阅读说明：本技术 一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法 (Novel method for separating and culturing primary cardiomyocytes of zebra fish ) 是由 陈桢玥 王秋云 席其良 陆国平 于 2018-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法,其包含以下步骤：步骤1：将斑马鱼用A1溶液进行清洗以去除杂物,然后用乙醇洗涤；步骤2：处死斑马鱼,并快速取出斑马鱼心脏；步骤3：将取出的心脏用A2溶液进行洗涤除菌；步骤4：用剪刀精细切碎心脏,用细胞培养液A3吹打成单细胞悬液；步骤5：将单细胞悬液离心后弃去细胞培养液A3,加入细胞培养液A4进行培养。本发明平均一个斑马鱼心脏能够得到约9.2×10<Sup>5</Sup>个原代心肌细胞。可进一步用于研究心脏发育与再生功能、疾病机制研究,也可以应用于筛选小分子药物。本方法效率高、经济、方便；分离的斑马鱼原代细胞具有功能性；经免疫荧光鉴定,纯度达到95％以上。(The invention discloses a novel method for separating and culturing primary cardiomyocytes of zebra fish, which comprises the following steps: step 1: washing zebra fish with A1 solution to remove impurities, and washing with ethanol; step 2: the zebra fish is sacrificed and the heart of the zebra fish is taken out quickly; and step 3: washing the removed heart with A2 solution for sterilization; and 4, step 4: finely cutting the heart with scissors, and blowing and beating the heart into single cell suspension by using cell culture solution A3; and 5: the single cell suspension was centrifuged, the cell culture solution A3 was discarded, and the cell culture solution A4 was added for culture. The invention can obtain about 9.2 multiplied by 10 on average one zebra fish heart 5 And (3) obtaining primary myocardial cells. Can be further used for researching the development and regeneration functions of the heart and the mechanism of diseases, and can also be applied to screening small molecular drugs. The method has high efficiency, economy and convenience; the isolated zebrafish primary cells are functional; through immunofluorescence identification, the purity reaches more than 95%.)

一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法

技术领域

本发明涉及细胞分离与培养技术领域，具体涉及一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法。

背景技术

心血管疾病是导致人类死亡的最主要原因之一，并且呈逐年上升趋势。心肌细胞凋亡或者生长抑制可导致心肌功能障碍，甚至机体死亡。心肌再生是目前心血管疾病研究中的热点问题。心脏组织工程研究通过永生化心肌细胞、胚胎或胎儿及新生儿的细胞模型以及诱导不同来源干细胞定向分化为心肌细胞来解决心肌细胞自我更新和再生能力有限等问题，为心肌再生提供了新的治疗策略；但是种种研究方法所产生的心肌细胞并没有成体细胞的全部功能。心肌细胞是永久分化细胞，在体外培养难度极大，目前常用的模拟心肌细胞(例如H9C2细胞)具有心肌细胞的部分活性但并非真正的心肌细胞；因此发明高效的成体心肌细胞体外培养新方法有助于解决目前心血管研究领域中真实心肌细胞难以体外培养的重大难题。

斑马鱼(Danio rerio)胚胎在体外发育且通体透明，遗传背景与人类高度同源，广泛用于发育学研究。但人类心血管疾病大部分在成体发病，因此近年来斑马鱼成体模型逐渐兴起。现阶段，胚胎斑马鱼为模型的研究主要集中在心脏发育与再生方面。在成体模型方面，由于斑马鱼体型小，心脏组织少，心肌细胞原代培养困难，限制了成体斑马鱼心血管疾病模型的应用和相关机制的研究。目前的斑马鱼原代心肌细胞分离方法效率低，得到的原代心肌细胞数量十分有限；同时，原代细胞的传代数量限制，在很大程度上限制了斑马鱼心肌细胞系的应用前景。体外心肌细胞培养方法学的构建困难，使得成体斑马鱼心肌细胞的体外研究有较大的局限性，也因此成为斑马鱼心血管疾病的成体模型的建立和研究并未得到广泛开展的重要原因之一。本发明大大提高了斑马鱼成体心脏的心肌原代培养效率和质量，突破了斑马鱼模型研究的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，以解决现有斑马鱼原代心肌细胞分离与培养方法的缺点与不足，为斑马鱼原代心肌细胞的研究与应用提供工具细胞。

为达到上述目的，本发明提供了一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其包含以下步骤：

步骤1：将斑马鱼用A1溶液进行清洗以去除杂物，然后用乙醇洗涤；

步骤2：处死斑马鱼，并快速取出斑马鱼心脏；

步骤3：将取出的心脏用A2溶液进行洗涤除菌；

步骤4：用剪刀精细切碎心脏，用细胞培养液A3吹打成单细胞悬液；

步骤5：将单细胞悬液离心后弃去细胞培养液A3，加入细胞培养液A4进行培养；

所述A1溶液的配制方法为：取0.17-0.37g磷酸二氢钾、1.32-1.52g磷酸氢二钠、7-9g氯化钠和0.1-0.3g氯化钾，混合后加700-900mL去离子水搅拌溶解，加入浓盐酸调pH至7-8后定容到1L，最后添加80-120单位/mL青霉素与80-120μg/mL链霉素；

所述A2溶液的配方为青霉素与链霉素浓度加倍的A1溶液；

所述细胞培养液A3的配方为：DMEM完全培养基、体积分数为8％-12％的胎牛血清、80-120单位/mL青霉素与80-120μg/mL链霉素；

所述细胞培养液A4的配方为：DMEM完全培养基、体积分数为2％-8％的马血清、8-12μmol/L的阿胞糖苷；0.05-0.15mmol/L的brdu、1-3μg/ml的丝裂霉素C、80-120单位/mL青霉素与80-120μg/mL链霉素。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，所述A1溶液的配制方法为：取0.27g磷酸二氢钾、1.42g磷酸氢二钠、8g氯化钠和0.2g氯化钾，混合后加800mL去离子水搅拌溶解，加入浓盐酸调pH至7.4后定容到1L，最后添加100单位/mL青霉素与100μg/mL链霉素。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，所述细胞培养液A3的配方为：DMEM完全培养基、体积分数为10％的胎牛血清、100单位/mL青霉素与100μg/mL链霉素。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，所述细胞培养液A4的配方为：DMEM完全培养基、体积分数为5％的马血清、10μmol/L的阿胞糖苷；0.1mmol/L的brdu、2μg/ml的丝裂霉素C、100单位/mL青霉素与100μg/mL链霉素。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，所述细胞培养液A4中，brdu和丝裂霉素C只在原代心肌细胞培养过程的前24小时加入。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，步骤1中，所述斑马鱼为以14小时光照及10小时黑暗的光循环在温度为28.5℃的水环境中饲养，并在不同饲养群中随机选择的15-18个月龄的成鱼。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，步骤1中至少用A1溶液清洗斑马鱼3遍；步骤3中至少用A2溶液清洗心脏5遍。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，步骤2中，将斑马鱼置于冰水中处死。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，步骤5中，在加入细胞培养液A4前，用细胞培养液A3再洗一遍并重复离心一次，进而再弃去细胞培养液A3。

上述的斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其中，所述A1溶液、A2溶液、细胞培养液A3及细胞培养液A4制备后进行过滤除菌。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明是通过斑马鱼原代心肌细胞的分离、培养以获得原代斑马鱼心肌细胞。平均一个斑马鱼心脏能够得到约9.2×10⁵个原代心肌细胞。可进一步用于研究心脏发育与再生功能，也可以应用于筛选小分子药物。本方法效率高、经济、方便；分离的斑马鱼原代细胞具有功能性；经免疫荧光鉴定，纯度达到95％以上。

附图说明

图1为斑马鱼原代心肌细胞分离后第三天的图片；

图2为斑马鱼原代心肌细胞免疫荧光法鉴定图。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施例对本发明作进一步的描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。

本发明提供了一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其包含以下步骤：

步骤1：将斑马鱼用A1溶液进行至少3遍清洗以去除杂物，然后用乙醇洗涤；所述斑马鱼为以14小时光照及10小时黑暗的光循环在温度为28.5℃的水环境中饲养，并在不同饲养群中随机选择的15-18个月龄的成鱼。

所述A1溶液的配制方法为：取0.17-0.37g磷酸二氢钾、1.32-1.52g磷酸氢二钠、7-9g氯化钠和0.1-0.3g氯化钾，混合后加700-900mL去离子水搅拌溶解，加入浓盐酸调pH至7-8后定容到1L，最后添加80-120单位/mL青霉素与80-120μg/mL链霉素；过滤除菌。

优选地，所述A1溶液的配制方法为：取0.27g磷酸二氢钾、1.42g磷酸氢二钠、8g氯化钠和0.2g氯化钾，混合后加800mL去离子水搅拌溶解，加入浓盐酸调pH至7.4后定容到1L，最后添加100单位/mL青霉素与100μg/mL链霉素；过滤除菌。

步骤2：将斑马鱼置于冰水中，采用低温法处死斑马鱼，并快速取出斑马鱼心脏；

步骤3：将取出的心脏用A2溶液进行至少5遍洗涤除菌；所述A2溶液的配方为青霉素与链霉素浓度加倍的A1溶液，以实现更好的除菌效果；

步骤4：用剪刀精细切碎心脏，用细胞培养液A3吹打成单细胞悬液；

所述细胞培养液A3的配方为：DMEM完全培养基(细胞通用基础培养液)、体积分数为8％-12％的胎牛血清(细胞培养的营养物质)、80-120单位/mL青霉素与80-120μg/mL链霉素(抗生素，抑菌)；过滤除菌。

优选地，所述细胞培养液A3的配方为：DMEM完全培养基、体积分数为10％的胎牛血清、100单位/mL青霉素与100μg/mL链霉素；过滤除菌。

步骤5：将单细胞悬液离心后弃去细胞培养液A3，用细胞培养液A3再洗一遍并重复离心一次，进而再弃去细胞培养液A3，加入细胞培养液A4进行培养；

所述细胞培养液A4的配方为：DMEM完全培养基(细胞通用基础培养液)、体积分数为2％-8％的马血清(心肌细胞培养的营养物质)、8-12μmol/L的阿胞糖苷(抑制杂细胞生长)；0.05-0.15mmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu，只加原代的前24小时，抑制杂细胞生长)、1-3μg/ml的丝裂霉素C(只加原代的前24小时，抑制杂细胞生长)、80-120单位/mL青霉素与80-120μg/mL链霉素(抗生素，抑菌)；过滤除菌。

优选地，所述细胞培养液A4的配方为：DMEM完全培养基、体积分数为5％的马血清、10μmol/L的阿胞糖苷；0.1mmol/L的brdu、2μg/ml的丝裂霉素C、100单位/mL青霉素与100μg/mL链霉素；过滤除菌。

实例：

斑马鱼原代心肌细胞的分离、培养以及鉴定

动物：

AB株成年斑马鱼(Danio rerio)从商业供应商处获得并在上海交通大学附属瑞金医院斑马鱼房饲养中心保存和饲养。斑马鱼以14小时光照及10小时黑暗的光循环在温度28.5℃的水环境中饲养，在不同饲养群中随机选择的为15-18个月龄的成鱼。

试剂：

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、浓盐酸购自国药集团；青霉素、链霉素、阿胞糖苷、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)、丝裂霉素C购自Sigma公司；70％乙醇、马血清、胎牛血清、DMEM购自Hyclone公司；心肌肌球蛋白重链(MHC)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)购自Abcam公司；波形蛋白(Vimentin)购自Santa cruz公司；抗兔Alexa Fluor488、抗兔Alexa Fluor594、抗鼠AlexaFluor488、抗鼠Alexa Fluor594购自上海泊湾生物科技有限公司。

试验方法：

(1)将斑马鱼用A1溶液进行清洗3遍，每遍30秒，然后用70％乙醇洗涤3遍，每遍30秒。溶液A1的配方如下：pH7.4；磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.27g；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.42g；氯化钠(NaCl)：8g；氯化钾(KCl)：0.2g；加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4后定容到1L，最后添加100单位/mL的青霉素与100μg/mL的链霉素。过滤除菌。

(2)将斑马鱼置于冰水中，低温法处死斑马鱼，在解剖镜下快速取出斑马鱼心脏，并置于A2溶液中。A2溶液配方为青霉素与链霉素浓度加倍的A1溶液，以实现更好的除菌效果。过滤除菌。

(3)将取出的心脏用A2溶液进行洗涤，洗涤5遍，每遍30秒；

(4)用剪刀精细切碎心脏，用斑马鱼心肌细胞培养液A3吹打成单细胞悬液。细胞培养液A3的配方为：DMEM完全培养基；体积分数为10％的胎牛血清(FBS)；100单位/mL青霉素与100μg/mL链霉素。过滤除菌。

(5)将细胞离心，2000转每分钟，离心5分钟，离心后弃去细胞培养液A3，用细胞培养液A3再洗一遍，重复离心一次并弃去细胞培养液A3。加入斑马鱼心肌细胞培养液A4。置于28℃的5％CO₂的培养箱中培养。

培养24小时后斑马鱼心肌细胞出现搏动功能如图1所示(明场观察，原始放大倍数为20倍)。A4溶液配方为：DMEM完全培养基；体积分数为5％的马血清；10μmol/L的阿胞糖苷；0.1mmol/L的brdu(只加原代的前24小时)；2μg/ml的丝裂霉素C(只加原代的前24小时)；100单位/mL青霉素与100μg/mL链霉素。过滤除菌。

(6)72小时后，细胞传代，免疫荧光法鉴定斑马鱼心肌细胞，结果如图2所示(原始放大倍数为20倍)。心肌细胞鉴定：波形蛋白(Vimentin)染色为阴性；心肌肌球蛋白重链(MHC)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)染色为阳性。分离的斑马鱼原代细胞经免疫荧光鉴定，纯度达到95％以上。

综上所述，本方法具有以下优点：

(1)效率高：按照之前的方法：Zeng WR等所公开的斑马鱼心肌细胞和心脏祖细胞的体外培养及成年斑马鱼心脏组织的三维培养(Zeng WR,Beh SJ,Bryson-Richardson RJ,Doran PM.Production of zebrafish cardiospheres and cardiac progenitor cellsin vitro and three-dimensional culture of adult zebrafish cardiac tissue inscaffolds.Biotechnology and bioengineering 2017,114:2142-2148)，每个斑马鱼心脏能够得到4×10⁵个原代心肌细胞。本方法，每个斑马鱼心脏能够得到9.2×10⁵个原代心肌细胞。效率提高2.3倍。

(2)经济：按照之前的方法：Zeng WR等所公开的斑马鱼心肌细胞和心脏祖细胞的体外培养及成年斑马鱼心脏组织的三维培养(Zeng WR,Beh SJ,Bryson-Richardson RJ,Doran PM.Production of zebrafish cardiospheres and cardiac progenitor cellsin vitro and three-dimensional culture of adult zebrafish cardiac tissue inscaffolds.Biotechnology and bioengineering 2017,114:2142-2148)，每组需要60-70个斑马鱼心脏用于分离原代心肌细胞。由于本发明的效率是之前老方法的2.4倍，因此本发明仅需要25-30条斑马鱼，更为经济。

(3)纯度高：本发明分离的斑马鱼原代细胞经免疫荧光鉴定，纯度达到95％以上。

(4)应用广：本发明分离的斑马鱼原代细胞具有效率高、经济以及纯度高的特点，因此不仅可以应用于基础科研研究，还可以作为临床新药筛选的细胞模型。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。