的增殖和多能性均有明显影响。
naringenin处理后，牛胚胎干细胞多能性标记基因OCT4、SOX2、NANOG的表达明显上调，牛胚胎干细胞的初始态多能性标记基因(例如KLF4、DNMT3L、REX-1、TBX3等)的表达均有显著上调，牛胚胎干细胞的始发态多能性标记基因(例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)的表达有小幅度上调，说明naringenin可使牛胚胎干细胞多能性向初始态胚胎干细胞大幅接近。SOX2、NANOG、SSEA4等多能标记基因免疫荧光染色结果呈阳性，可在基础成纤维细胞培养液中自发形成拟胚体，且可以继续自发分化。
附图说明
图1为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞在相差显微镜下观察的结果(100×)。
图2为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞碱性磷酸酶染色的结果(100×)。
图3为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞多能性基因相对表达量变化的qPCR检测结果。
图4为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞初始态多能性基因相对表达量变化的qPCR检测结果。
图5为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞始发态多能性基因相对表达量变化的qPCR检测结果。
图6为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞SOX2免疫荧光染色的结果(100×)。
图7为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞NANOG免疫荧光染色的结果(100×)。
图8为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞SSEA4免疫荧光染色的结果(100×)。
图9为本发明实施例4中添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞CDX2免疫荧光染色的结果(100×)。
图10为本发明实施例4中添加naringenin培养后的牛胚胎干细胞自发分化形成拟胚体的结果(100×)。
具体实施方式
本发明提供一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法，其是在体外培养条件下，在牛胚胎干细胞培养体系中加入10-40μg/mL naringenin，可增加牛胚胎干细胞多能性。
提高牛胚胎干细胞多能性的培养方法，培养体系为(10mL)：
前述的提高牛胚胎干细胞多能性的方法，培养条件为：37℃，5％CO2。
前述的提高牛胚胎干细胞多能性的方法，牛胚胎干细胞体外培养需要与处理体外培养C57小鼠胎儿成纤维细胞获得的饲养层细胞共培养。
前述的处理体外培养C57小鼠胎儿成纤维细胞获得的饲养层细胞的方法：用12μg/mL丝裂霉素混入培养液中处理2.5h，冻存。饲养层细胞的使用方法为：使用前一天解冻处理好的饲养层细胞过夜贴壁恢复活力后，方可与牛胚胎干细胞共培养。
前述的提高牛胚胎干细胞多能性方法，传代条件为TripLE Select消化3min，用DMEM/F12基础培养液终止消化，传代比例为1:4。
前述的提高牛胚胎干细胞多能性的方法，冻存方法为用mFreSR干细胞冻存液程序化冷冻保存。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的naringenin购自北京百灵威科技有限公司。
IWR-1购自Sigma Aldrich；Y-27632购自STEMCELL；TeSRTM-E6购自STEMCELL；lowfatty acid BSA购自MP Biomedicals；TripLE Select、Penicillin-Streptomycin购自Gibico；mFreSR购自STEMCELL；IMDM、DMEM购自Gibico；PBS、DMEM\F12购自BI。
实施例1 C57小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备
解冻原代C57小鼠胎儿成纤维细胞，在37℃，5％CO2条件下进行扩增培养至P3，生长至合适密度(80％-90％)后，用含有12μg/mL丝裂霉素的C57小鼠胎儿成纤维细胞培养液(DMEM+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin)处理2.5h。处理后在液氮中冷冻保存备用。使用时用小鼠胎儿成纤维细胞培养液解冻，37℃，5％CO2培养过夜，PBS清洗两遍，更换牛胚胎干细胞培养液备用。
实施例2牛胚胎干细胞的获得及体外培养
将体外受精获得的牛囊胚去透明带后接种到准备好的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，37℃，5％CO2培养。
体外培养牛胚胎干细胞的培养体系为(10mL)：
培养10天左右观察细胞生长情况，有细胞(ICM细胞)长出的胚胎传4代后可获得牛胚胎干细胞。传代条件为TrypLE Select消化3min，用DMEM/F12基础培养液终止消化，培养体系中加入Rho激酶抑制剂Y-27632，24h后换为体外培养牛胚胎干细胞的培养体系。
传代后24h内的培养体系为(10mL)：
其中，化合物Y-27632为Rho激酶抑制剂，分子式为C14H21N3O·2HCl，结构如式2)所示：
牛胚胎干细胞体外培养需要与处理体外培养C57小鼠胎儿成纤维细胞获得的饲养层细胞共培养。
冻存时，使用TripLE Select消化3min，1500rpm离心5min后弃上清，加mFreSR干细胞冻存液500μL，移至冻存管中，放入程序冷冻盒，-80℃放24h后移到液氮中保存。
解冻时，在37℃水浴中快速晃动装有牛胚胎干细胞的冻存管，待冻存液全部融化，迅速向冻存管中加入1ml放至室温的DMEM/F12基础培养液，轻吹3下，吸出液体至盛有5mlDMEM/F12基础培养液的离心管中，1500rpm离心5min，吸净上清液，用牛胚胎干细胞的传代培养体系重悬细胞沉淀，按比例均匀铺到准备好的12孔板中(含小鼠胎儿成纤维细胞饲养层)，37℃，5％CO2培养。24h后将培养液更换为牛胚胎干细胞的培养体系。
实施例3一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法
将抗肿瘤药物naringenin添加到牛胚胎干细胞培养体系中，具体有效使用浓度为10-40μg/mL，37℃，5％CO2培养，传5代后细胞状态转变并趋于稳定。
利用naringenin外培养牛胚胎干细胞的方法，所用培养体系为(10mL)：
传代条件为TrypLE Select消化3min，用DMEM\F12基础培养液终止消化，传代比例为1:4。
牛胚胎干细胞需与前述饲养层细胞共培养，饲养层细胞需在使用前一天解冻贴壁，过夜恢复活力后，方可与牛胚胎干细胞共培养。冻存条件为：TrypLE Select消化3min，1500rpm离心5min后弃上清，加mFreSR干细胞冻存液500μL，移至冻存管中，放入程序冷冻盒，-80℃放置24h后移到液氮中保存。
解冻时，在37℃水浴中快速晃动装有牛胚胎干细胞的冻存管，待冻存液全部融化，迅速向冻存管中加入放至室温的DMEM/F12基础培养液1ml，轻吹3下，吸出液体至盛有5mlDMEM/F12基础培养液的离心管中，1500rpm离心5min，吸净上清液，用含有抗肿瘤药物的体外培养牛胚胎干细胞的培养体系重悬细胞沉淀，按比例均匀铺到准备好的12孔板中(含小鼠胎儿成纤维细胞饲养层)，37℃，5％CO2培养。
添加naringenin培养后获得的牛胚胎干细胞在显微镜下观察的结果见图1。
实施例4牛胚胎干细胞转化获得的牛胚胎干细胞的鉴定
1、碱性磷酸酶染色
采用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(Beyotime,C3206)，按照染色步骤进行，牛胚胎干细胞染色呈紫红色，表明碱性磷酸酶有表达，牛胚胎干细胞具有多能性(图2)。
2、干细胞多能性标记基因的qPCR鉴定
分别提取牛胚胎干细胞和不同浓度(10μg/mL、25μg/mL、40μg/mL、60μg/mL)naringenin处理后获得的牛胚胎干细胞的RNA，反转录为cDNA后进行qPCR鉴定，结果显示(图3-图5)，用抗肿瘤药物naringenin处理后获得的牛胚胎干细胞后，多能性标记基因OCT4、SOX2、NANOG的表达均有上调，牛胚胎干细胞的初始态多能性标记基因(如KLF4、DNMT3L、REX1和TBX3等)的表达均有显著上调，牛胚胎干细胞的始发态多能性标记基因(如DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)的表达有小幅度上调，说明naringenin可使牛胚胎干细胞向初始态胚胎干细胞接近。牛胚胎干细胞的多能性对naringenin有浓度依赖性。其中以40μg/mLnaringenin作用效果最好，但长期培养过程中使用10μg/mL naringenin效果最佳。所用引物序列如下：
OCT4上游引物：5’-GGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3’
下游引物：5’-ACACTCGGACCACGTCTTTC-3’
SOX2上游引物：5’-CATCCACAGCAAATGACAGC-3’
下游引物：5’-TTTCTGCAAAGCTCCTACCG-3’
NANOG上游引物：5’-TTCCCTCCTCCATGGATCTG-3’
下游引物：5’-ATTTGCTGGAGACTGAGGTA-3’
KLF4上游引物：5’-TCCCACCGCTCCATTAC-3’
下游引物：5’-ATGAGAACTCTTCGTGTAGG-3’
REX1上游引物：5’-GGAAGAGGACCCACTCCTTC-3’
下游引物：5’-ACTTGGCCTCCTAGTGCATC-3’
DNMT3L上游引物：5’-ATGAGCAACTGGGTCTGCTT-3’
下游引物：5’-GGGCTCTCTCTTCCACACAG-3’
TBX3上游引物：5’-CGGATTTACTTTGGCCTTCCC-3’
下游引物：5’-CTGGTATGCAGTCACAGCGA-3’
TFCP2L1上游引物：5’-GTGCAGATCGACACCTTCAA-3’
下游引物：5’-GGGAGCACTCTGAGAGGATG-3’
STELLA上游引物：5’-TGCAAGTTGCCACTCAACTC-3’
下游引物：5’-TTCCTTTGGCATAGCGAAGT-3’
DNMT1上游引物：5’-AGTGGGGGACTGTGTTTCTG-3’
下游引物：5’-TGTACGAGAGCTGCATGTCC-3’
DNMT3A上游引物：5’-CTGGTGCTGAAGGACTTGGGC-3’
下游引物：5’-CAGAAGAAGGGGCGGTCATC-3’
DNMA3B上游引物：5’-CCGCAGATCAAGCTCAC-3’
下游引物：5’-GTTATTTCGGGTTCGGAC-3’
3、干细胞多能因子免疫荧光鉴定
对获得的牛胚胎干细胞多能因子的表达情况进行鉴定。结果显示(图6-图9)，所获得的牛胚胎干细胞表达，SOX2(Cell Signaling,L1D6A2)、NANOG(Peprotech,500-P236)、CDX2(sigma,AV31476)和SSEA-4(sigma,MAB4304)。
4、干细胞向拟胚体的分化
获得的牛胚胎干细胞用含有10％FBS和1％Penicillin-Streptomycin的IMDM培养液培养7天获得牛胚胎干细胞的拟胚体(图10)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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