阅读说明：本技术 一种大豆疫霉菌的产孢培养方法 (Spore-producing culture method of phytophthora sojae ) 是由 刘屹湘 张贺 朱书生 杨敏 黄惠川 梅馨月 杜飞 吴家庆 何霞红 李成云 朱有勇 于 2018-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物技术领域,具体公开了一种大豆疫霉菌的产孢培养方法。本发明在菌丝生长完成后加入液体培养基寡营养摇培步骤,使菌饼在10％液体V8培养基中培养,菌丝生长在寡营养状态会受到抑制,进而刺激生殖生长有利于游动孢子囊的产生。进一步通过寡营养阶段摇培结合灭菌水冲洗和土壤浸提液诱导,实现了V8培养基上大豆疫霉菌的大量产孢,孢子量达到2×10<Sup>5</Sup>个/mL,产孢效果和稳定性都远高于现有技术公开的方法。(The invention belongs to the technical field of microorganisms, and particularly discloses a sporulation culture method of phytophthora sojae. In the invention, a liquid culture medium oligotrophic shaking culture step is added after the growth of hyphae is finished, so that the fungus cake is cultured in a 10% liquid V8 culture medium, the growth of the hyphae is inhibited in an oligotrophic state, and the reproductive growth is stimulated to be beneficial to the generation of zoosporangia. Further, the large-scale sporulation of the phytophthora sojae on the V8 culture medium is realized by combining the shaking culture in the oligotrophic stage with the sterilization water flushing and the induction of soil leaching liquor, and the spore amount reaches 2 multiplied by 10 5 The spore yield and the stability are all much higher than those of the methods disclosed in the prior art.)

一种大豆疫霉菌的产孢培养方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种大豆疫霉菌的产孢培养方法。

背景技术

大豆疫病(Phytophthora root rot，简称PRR)，又名大豆疫霉病或称为大豆疫霉菌属根腐病，其病原菌为Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann。该病是一种分布广泛，危害极其严重的土传性病害，也是我国一种重要的对外检疫对象。该病于1948年首先发现于美国的印第安纳州，以后日本、澳大利亚和加拿大等国家也相继报道了该病的发生(沈崇尧，1991；chmittennerA F.1985)。我国于1989年在东北首次分离到了大豆疫霉菌，从此以后我国许多研究人员相继开展了对大豆疫霉菌进行研究(沈崇尧，1991；左豫虎，2001；左豫虎，2002；朱振东，1999)。诱导大豆疫霉菌产生大量游动孢子囊或游动孢子对开展大豆疫霉菌的生物学、生态学、遗传分析、分子分析以及致病性测定等研究都具有重要的意义，然而诱导产孢成为研究中的一个关键环节，如何快速获得大量游动孢子在很大程度上决定着研究的进展和成败。

兰成忠在2007年公开了诱导大豆疫霉菌大量产生游动孢子囊的最佳方法研究，虽然从研究中可以得出土壤浸出液和皮氏液加土壤浸出液能够诱导大豆疫霉产孢，但是产生的游动孢子数量最高仅达到3.68×103个/mL。而且土壤浸出液的成分未知，不同培养基、换液体次数、换液体间隔、培养温度、光照、培养时间、营养物质、菌龄和菌丝量等是否影响大豆疫霉菌游动孢子囊的产生都还不清楚。

左豫虎等在2001年公开了影响大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)游动孢子产生的条件，挑取5～8块直径为8mm于利马豆或V8汁平板上培养4～8d的菌块，置于直径7cm的培养皿内，加入蒸馏水正好没过菌块表面，每30min换水一次，换水4次后加入15mL Petri培养液，25℃、黑暗条件下培养18～20h，可诱发菌块大量产孢，达到3×10⁴个/Ml(左豫虎，藏忠婧.影响大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)游动孢子产生的条件[J].植物病理学报，2001，31(3):241-245.)。然而，该文献虽然从不同培养基、换液体次数、换液体间隔、培养温度、光照、培养时间、营养物质、菌龄和菌丝量等方面进行了研究，但是综合起来看，实验结果中CA培养基的产孢量最大，而V8培养基和利马豆培养基产孢量很低。而本申请发明人通过重复试验进行验证，发现CA培养基的产孢并不稳定，甚至有的时候无法产孢，给后续试验带来很大困难。

公开号为CN105886451A的中国专利申请公开了一种辣椒疫霉游动抱子的单抱分离方法，并具体公开了辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液的制备，具体为：将V8汁用离心机离心去掉沉淀，配制的V8汁琼脂培养基，湿热灭菌后备用。将辣椒疫霉接种到V8汁琼脂培养基平板上，用封口膜密封，25℃黑暗培养促使菌丝生长，然后去掉封口膜转移至荧光灯下一培养促进游动孢子囊的产生。然而，本申请发明人经过实验研究发现，该方法并不适用于大豆疫霉。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种大豆疫霉菌的产孢培养方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一种大豆疫霉菌的产孢培养方法，所述方法包括：

(1)菌种的活化：将大豆疫霉接种于V8培养基上，25℃光暗交替培养6-8d；

(2)从步骤(1)中经过活化所得的V8培养基大豆疫霉菌平板中沿菌落边缘打取菌丝块，把菌丝块挑入装有10％液体V8培养基的培养瓶中，25℃黑暗培养48h；

(3)将步骤(2)培养得到的菌丝块，挑入新的培养皿中，并用无菌去离子水冲洗菌丝块，直至菌丝块发白，菌丝充分展布开即可；(4)游动孢子囊的产生及释放：向步骤(3)中冲洗后的菌丝块中加入土壤浸提液，25℃黑暗培养12-15h。

步骤(2)在温度为25℃，转速为140rpm的条件下采用摇瓶培养。

作为优选，步骤(2)在温度为25℃，转速为140rpm的条件下采用摇瓶培养。

作为优选，步骤(1)中，所述光暗交替培养为光照12h，黑暗12h。

作为优选，步骤(2)中，使用直径为6mm的无菌打孔器沿菌落边缘打取菌丝块。

作为优选，步骤(3)中，用无菌去离子水冲洗菌丝块，冲洗4-5次，直至菌丝块发白，菌丝充分展布开即可，每次冲洗时间间隔5-10min。

本发明所使用的V8培养基、10％液体V8培养基和土壤浸提液具体如下：

V8培养基：此培养基为本领域常规所述，其具体配方为：V8果汁200ml，CaCO₃1.4g，琼脂粉14g，去离子水定容至1L，灭菌备用。

10％液体V8培养基的制备：将100ml V8汁离心去除沉淀，吸取上清液(避免富营养)，加入1.4g CaCO₃，然后加入去离子水定容至1L，灭菌保存备用。

土壤浸提液的制备：土壤50g，加水200ml，高压灭菌锅121℃灭菌20min，过滤后加水补足到1000ml。再次灭菌保存备用。其中，所述土壤为种植过农作物的田园土，优选为种植蔬菜的田园土。

需要说明的是，10％液体V8培养基和土壤浸提液在制备时，可按照上述成分/试剂的体积与质量等比例扩大或缩小。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到

具体实施方式

。

本发明的有益效果在于：

本发明通过实验研究并引入对比实验研究发现：(1)采用V8培养基培养的大豆疫霉菌，比采用CA培养基、利马豆培养基等培养的大豆疫霉菌产孢数量更多，且更稳定。(2)如果始终使用V8培养基进行培养，菌丝生长茂密反而不易产生游动孢子囊。本发明在菌丝生长完成后加入液体培养基寡营养摇培步骤，使菌饼在10％液体V8培养基中培养，菌丝生长在寡营养状态会受到抑制，进而刺激生殖生长有利于游动孢子囊的产生。进一步通过寡营养阶段摇培结合灭菌水冲洗和土壤浸提液诱导，实现了V8培养基上大豆疫霉菌的大量产孢，孢子量达到2×10⁵个/mL，产孢效果和稳定性都远高于现有技术公开的方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所选用的大豆疫霉菌株为国际公认的大豆疫霉2号生理小种，即P6497。

实施例1

本发明中所采用的方法是将大豆疫霉菌株P6497通过无菌打孔器打取直径为6mm的菌丝块转移至装有20mlV8培养基的平板上，25℃光暗交替培养6-8d，用无菌打孔器沿菌落边缘打取直径为6mm的菌丝块(所有菌丝块的菌龄一致)，把菌丝块分别挑入灭好菌的装有10ml 10％液体V8培养基的三角瓶中，每皿移入20块菌丝块，25℃、140rpm黑暗条件摇培48h后，待菌丝长出，把菌丝块分别挑入灭好菌的培养皿中，并用无菌去离子水冲洗菌丝块，冲洗4-5次，直至菌丝块发白，菌丝充分展布开即可，每次冲洗时间间隔5-10min，最后用一次性无菌注射器加入15mL土壤浸提液，25℃黑暗培养12-15h后，显微镜下观察即可看到大量游动孢子释放。

对比例1

将实施例1所述方法作为方法1。

同时，采用以下方法作为对比：

方法2：V8培养基+10％液体V8汁+无菌水；

方法3：CA培养基+液体CA汁+土壤浸提液；

方法4：CA培养基+无菌水[来自左豫虎方法]；

方法5：利马豆培养基+液体利马豆汁+土壤浸提液；

方法6：Rye培养基+皮氏液/土壤浸出液[来自兰成忠方法]；

方法7：10％V8培养基+无菌水[来自专利CN105886451]。

以上所尝试的方法中，只有方法1产孢量大且稳定，其与方法均有所缺陷。具体结果见下表1。

表1不同培养基及处理方法诱导大豆疫霉菌产生游动孢子的比较

因此，通过对比可知，由V8培养基培养的疫霉菌菌丝致密浓厚，白色，绒毡状，菌丝发达，多弯曲。营养生长旺盛。再经10％液体V8培养基继续培养(寡营养状态)，菌丝生长发达，生殖生长旺盛。经过此处理后，菌丝产孢量大，而且产孢稳定。然而，使用CA培养基和利马豆培养基培养的疫霉菌虽然也能产孢，但是极不稳定，为后续的工作带来了很大的麻烦。故而推荐使用V8培养基进行培养，同时配合使用10％液体V8汁进行处理，最后清洗菌丝结束后加入土壤浸提液黑暗静置产孢，即可得到大量的游动孢子。孢子量可达2×10⁵个/mL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。