阅读说明：本技术 重组抗pd-l1单克隆抗体 (Recombinant anti-PD-L1 monoclonal antibody ) 是由 聂丽 刘广洛 于 2018-09-06 设计创作，主要内容包括：一种重组抗PD-L1单克隆抗体,涉及生物医药技术领域,用于给晚期或转移性癌症患者提供有效的治疗药物,尤其是现有抗PD-L1药物治疗无效或耐药的患者。该抗体的互补决定区具有SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:6所列的序列。与现有抗PD-L1药物相比,该抗体具有独特结合表位,并且对人PD-L1亲和性更好、抑瘤效果更佳。(A recombinant anti-PD-L1 monoclonal antibody relates to the technical field of biological medicines and is used for providing effective treatment medicines for patients with advanced or metastatic cancers, in particular to patients who have ineffective or resistant treatment of the existing anti-PD-L1 medicines. The complementarity determining regions of the antibody have the sequences set forth in SEQ ID NO 1 through SEQ ID NO 6. Compared with the existing anti-PD-L1 drug, the antibody has unique binding epitope, and has better affinity to human PD-L1 and better tumor inhibition effect.)

重组抗PD-L1单克隆抗体

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，本发明公开了适用于癌症和免疫类疾病治疗或检测的单克隆抗体。

背景技术

PD-L1（Programmed cell death 1 ligand 1，细胞程序性死亡配体1）也称为表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）或B7同源体1（B7 homolog 1，B7-H1），是大小为40kDa 的跨膜蛋白，是PD-1（Programmed Cell Death Protein 1）的2个配体之一，在心脏、骨骼肌、胎盘、肺中高表达，在胸腺、脾、肾、肝中低表达，在活化的T细胞、B细胞、树突状细胞等免疫细胞中也有表达，并广泛表达于多种肿瘤细胞上。

PD-L1与PD-1结合后可以传导免疫抑制性信号、减低T细胞的增生，这一“免疫检查点”（Immune checkpoints）机制可被癌细胞利用实现免疫逃逸，因此PD-1和PD-L1成为癌症免疫治疗的靶标，并有多个抗PD-1或和抗PD-L1单克隆抗体进入临床试验。2016年5月，重组抗PD-L1人源化单克隆抗体Atezolizumab被美国食药监局（FDA）批准用于局部晚期或转移性尿路上皮癌治疗，商品名Tecentriq，这是全球第一个获得上市许可的以PD-L1为靶标的治疗性抗体。同年10月，Tecentriq的适应症又增加了转移性非小细胞肺癌，是全球首次批准将抗PD-L1抗体用于肺癌治疗。

在一项310人参加的Tecentriq治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌的临床试验中，在PD-L1表达≥5%的患者中总体应答率（ORR）为26.0%，其中完全应答率（CR）仅为12.0%。在一项287人参加的Tecentriq治疗转移性非小细胞肺癌的临床试验中，总体应答率为15%，其中完全应答率仅为0.7%，患者中位生存期12.6个月，比使用多西他赛的对照组延长了2.9个月。因此可见，半数以上的患者对抗PD-L1治疗无明显应答（这可能与个体基因多样性、肿瘤的类型和变异性等因素有关），对患者生存期的延长与化疗药相比也提高有限，抗PD-L1治疗的有效率和疗效还有待于进一步提高。发掘筛选具有新的药效动力学、药代动力学特征的抗PD-L1单克隆抗体，如具有新的结合表位、结合/解离动力学、组织渗透性、稳定性的单克隆抗体，是为患者提供多样化替代选择、改善提高抗PD-L1治疗有效性的一种途径。

抗体药物又叫治疗性抗体（Therapeutic Antibodies），属于靶向药物，一般是IgG型免疫球蛋白。IgG型免疫球蛋白的基本结构是由四条肽链组成的，即由二条相同的分子量较小的肽链称为轻链（L链）和二条相同的分子量较大的肽链称为重链（H链）组成的。在大多数情况下H链在与抗原结合中起更重要的作用。H链或L链的氨基端（N-末端）氨基酸序列变化很大，称此区为可变区（V），L链和H链的V区分别称为VL和VH；而羧基末端（C-末端）则相对稳定，变化很小，称此区为恒定区（C），L链和H链的C区分别称为CL和CH。

在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变休程度，这些区域称为高变区（HVR）。在V区中非HVR部位的氨基酸组面和排列相对比较保守，称为骨架区（Framework）。经X线结晶衍射的研究分析证明，高变区确实为抗体与抗原结合的位置，因而称为互补决定区（CDR）。VL和VH各有三个HVR区，分别称为HVR1、HVR2和HVR3，又可称为CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3一般具有更高的高变程度。

CL和CH上具有部分同种异型的遗传标记。IgG型免疫球蛋白的CH2区具有补体结合点，能活化补体的经典活化途径，诱导CDC效应。CH3区具有结合单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B细胞和NK细胞Fc段受体的功能，能诱导ADCC效应。在H链恒定区第297位天冬氨酸（Asn297）有保守的N-连接糖基化位点，不同形式的糖基化修饰对抗体的CDC效应、ADCC效应、免疫原性、半衰期等性质有重要影响。

发明内容

为了给晚期或转移性癌症患者提供有效的治疗药物，尤其是给Tecentriq治疗无效或耐药的患者提供新的药物选择，本发明提供了重组抗PD-L1人源化单克隆抗体和鼠源抗PD-L1单克隆抗体，技术方案如下：

重组抗PD-L1单克隆抗体，重链CDR1、CDR2、CDR3区分别含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3的序列。

所述的抗体，重链可变区含有SEQ ID NO: 7的序列（人源化抗体），或含有SEQ IDNO: 10的序列（鼠源抗体）。

所述的抗体，轻链CDR1、CDR2、CDR3区分别含有SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQID NO: 6的序列。

所述的抗体，轻链可变区含有SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9的序列（人源化抗体），或含有SEQ ID NO: 11的序列（鼠源抗体）。

所述的人源化抗体是人IgG1亚型的抗体。

所述的人源化抗体在制造癌症、免疫疾病的治疗药物或预防药物中的用途。

所述的鼠源抗体在癌症或免疫疾病检测、药效预测中的用途。

具体而言，所述的人源化抗体名称及其序列如下表：

表1、重组抗PD-L1人源化单克隆抗体T0004-BC和T0004-C的序列

所述的鼠源抗体名称及其序列如下表：

表2、鼠源抗PD-L1单克隆抗体T0004的序列

抗体特征	氨基酸（或核苷酸）序列	SEQ ID NO:
			重链CDR1	SAYIWH	1
重链CDR2	YIHYSTITKYNPSLKS	2
			重链CDR3	EGNDYGGFAY	3
重链可变区	DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSAYIWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSTITKYNPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLSSVTTEDTATYYCAREGNDYGGFAYWGQGTLVTVSA	10
			轻链CDR1	KASQSVSNGVA	4
轻链CDR2	YASNRYT	5
			轻链CDR3	QQDYSSPYT	6
轻链可变区	SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNGVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTRLEIKR	11

表面等离子共振检测表明，鼠源抗体T0004对人PD-L1有极高的亲和性，平衡解离常数（KD值）小于1 pM（检测结果为0.817 pM，超出仪器检测范围）；人源化抗体T0004-BC（KD值1.008E-11M）、T0004-C（KD值1.250E -11M）比Tecentriq（KD值2.720E-11M）有更高的人PD-L1亲和力；并且T0004-BC（Kd值4.452E-5）、T0004-C（Kd值4.852E-5）与人PD-L1（Kd值1.410E-4）结合的稳定性高于Tecentriq。

酶联免疫法、流式细胞术检测表明，T0004-BC、T0004-C能与Tecentriq竞争结合可溶性或膜表面人PD-L1，说明这三个抗体在人PD-L1上的结合表位比较接近、或有空间阻挡效应。然而T0004-BC、T0004-C能与细胞膜表面的人PD-L1的D49Y和V111E突变体结合，而Tecentriq不能与该突变体结合，说明他们的结合表位有所差异，T0004-BC、T0004-C在人PD-L1上的结合表位与商业化抗PD-L1抗体相比有一定的独特性。

在以小鼠为模型的的动物试验中，T0004-BC、T0004-C能明显抑制MC38结直肠癌细胞所形成的肿瘤的体积增长，并且抑瘤效果与商业化抗PD-L1抗体相比较优。

由于鼠源抗体T0004与人源化抗体T0004-BC、T0004-C有相同的CDR区，可与人PD-1竞争结合人PD-L1，因此可推测它们具有相同的人PD-L1结合表位。并且鼠源抗体T0004对人PD-L1有极高的亲和力，预期可用于癌症或免疫疾病检测、药效预测。

总之，本发明提供了对人PD-L1亲和性更好、具有独特结合表位、抑瘤效果更佳的重组抗PD-L1人源化单克隆抗体，以及对人PD-L1亲和力极高、可用于癌症或免疫疾病检测、药效预测的鼠源抗体。

附图说明

图1：流式细胞术检测鼠源抗体T0004抗体与细胞膜表面PD-L1结合能力。

图2：酶联免疫法检测鼠源抗体T0004抗体与可溶性PD-L1结合能力。

图3：表面等离子共振检测鼠源抗体T0004与人PD-L1的亲和力。

图4：酶联免疫法检测鼠源抗体T0004与PD-1竞争结合PD-L1的情况。

图5：酶联免疫法检测鼠源抗体T0004与Tecentriq竞争结合PD-L1的情况。

图6：鼠源抗体T0004重链可变区A、B、C、D四个人源化方案。

图7：鼠源抗体T0004轻链可变区A、B、C、D四个人源化方案。

图8：差示扫描量热法测量人源化抗体T0004-BC的热稳定性。

图9：差示扫描量热法测量人源化抗体T0004-C的热稳定性。

图10：人源化抗体T0004-BC与膜PD-L1结合的流式细胞术检测结果。

图11：人源化抗体T0004-C与膜PD-L1结合的流式细胞术检测结果。

图12：商业化抗体Tecentriq（对照）与膜PD-L1结合的流式细胞术检测结果。

图13：酶联免疫法检测T0004-BC、T0004-C与可溶性PD-L1结合能力。

图14：表面等离子共振检测人源化抗体T0004-BC与人PD-L1的亲和力。

图15：表面等离子共振检测人源化抗体T0004-C与人PD-L1的亲和力。

图16：表面等离子共振检测商业化抗体Tecentriq（对照）与人PD-L1的亲和力。

图17：流式细胞术检测T0004-BC与Tecentriq竞争结合细胞膜表面PD-L1能力。

图18：流式细胞术检测T0004-C与Tecentriq竞争结合细胞膜表面PD-L1能力。

图19：流式细胞术检测Tecentriq（对照）与Tecentriq竞争结合细胞膜表面PD-L1能力。

图20：酶联免疫法检测T0004-BC、T0004-C与Tecentriq竞争结合可溶性PD-L1的能力。

图21：流式细胞术检测T0004-BC与PD-1竞争结合细胞膜表面PD-L1能力。

图22：流式细胞术检测T0004-C与PD-1竞争结合细胞膜表面PD-L1能力。

图23：流式细胞术检测Tecentriq（对照）与PD-1竞争结合细胞膜表面PD-L1能力。

图24：酶联免疫法检测T0004-BC、T0004-C与PD-1竞争结合可溶性PD-L1能力。

图25：报告基因法检测人源化抗体T0004-BC激活TCR的生物学活性。

图26：报告基因法检测人源化抗体T0004-C激活TCR的生物学活性。

图27：报告基因法检测Tecentriq（对照）激活TCR的生物学活性。

图28：报告基因法检测人源化抗体T0004-BC诱导ADCC效应的能力。

图29：报告基因法检测人源化抗体T0004-C诱导ADCC效应的能力。

图30：报告基因法检测Tecentriq（对照）诱导ADCC效应的能力。

图31：乳酸脱氢酶法检测人源化抗体T0004-BC、T0004-C诱导CDC效应的能力。

图32：流式细胞术检测T0004-BC、T0004-C对人PD-L1突变株的结合能力。

图33：人源化抗体T0004-BC、T0004-C动物体内抑瘤能力的研究。

具体实施方式

实施例1、杂交瘤细胞的构建与筛选

1、免疫动物

用重组表达的PD-L1-Fc融合蛋白（由人PD-L1胞外区与抗体Fc段融合而成，氨基酸序列为UniProt网站编号Q9NZQ7-1的序列）以100～500 μg/mL的剂量腹腔免疫Balb/c小鼠，免疫3次。在细胞融合前3-7天，用PD-L1-Fc融合蛋白50～100 μg/mL尾静脉加强免疫。

2、细胞融合

将小鼠骨髓瘤细胞系NS-1与免疫后Balb/c小鼠脾细胞进行融合，然后置于96空细胞培养板，用含HAT的完全培养基筛选，3-5天半量换液，2周左右可见克隆形成。

3、培养上清鉴定

用ELISA技术检测杂交瘤细胞培养上清液。分别用重组PD-L1-Fc融合蛋白和无关抗体Fc段包被多孔板，加入杂交瘤细胞培养上清液，然后加入辣根过氧化酶（HRP）标记的抗小鼠抗体，选择PD-L1-Fc孔单阳性克隆（PD-L1-Fc孔与Fc孔双阳性克隆为抗Fc抗体），即分泌鼠抗人PD-L1抗体的杂交瘤细胞，用含HT的完全培养液进行培养，并进行亚克隆。

4、亚型检测

将各杂交瘤细胞株分泌的鼠抗人PD-L1单克隆抗体用市售的小鼠亚型检测试剂盒进行检测，确定轻、重链亚型。

5、研究结果

通过筛选获得一株分泌鼠抗人PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞，编号为T0004，经鉴定重链亚型为IgG1，轻链亚型为κ型。

实施例2、流式细胞术检测T0004抗体与细胞膜表面PD-L1结合能力

将含有人PD-L1全长编码序列的表达载体质粒稳定转染CHO-K1宿主细胞，通过加压筛选获得膜表面稳定表达PD-L1的CHO-K1工程细胞（记作CHO-K1/hmPD-L1）。T0004抗体从10 μg/mL起以2倍比稀释15个浓度，与对数生长期的CHO-K1/hmPD-L1细胞混合，冰浴45 min，使其与CHO-K1/hmPD-L1细胞表面的PD-L1结合。用含1%胎牛血清的PBS洗涤2遍，加入FITC荧光标记的兔抗鼠 IgG(H+L)二抗，冰浴45min，用含1%胎牛血清的PBS洗涤2遍。沉淀重悬于含1%胎牛血清的PBS中，用流式细胞仪进行荧光强度的分析。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为平均荧光强度（MFI），见图1，计算获得T0004与细胞膜表面PD-L1结合的EC50（半最大效应浓度）为274.7112 ng/mL。

实施例3、酶联免疫法检测T0004抗体与可溶性PD-L1结合能力

用包被液将人PD-L1-Fc融合蛋白稀释至10μg/mL，100μL/孔加入酶标板，37℃包被1-2小时。弃除包被液，加入封闭液，350μL/孔，2～8℃封闭过夜，洗板机洗涤7次。用PBS稀释T0004抗体，从50000ng/mL起以4倍比稀释15个浓度，100μL/孔，37℃反应1-2小时，弃除酶标板中液体，洗板机洗涤7次。加入 1:10000稀释的辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG(H+L)，100μL/孔，37℃反应1小时，弃除酶标板中液体，洗板机洗涤7次。加入TMB底物溶液至酶标板，50μL/孔，避光显色1-10分钟，加入50μL/孔终止液，迅速混匀。酶标仪读取OD450nm，并以OD570nm为参比波长。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为OD值，见图2，计算获得T0004与可溶性PD-L1结合的EC50（半最大效应浓度）为1.471 ng/mL。

实施例4、表面等离子共振检测T0004与人PD-L1的亲和力

用生物素标记人PD-L1-Fc融合蛋白，然后偶联到表面等离子共振仪器BIACORE的检测芯片上，将T0004抗体从1 μg/mL起以2倍稀释10个浓度，加入到BIACORE设备中，检测、记录T0004抗体与人PD-L1-Fc融合蛋白的结合-解离过程引起的光学信号变化，分别以时间、光学应答值为横纵坐标绘曲线，所获得的图谱见图3，T0004抗体与人PD-L1-Fc融合蛋白的亲和解离常数（KD值）为8.170×10^-13M。

实施例5、酶联免疫法检测T0004与PD-1竞争结合PD-L1的情况

用包被液将重组人PD-1-Fc融合蛋白稀释至10 μg/mL，100 μL/孔加入酶标板，37℃包被2小时。弃除包被液，加入封闭液，350μL/孔，2～8℃封闭过夜,洗板机洗涤7次。将T0004抗体与生物素标记的人PD-L1-Fc融合蛋白以不同比例混合，T0004抗体终浓度500 μg/mL起以2倍比稀释15个浓度梯度，100 μL/孔加入酶标板，37℃反应1小时。弃上清，洗板机洗涤7次。将1:1000稀释的Avidin（亲和素）-HRP（辣根过氧化酶）以100 μL/孔加入，37℃反应1小时。弃上清，洗板机洗涤7次。加入TMB显色底物溶液至酶标板，50μL/孔，避光显色15分钟。终止液加入酶标板，50μL/孔，迅速混匀。酶标仪读取OD450nm，570nm为参比波长。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为OD值，见图4，计算获得T0004抗体抑制PD-1与其配基PD-L1-Fc结合的EC50（半最大效应浓度）为6.298 μg/mL。

实施例6、酶联免疫法检测T0004与Tecentriq竞争结合PD-L1的情况

用包被液将重组人PD-L1-Fc融合蛋白稀释至10 μg/mL，100 μL/孔加入酶标板，37℃包被2小时。弃除包被液，加入封闭液，350 μL/孔，2～8℃封闭过夜,洗板机洗涤7次。将T0004抗体与生物素标记的Tecentriq抗体以不同比例混合，T0004抗体终浓度从500 μg/mL起以2倍比稀释15个浓度梯度，100 μL/孔加入酶标板，37℃反应1小时。弃上清，洗板机洗涤7次。将1:1000稀释的Avidin（亲和素）-HRP（辣根过氧化酶）以100 μL/孔加入，37℃反应1小时。弃上清，洗板机洗涤7次。加入TMB显色底物溶液至酶标板，50 μL/孔，避光显色15分钟。终止液加入酶标板，50 μL/孔，迅速混匀。酶标仪读取OD450 nm，570 nm为参比波长。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为OD值，见图5，计算获得T0004抗体与Tecentriq竞争结合PD-L1的EC50（半最大效应浓度）为4.917 μg/mL。

实施例7、T0004抗体测序与人源化改造

委托外包服务公司采用鼠源引物测定T0004杂交瘤细胞株所分泌的T0004抗体的cDNA编码序列，并翻译成氨基酸序列，结果表明T0004抗体的重、轻链可变区序列分别为SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11的序列。

选择与T0004抗体轻重链同源性较高的人源抗体序列为模板；根据鼠源抗体的晶体结构，确定CDR区5Å以内所涉及的氨基酸；将CDR区5Å以内的鼠源抗体和人源模板不同的氨基酸进行回复突变，确定最终的人源化抗体序列，对T0004抗体的重链可变区、轻链可变区各自建立了A、B、C、D等4种不同的人源化方案，见图6、图7，相关序列为SEQ ID NO: 7～9、12～16。

选择重链可变区、轻链可变区的B、C的人源化方案，共获得四种不同的轻、重链可变区序列组合，即T0004-B（轻链B+重链B），T0004-BC（轻链B+重链C），T0004-C（轻链C+重链C），T0004-CB（轻链C+重链B）。将这四种抗体可变区与人IgG1κ的恒定区融合，根据轻重链氨基酸序列选择CHO（中国仓鼠卵巢）细胞偏爱的密码子分别进行反向翻译，合成编码的cDNA序列***pcDNA3.1载体，转染CHO细胞进行表达。收获CHO细胞培养上清液，与重组人PD-L1-Fc融合蛋白进行免疫杂交（Western Blot），初步鉴定亲和性，结果表明T0004-BC、T0004-C与重组人PD-L1-Fc融合蛋白有亲和性。采用重组蛋白A亲和层析法分离纯化细胞培养上清液中的T0004-BC、T0004-C抗体蛋白，以备后续的检测。

实施例8、差示扫描量热法测量T0004-BC、T0004-C抗体蛋白的热稳定性

采用差示扫描量热法测量T0004-BC、T0004-C抗体蛋白的热稳定性，结果如图8、图9所示，T0004-BC、T0004-C抗体蛋白的Tm值分别为78.60℃、78.56℃，说明T0004-BC、T0004-C抗体有良好的热稳定性。

实施例9、流式细胞术检测T0004-BC、T0004-C与膜PD-L1结合能力

分别将T0004-BC（试验品）、T0004-C（试验品）、Tecentriq（参比品）从10 μg/mL起以2倍比稀释15个浓度，与对数生长期的CHO-K1/hmPD-L1细胞（制备方法见实施例2）混合，冰浴45min，使其与CHO-K1/hmPD-L1细胞表面的PD-L1结合。用含1%胎牛血清的PBS洗涤2遍，加入FITC荧光标记的羊抗人 IgG(H+L)二抗，冰浴45min，用含1%胎牛血清的PBS洗涤2遍。沉淀重悬于含1%胎牛血清的PBS中，用流式细胞仪进行荧光强度的分析。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为平均荧光强度（MFI），见图10～图12，计算获得T0004-BC、T0004-C、Tecentriq与细胞膜表面PD-L1结合的EC50（半最大效应浓度）分别为336.20383 ng/mL、324.08248 ng/mL、318.10122 ng/mL。

实施例10、酶联免疫法检测T0004-BC、T0004-C与可溶性PD-L1结合能力

用包被液将人PD-L1-Fc融合蛋白稀释至10μg/mL，100μL/孔加入酶标板，37℃包被1-2小时。弃除包被液，加入封闭液，350μL/孔，2～8℃封闭过夜，洗板机洗涤7次。用PBS分别稀释T0004-BC（试验品）、T0004-C（试验品）、Tecentriq（参比品）抗体，从50000ng/mL起以4倍比稀释15个浓度，100μL/孔，37℃反应1-2小时，弃除酶标板中液体，洗板机洗涤7次。加入1:10000稀释的辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗人κ链抗体，100μL/孔，37℃反应1小时，弃除酶标板中液体，洗板机洗涤7次。加入TMB底物溶液至酶标板，50μL/孔，避光显色1-10分钟，加入50μL/孔终止液，迅速混匀。酶标仪读取OD450nm，并以OD570nm为参比波长。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为OD值，见图13，计算获得T0004-BC、T0004-C、Tecentriq与可溶性PD-L1结合的EC50（半最大效应浓度）分别为38.17 ng/mL、54.65 ng/mL、56.53 ng/mL。

实施例11、表面等离子共振检测T0004-BC、T0004-C与人PD-L1的亲和力

用生物素标记人PD-L1-Fc融合蛋白，然后偶联到表面等离子共振仪器BIACORE的检测芯片上，将T0004-BC（试验品）、T0004-C（试验品）、Tecentriq（参比品）抗体各自从1 μg/mL起以2倍稀释10个浓度，分别加入到BIACORE设备中，检测、记录各抗体与人PD-L1-Fc融合蛋白的结合-解离过程引起的光学信号变化，分别以时间、光学应答值为横纵坐标绘曲线，图谱见图14～图16，获得的各项参数值见表3。

实验结果表明，T0004-BC（KD值1.008E-11M）、T0004-C（KD值1.250E -11M）比Tecentriq（KD值2.720E-11M）有更高的人PD-L1亲和力，KD值（平衡解离常数）不到Tecentriq的二分之一；并且T0004-BC、T0004-C与人PD-L1的kd值也远小于Tecentriq，说明T0004-BC、T0004-C与人PD-L1结合的稳定性高于Tecentriq。

表3、表面等离子共振检测各抗体与人PD-L1的亲和力

抗体名称

ka (1/Ms)

kd (1/s)

KD (M)

Rmax (RU)

Chi² (RU²)

U-value

T0004-BC

4.415E+6

4.452E-5

1.008E-11

18.30

0.377

7

T0004-C

3.881E+6

4.852E-5

1.250E-11

21.28

0.265

5

Tecentriq(对照)

5.183E+6

1.410E-4

2.720E-11

20.75

0.894

4

实施例12、流式细胞术检测T0004-BC、T0004-C与Tecentriq竞争结合细胞膜表面PD-L1能力

收集对数生长期的CHO-K1/hmPD-L1细胞（制备方法见实施例2），将不同浓度的竞争抗体T0004-BC、T0004-C、Tecentriq（对照）与亚饱和浓度FITC荧光标记的Tecentriq混合，竞争抗体终浓度从500μg/ml起以2倍比稀释15个浓度梯度，混合物冰浴45min，用含1%胎牛血清的PBS洗涤2遍。沉淀重悬于1%胎牛血清的PBS中，用流式细胞仪分析竞争性。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为平均荧光强度（MFI），见图17～图19，计算获得T0004-BC、T0004-C与Tecentriq竞争结合细胞膜表面PD-L1的半数有效剂量（EC50），结果见表4。

表4、T0004-BC、T0004-C与Tecentriq竞争结合细胞膜表面

PD-L1能力检测结果

克隆名称	EC50(μg/ml)	是否竞争
			T0004-BC	1.23916	竞争
T0004-C	1.20865	竞争
			Tecentriq(对照)	1.16779	竞争

实施例13、酶联免疫法检测T0004-BC、T0004-C与Tecentriq竞争结合可溶性PD-L1的能力

用包被液将重组人PD-L1-Fc融合蛋白稀释至10 μg/mL，100 μL/孔加入酶标板，37℃包被1-2小时。弃除包被液，加入封闭液，350 μL/孔，2～8℃封闭过夜。洗板机洗涤7次。将竞争抗体T0004-BC、T0004-C、Tecentriq（对照）分别与生物素标记的Tecentriq以不同比例混合，100 μL/孔加入酶标板，各孔中竞争抗体终浓度从195 μg/mL起以2倍比稀释14个浓度梯度，37℃反应1小时。弃上清，洗板机洗涤7次。将Avidin-HRP 1:1000稀释，100 μL/孔加入，37℃反应1小时。弃上清，洗板机洗涤7次。加入TMB底物溶液至酶标板，50 μL/孔，避光显色15分钟。终止液加入酶标板，50 μL/孔，迅速混匀。酶标仪读取OD450nm，570nm为参比波长。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为OD值，见图20，计算获得T0004-BC、T0004-C、Tecentriq与Tecentriq竞争结合PD-L1的EC50（半最大效应浓度）分别为1.489 μg/mL、1.429 μg/mL、1.494 μg/mL（表5）。

表5、T0004-BC、T0004-C与Tecentriq竞争结合可溶性

PD-L1能力检测结果

克隆名称	EC50 (μg/mL)	是否竞争
			T0004-BC	1.489	竞争
T0004-C	1.429	竞争
			Tecentriq	1.494	竞争

实施例14、流式细胞术检测T0004-BC、T0004-C与PD-1竞争结合细胞膜表面PD-L1能力

收集对数生长期的CHO-K1/hmPD-L1细胞（制备方法见实施例2），将竞争抗体T0004-BC、T0004-C、Tecentriq（对照）与亚饱和浓度的生物素标记的人PD-1蛋白以不同比例混合，混合物中竞争抗体终浓度从10 μg/mL起以2倍比稀释15个浓度梯度，混合物冰浴45min。用含1%胎牛血清的PBS溶液洗涤2遍，加入Avidin-PE荧光标记二抗，冰浴45min，用含1%胎牛血清的PBS溶液洗涤2遍。沉淀重悬于含1%胎牛血清的PBS溶液中，用流式细胞仪进行分析。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为平均荧光强度（MFI），见图21～图23，计算获得T0004-BC、T0004-C与PD-1竞争结合细胞膜表面PD-L1的半数有效剂量（EC50），结果见表6。

表6、T0004-BC、T0004-C与PD-1竞争结合细胞膜表面

PD-L1能力检测结果

克隆名称	EC50(μg/ml)	是否竞争
			T0004-BC	0.16444	竞争
T0004-C	0.19668	竞争
			Tecentriq(对照)	0.16056	竞争

实施例15、酶联免疫法检测T0004-BC、T0004-C与PD-1竞争结合可溶性PD-L1能力

用包被液将重组人PD-1-Fc融合蛋白稀释至10 μg/mL，100 μL/孔加入酶标板，37℃包被1-2小时。弃除包被液，加入封闭液，350 μL/孔，2～8℃封闭过夜。洗板机洗涤7次。将竞争抗体T0004-BC、T0004-C、Tecentriq（对照）分别与生物素标记的重组人PD-L1-Fc融合蛋白以不同比例混合，100 μL/孔加入酶标板，其中竞争抗体在各孔中的终浓度为从8800 ng/mL起等差倍比11个浓度，37℃反应1小时。弃上清，洗板机洗涤7次。将Avidin-HRP （亲和素偶联的辣根过氧化酶）1:1000稀释，100 μL/孔，37℃反应1小时。弃上清，洗板机洗涤7次。加入TMB底物溶液至酶标板，50 μL/孔，避光显色15分钟。终止液加入酶标板，50 μL/孔，迅速混匀。酶标仪读取OD450nm，570nm为参比波长。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为OD值，见图24，计算获得T0004-BC、T0004-C、Tecentriq与Tecentriq竞争结合PD-L1的EC50（半最大效应浓度）见表7。

表7、T0004-BC、T0004-C与人PD-1竞争结合可溶性

PD-L1能力检测结果

克隆名称	EC50 (ng/mL)	是否竞争
			T0004-BC	3598	竞争
T0004-C	3294	竞争
			Tecentriq	2503	竞争

实施例16、报告基因法检测T0004-BC、T0004-C抗体激活TCR的生物学活性

采用Bright-Glo^TM Luciferase Assay System试剂盒（Promega公司，货号E2610），以细胞膜表面稳定表达PD-1及NFAT-Luciferase(荧光素酶)报告基因启动子的人T淋巴瘤细胞系Jurkat作为效应细胞，靶细胞为按实施例2的方法制备的膜表达人PD-L1的CHO细胞（CHO-K1/ hmPD-L1）。

检测原理：在缺乏重组抗PD-L1人源化单克隆抗体时，效应细胞表面的PD-1与靶细胞表面PD-L1结合后，产生负性调节，不会引起TCR（T细胞受体）的激活，从而不会产生NFAT启动子诱导的荧光素酶报告基因表达；当存在抗PD-L1抗体时，抗PD-L1抗体可与效应细胞表面PD-1竞争结合靶细胞表面PD-L1，当靶细胞与效应细胞共同孵育时，Jurkat效应细胞表面TCR复合物会随着抗PD-L1抗体浓度的不同而被不同程度激活(浓度越高激活程度越高)，从而引发NFAT启动子诱导的荧光素酶报告基因表达强度的不同，抗体浓度越高荧光素酶报告基因表达越强(RLU越高)。

检测方法：将浓度为4×10⁵细胞/mL的靶细胞培养液以100 μL/孔加入96孔细胞培养板（数量为4×10⁴细胞/孔），37℃ 5%CO2孵箱培养过夜。弃去96孔板内的培养液，各孔分别加入40 μL系列稀释的T0004-BC、T0004-C或Tecentriq（对照）抗体（抗体浓度从800 ng/mL起1.5倍比稀释9个浓度），以及40 μL浓度为1.25×10⁶细胞/mL的效应细胞（数量为5×10⁴细胞/孔），并设置单靶细胞对照孔、单效细胞对照孔及靶细胞加效应细胞对照孔。将96孔细胞培养板置于37℃ 5%CO2孵箱培养6小时后，加入80 μL/孔发光底物，用GloMAX发光仪进行读数。

采用分析软件Origin软件拟合标准曲线，以样品的浓度（对数）为横坐标，发光值为纵坐标，见图25～图27，计算获得T0004-BC、T0004-C、Tecentriq（对照）激活TCR的生物活性的EC50（半最大效应浓度）分别为55.22212 ng/mL、56.86219 ng/mL、53.09773 ng/mL。

实施例17、报告基因法检测T0004-BC、T0004-C抗体诱导ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用）效应的能力

采用Promega公司的ADCC效应报告基因检测试剂盒（货号G7014），效应细胞为JurkatNFAT-Re/CD16a(158V)-FcRγ/pcDNA3.1(hygro)细胞，靶细胞为按实施例2的方法制备的膜表达人PD-L1的CHO细胞（CHO-K1/ hmPD-L1）。

将浓度为1×10⁶细胞/mL的靶细胞30 μL/孔加入96孔细胞培养板，将T0004-BC、T0004-C或Tecentriq（对照）抗体从12000 ng/mL起3倍比系列稀释11个浓度，60 μL/孔加入96孔细胞培养板，37℃、8% CO₂培养箱孵育60分钟。将浓度为1×10⁶细胞/mL的对数期效应细胞30 μL/孔加入96孔细胞培养板，37℃、8%CO₂细胞培养箱作用5小时。加入发光底物120 μL/孔，用GloMAX发光仪进行读数。

采用分析软件Origin软件拟合标准曲线，以样品的浓度（对数）为横坐标，发光值为纵坐标，见图28～图30，计算获得T0004-BC、T0004-C诱导ADCC效应的EC50（半最大效应浓度）分别为6.39946 ng/mL、7.00327 ng/mL，Tecentriq（对照）无诱导ADCC效应的能力。

实施例18、乳酸脱氢酶法检测T0004-BC、T0004-C抗体诱导CDC（补体依赖的细胞毒作用）效应的能力

采用Sigma-Aldrich公司的细胞毒性检测试剂盒（LDH）（货号11644793001），靶细胞为按实施例2的方法制备的膜表达人PD-L1的CHO细胞（CHO-K1/ hmPD-L1）。

将浓度为3×10⁵细胞/mL的靶细胞按80 μL/mL添加人血清作为补体，以50 μL/孔加入96孔细胞培养板，将T0004-BC、T0004-C或Tecentriq（对照）抗体从12000 ng/mL起3倍比系列稀释11个浓度，50 μL/孔加入96孔细胞培养板，37℃、8%CO₂细胞培养箱作用4小时。100μl/孔加入混合后的显色底物，避光显色10-30分钟，用酶标仪检测其OD490，OD630为参考波长。

采用分析软件Origin软件将样品浓度（横坐标，对数值）对OD值（纵坐标）进行曲线拟合，见图31，计算获得T0004-BC、T0004-C诱导CDC效应的EC50（半最大效应浓度）分别为734 ng/mL、716 ng/mL，在高浓度下有弱CDC效应，而Tecentriq（对照）无诱导CDC效应的能力。

实施例19、流式细胞术检测T0004-BC、T0004-C对人PD-L1突变株的结合能力

构建人PD-L1的D49Y、V111E突变体（记作hPD-L1-mu），即在UniProt网站编号Q9NZQ7-1的序列基础上将第49位天冬氨酸、第111位缬氨酸突变为酪氨酸、谷氨酸，设计编码DNA序列、***pcDNA3.1表达载体，稳定转染CHO-K1宿主细胞，通过加压筛选获得膜表面稳定表达hPD-L1-mu的CHO-K1工程细胞（记作CHO-K1/hPD-L1-mu）。将重组人PD-1-Fc融合蛋白、T0004-BC、T0004-C、Tecentriq抗体从10 μg/mL起以2倍比稀释15个浓度，与对数生长期的CHO-K1/hPD-L1-mu细胞混合，冰浴45 min，使其与细胞表面的hPD-L1-mu充分结合。用含1%胎牛血清的PBS洗涤2遍，加入FITC荧光标记的兔抗鼠 IgG(H+L)二抗，冰浴45min，用含1%胎牛血清的PBS洗涤2遍。沉淀重悬于含1%胎牛血清的PBS中，用流式细胞仪进行荧光强度的分析。

实验数据采用分析软件Origin拟合标准曲线分析，横坐标为样品的浓度（对数），纵坐标为平均荧光强度（MFI），见图32，结果表明重组人PD-1-Fc融合蛋白和T0004-BC、T0004-C抗体在一定范围内与CHO-K1/hPD-L1-mu的结合呈现剂量依赖性，而Tecentriq与CHO-K1/ hPD-L1-mu不结合。

实施例20、T0004-BC、T0004-C动物体内抑瘤能力的研究

给BALB/c小鼠皮下接种MC38细胞（小鼠结肠癌细胞，PD-L1阳性），待肿瘤长至100mm³时将荷瘤小鼠分组，每组分别按10 mg/kg的剂量尾静脉注射T0004-BC、T0004-C、Tecentriq或生理盐水对照，每3天注射1次，连续治疗21天，每隔6天观测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化，以测得的肿瘤体积对首次给药后天数作图，结果见图33，说明T0004-BC、T0004-C、Tecentriq在小鼠体内对MC38细胞所形成的肿瘤均有抑制作用，并且T0004-BC、T0004-C抑瘤效果明显较好。