阅读说明：本技术 一种替考游动放线菌的保藏方法 (Preservation method of actinoplanes teichoi ) 是由 王耀耀 张雪霞 朱研研 郝惠云 郄丽萍 王亚莉 于 2018-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于促进替考游动放线菌工业生产菌株产生丰富的游动孢囊孢子的培养方法,菌种培养基配方中选用小麦胚芽粉作为孢子萌发的主要碳氮源,以天冬酰胺、硫酸铵作为补充氮源,微量元素补充铁、锰、钴、锌离子。培养温度采用分阶控制。并以甘油、硬葡聚糖作为复合冷冻保护剂进行-80℃或超低温液氮保藏制备菌种库,菌种库的保藏稳定性得到大幅提高。(The invention provides a culture method for promoting a test actinoplanes industrial production strain to produce rich zoosporangium spores. The culture temperature is controlled in a step mode. And glycerol and scleroglucan are used as composite cryoprotectants to be preserved in liquid nitrogen at the temperature of minus 80 ℃ or ultralow temperature to prepare the strain library, so that the preservation stability of the strain library is greatly improved.)

一种替考游动放线菌的保藏方法

技术领域

本发明涉及一种用于抗生素发酵生产的微生物菌种的保藏制备方法，具体涉及一种用于替考游动放线菌产生大量游动孢囊孢子的培养方法及菌种保藏方法。

背景技术

替考拉宁是继万古霉素、去甲基万古霉素之后又一具有重要临床疗效的抗耐药菌抗生素，其作用机制通过抑制细菌细胞壁合成对革兰氏阳性菌产生强抗菌活性，特别是能够抵抗由多重耐药性细菌金葡菌，肠球菌引起的重度感染，是治疗抗生素耐药性感染的又一药物屏障。替考拉宁的工业生产为微生物发酵法，通过利用稀有放线菌——替考游动放线菌（Actinoplanes teichomyceticus）进行纯种发酵生产获得。在发酵生产中，通过采用适合的菌种保藏手段构建多级菌种库，维持菌种高产发酵特性的表达。菌种库的稳定性及菌种保藏质量，直接关系到生产稳定性、生产效率及终产品质量等关键指标，是整个生产流程的重要技术环节。

替考游动放线菌（Actinoplanes teichomyceticus）属游动放线菌属，在菌丝发育中无气生菌丝形成，其休眠体形式为着生于孢囊梗上包裹于孢囊内的游动孢子。尽量采用菌株的休眠体进行保藏是菌种保藏的基本策略。以往的研究展示了众多天然野生型游动放线菌的特殊培养特征和影响需求。意大利学者F. PARENT等人^[1]最早分离到了一株能够产生替考拉宁的游动放线菌，其培养特征显示菌种在ISP2、ISP3、ISP7等多种培养基上能够形成游动孢囊孢子。2006年Joachim M. Wink等人^[2]利用现代微生物分类鉴定技术将替考拉宁产生菌AB8317命名为替考游动放线菌（Actinoplanes teichomyceticus）新种，其形态特征分析在ISP3上产生大量游动孢囊孢子。我国学者田敏等人^[3]分离到的一株替考拉宁产生菌替考游动放线菌吉安变种（Actinoplanes teichomyceticusvar.jianensis）适合在葡萄糖天冬酰胺培养基上产生孢囊，而在ISP3、ISP4上无孢囊产生。随着近年来替考拉宁产生菌理性育种的推进，金志华等人 ^[4]选育得到的缬氨酸氧肟酸抗性高产突变株以及吴军营等人^[5]选育得到的醋酸钠抗性高产突变株，均表现出菌型缩小，基丝致密的特征。进一步研究显示，高产菌株在原有斜面培养条件下孢囊孢子变少或变无，菌种保藏稳定性显著下降。而从Carlo Taurino等人^[6]近年来发表的替考拉宁发酵工艺优化研究以及Beltrametti F等人^[7]发表的替考拉宁产生菌自身抗性机制的研究中所采用的菌种保藏手段均采用了摇瓶菌丝扩增后进行冷冻保藏，未见采用游动孢囊孢子进行菌种保藏的报道。

发明内容

本发明是针对替考拉宁工业生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）在冷冻保藏中由于孢囊孢子变少或变无出现的保藏效率下降的问题，提供了一种用于培养替考游动放线菌，获得丰富的游动孢囊孢子，并制备多级菌种库用于生产供种的菌种保藏方法。

一种用于替考游动放线菌的保藏方法，包括：（1）产孢子培养基的配制；（2）将保藏菌种接种到产孢子培养基上，菌种培养温度采用分阶控制；（3）采用甘油与硬葡聚糖复合冷冻保护剂收集成熟的孢囊孢子，以一定降温程序进行过程降温后，冷冻保藏，制备多级菌种库；其特征在于：

产孢子培养基成分配比为：小麦胚芽粉15-20g，天冬酰胺0.1-0.2 g，硫酸铵2.0-3.0g,磷酸二氢钾0.5-1.0 g，碳酸钙2.0-4.0g，七水硫酸亚铁0.02-0.03g，四水氯化锰0.005-0.01g，七水硫酸锌0.01-0.02g，氯化钴0.002-0.005g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000mL。

本发明所述菌种保藏方法技术具体如下：

1、产孢子培养基：

配方中选用富含多种氨基酸的天然原材料小麦胚芽粉作为孢子萌发的主要碳氮源，以天冬酰胺、硫酸铵作为补充氮源，微量元素补充铁、锰、钴、锌离子。

2、具体配比为：小麦胚芽粉15-20g，天冬酰胺0.1-0.2 g，硫酸铵2.0-3.0 g,磷酸二氢钾0.5-1.0 g，碳酸钙2.0-4.0g，七水硫酸亚铁0.02-0.03g，四水氯化锰0.005-0.01g，七水硫酸锌0.01-0.02g，氯化钴0.002-0.005g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000mL。

3、接种与培养

将替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）于无菌条件下，接入产孢子培养基，培养温度采用分阶控制，0-144h 27-29°C，144-192h 24-26°C。

4、冷冻保藏方法

本发明所采用的冷冻保护剂为甘油+硬葡聚糖复合配方，配置方法为：

溶液1：称取硬葡聚糖2-4g，悬浮于100mL蒸馏水中，溶胀1h。

溶液2：称取甘油20-40g，溶解于100mL蒸馏水中。

将溶液1、溶液2按照1：1体积比例混合，于121°C灭菌30分钟。

无菌条件下，将无菌冷冻保护剂溶液加入孢子培养物中，经3、所述培养方法培养，制成孢子悬浮液，220r/min振摇10min，经中速滤纸过滤，过滤后将孢子液移入无菌冻存管中，降温速率为7°C /min降至-35°C，再快速置于-80°C或超低温液氮中保藏。

在制备多级菌种库用于生产供种时，按以上菌种培养和冷冻保藏方法分别制备替考拉宁生产种子原种库、生产种子库主菌种库、生产种子库。

经对比试验可知，替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）在改进的产孢菌种培养基上孢囊丰富，显著优于对照培养基，孢囊孢子活计数达到8.0×10⁶以上。经验证，替考拉宁生产菌种三级菌种库菌种保藏存活率1年后均在84%以上。

附图说明

图1替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）在改进产孢培养基上的菌丝孢囊形态。

图2替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）在对照组ISP7培养基上的菌丝孢囊形态。

具体实施方式

实施例1

改进产孢培养基的制备:

第1例）小麦胚芽粉20g，天冬氨酸0.1 g，硫酸铵2.0 g，磷酸二氢钾0.5 g，碳酸钙2.0g，七水硫酸亚铁0.02g，四水氯化锰0.01g，七水硫酸锌0.01g，氯化钴0.005g琼脂粉20 g，蒸馏水1000mL；

除琼脂粉外，混合上述成分，用2.5M的氢氧化钠溶液调整pH值为7.0-7.2，再加入琼脂粉，加热溶化，于121°C灭菌30分钟，趁热分装于培养皿中。

第2例）小麦胚芽粉10g，天冬氨酸0.2 g，硫酸铵3.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，碳酸钙4.0g，七水硫酸亚铁0.03g，四水氯化锰0.005g，七水硫酸锌0.02g，氯化钴0.002g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL；

除琼脂粉外，混合上述成分，用2.5M的氢氧化钠溶液调整pH值为7.0-7.2，再加入琼脂粉，加热溶化，于121°C灭菌30分钟，趁热分装于培养皿中。

对照培养基的制备：

ISP2（酵母粉-麦芽粉琼脂培养基）：酵母粉4.0g，麦芽粉10.0g，葡萄糖4.0g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，消前pH值为7.0-7.4。

ISP3（燕麦粉琼脂培养基）:燕麦粉20g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，消前pH值为7.2。

微量元素溶液：七水硫酸亚铁0.1g，四水氯化锰0.1g，七水硫酸锌0.1g，蒸馏水1000mL。

ISP4（无机盐淀粉琼脂）：可溶性淀粉10.0g，磷酸氢二钾1.0g，七水硫酸镁1.0g，氯化钠1.0g，硫酸铵2.0g，碳酸钙2.0g，微量元素溶液1.0mL，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，消前pH值为7.0-7.4。

ISP5（甘油-天冬酰胺琼脂）：L-天冬酰胺1.0g，甘油10.0g，磷酸氢二钾1.0g，微量元素溶液1.0mL，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，消前pH值为7.0-7.4。

ISP7（酪氨酸琼脂）：甘油15g，L-酪氨酸0.5g，L-天冬氨酸1.0g，磷酸氢二钾1.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，微量元素溶液1.0mL，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，消前pH值为7.0-7.4。

葡萄糖-天冬酰胺琼脂培养基：葡萄糖10g，L-天冬酰胺0.5g，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，消前pH值为7.0-7.4。

取出菌种保藏管，无菌条件下，接入0.5mL替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）种子液于上述培养基，用无菌接种针均匀接种，于27℃培养6天，之后转入26℃培养2天，观察替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）在不同培养基上表现的形态特征。替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）在改进产孢菌种培养基上孢囊丰富，显著优于对照培养基，孢囊孢子活计数达到8.0×10⁶以上，见表1。

表1 替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）在不同培养基上的培养特征

实施例2

按照实施例1改进产孢培养基配方制备双碟培养皿固体、中试管斜面，茄子瓶生产斜面，通气条件分别为：9cm双碟培养皿装量20mL；中试管斜面装量10mL，胶塞口；茄子瓶斜面装量50mL，10g棉塞口。

取出菌种保藏管，无菌条件下，接入0.2-0.5mL种子液于上述培养基，用无菌接种针均匀接种，于29°C培养6天，之后转入24°C培养2天；孢囊孢子活计数分别达到8.8×10⁶、6.5×10⁶、8.1×10⁶。

实施例3

按照实例1改进产孢培养基配方，制备一代茄子瓶菌种斜面，取出菌种保藏管，无菌条件下，接入0.2-0.5mL种子液于上述培养基，用无菌接种针均匀接种，于28°C培养6天，之后转入25°C培养2天。将甘油与硬葡聚糖复合配方冷冻保护剂（甘油200g/L+硬葡聚糖10g/L）加入孢子培养物中，制成孢子悬浮液，220r/min振摇10min，经中速滤纸过滤，过滤后将孢子液移入无菌冻存管中，降温速率为7°C /min降至-35°C，再快速置于超低温液氮中保藏，作为替考拉宁生产种子原种库。

取生产种子原种库接种改进产孢培养基配方制备二代茄子瓶斜面，取出菌种保藏管，无菌条件下，接入0.2-0.5mL种子液于上述培养基，用无菌接种针均匀接种，于28°C培养6天，之后转入25°C培养2天。将甘油与硬葡聚糖复合配方冷冻保护剂（甘油100g/L+硬葡聚糖20g/L）加入孢子培养物中，制成孢子悬浮液，220r/min振摇10min，经中速滤纸过滤，过滤后将孢子液移入无菌冻存管中，降温速率为7°C /min降至-35°C，再快速置于-80°C中保藏，作为替考拉宁生产种子主菌种库。

取生产种子主细胞库接种改进产孢培养基配方制备三代茄子瓶斜面，取出菌种保藏管，无菌条件下，接入0.2-0.5mL种子液于上述培养基，用无菌接种针均匀接种，于28°C培养6天，之后转入25°C培养2天。将甘油与硬葡聚糖复合配方冷冻保护剂（甘油100g/L+硬葡聚糖20g/L）加入孢子培养物中，制成孢子悬浮液，220r/min振摇10min，经中速滤纸过滤，过滤后将孢子液移入无菌冻存管中，降温速率为7°C /min降至-35°C，再快速置于-80°C保藏，作为替考拉宁生产种子库。

生产种子原种库冷冻保护剂的配置：

溶液1：称取硬葡聚糖2g，悬浮于100mL蒸馏水中，溶胀1h。

溶液2：称取甘油40g，溶解于100mL蒸馏水中。

将溶液1、溶液2按照1：1体积比例混合，于121°C灭菌30分钟。

生产种子主菌种库冷冻保护剂的配置：

溶液1：称取硬葡聚糖2g，悬浮于100mL蒸馏水中，溶胀1h。

溶液2：称取甘油20g，溶解于100mL蒸馏水中。

将溶液1、溶液2按照1：1体积比例混合，于121°C灭菌30分钟。

生产种子库冷冻保护剂的配置：

溶液1：称取硬葡聚糖4g，悬浮于100mL蒸馏水中，溶胀1h。

溶液2：称取甘油20g，溶解于100mL蒸馏水中。

将溶液1、溶液2按照1：1体积比例混合，于121°C灭菌30分钟。

将三级菌种库保藏1年内进行菌落活计数检验，考察菌种保藏效果，结果如表2。

表2 替考拉宁生产菌种（Actinoplanes teichomyceticus）三级菌种库菌种保藏存活率