阅读说明：本技术 一种高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法及其应用 (method for efficiently suspending and concentrating zoospores of plant pathogenic oomycetes and application of zoospores ) 是由 方敦煌 肖炳光 童治军 陈学军 曾建敏 张谊寒 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法,所述的高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法包括游动孢子悬浮液制备、休止游动孢子和浓缩休止孢步骤,具体包括：将植物病原卵菌接种培养制备植物病原卵菌游动孢子悬浮液；休止游动孢子：将植物病原卵菌游动孢子悬浮液置于离心管中,在瞬时超重和失重交替处理条件下形成休止孢；将休止孢进行低温离心浓缩得到目标物休止孢悬浮液。本发明采用瞬时超重和失重的交替处理方法快速休止游动孢子,从根本上克服了现有技术中休止效率低的难题,同时大幅度提升了休止游动孢子的侵染活力,且本发明制备方法稳定性好,效率高,可实现大规模制备,满足规模化实验接种体、测试体等的需求。(The invention discloses a method for efficiently stopping and concentrating zoospores of plant pathogenic oomycetes, which comprises the steps of preparing zoospore suspension, stopping zoospores and concentrating the stopped spores, and specifically comprises the following steps: inoculating and culturing the plant pathogenic oomycetes to prepare a plant pathogenic oomycete zoospore suspension; resting zoospores: placing the plant pathogenic oomycete zoospore suspension into a centrifugal tube, and forming resting spores under the conditions of instantaneous overweight and weightlessness alternative treatment; and carrying out low-temperature centrifugal concentration on the resting spores to obtain a target resting spore suspension. The method adopts an instantaneous overweight and weightlessness alternative treatment method to rapidly stop the zoospores, fundamentally overcomes the problem of low stopping efficiency in the prior art, greatly improves the infection activity of the resting zoospores, has good stability and high efficiency, can realize large-scale preparation, and meets the requirements of large-scale experimental inoculants, test bodies and the like.)

一种高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法及其应用。

背景技术

植物病原卵菌的菌丝可直接形成或发育成各种形状的游动孢子囊，游动孢子囊内的原生质体分割成许多小块，小块逐渐变圆，围以薄膜就形成了游动孢子。游动孢子肾形、梨形或球形，具一或二根鞭毛，在水中游动一段时间后，鞭毛脱落形成休止孢。实验室在配制游动孢子接种液或工作液时，由于受固体培养菌丝、液体培养诱导产孢、低温等处理释放游动孢子等操作环节的影响，所配的游动孢子液浓度达不到实验的要求，这时可以通过浓缩提高浓度。为达到浓缩的目的，通常的做法是让游动孢子形成休止孢、再低温离心，去除上清液，微量液体重新悬浮后就可提高孢子浓度。一般游动孢子经过7~9小时就自然休止，耗时较长，休止孢侵染活力也大为降低。于是实验室很少采用自然休止，而多采用涡旋和振荡促使游动孢子休止，但现有的涡旋和振荡实验室设备休止的效率对于一些特殊的卵菌，如烟草疫霉往往最高可达50%以上，效率有待提高，需要开发游动孢子休止浓缩的技术。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法；第二目的在于提供所述的高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法包括游动孢子悬浮液制备、休止游动孢子和浓缩休止孢步骤，具体包括：

A、游动孢子悬浮液制备：将植物病原卵菌接种培养制备植物病原卵菌游动孢子悬浮液；

B、休止游动孢子：将植物病原卵菌游动孢子悬浮液置于离心管中，在瞬时超重和失重交替处理条件下形成休止孢；

C、浓缩休止孢：将休止孢进行低温离心浓缩得到目标物休止孢悬浮液。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法在制备高侵染活力休止孢中的应用。

本发明采用瞬时超重和失重的交替处理方法快速休止游动孢子，从根本上克服了现有技术中休止效率低的难题，同时大幅度提升了休止游动孢子的侵染活力，且本发明制备方法稳定性好，效率高，可实现大规模制备，满足规模化实验接种体、测试体等的需求。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法包括游动孢子悬浮液制备、休止游动孢子和浓缩休止孢步骤，具体包括：

A、游动孢子悬浮液制备：将植物病原卵菌接种培养制备植物病原卵菌游动孢子悬浮液；

B、休止游动孢子：将植物病原卵菌游动孢子悬浮液置于离心管中，在瞬时超重和失重交替处理条件下形成休止孢；

C、浓缩休止孢：将休止孢进行低温离心浓缩得到目标物休止孢悬浮液。

所述的接种培养包括菌丝培养和游动孢子诱导培养。

所述的菌丝培养是将植物病原卵菌接种至OA培养基中黑暗培养得到菌丝。

所述的黑暗培养是于温度24~26℃下黑暗培养7~10天。

所述的游动孢子诱导培养是将菌丝切成小块得到菌丝块，将菌丝块接种至10%V8汁液体培养基中黑暗培养3~4天，倾去培养液，菌丝块用灭菌水冲洗3~5次，每天换灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，5~8℃低温处理20~30min，然后取出置于室温下15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子，过滤去除菌丝，滤液即为目标物植物病原卵菌游动孢子悬浮液。

所述的黑暗培养的温度为24~26℃。

所述的瞬时超重和失重交替处理是将植物病原卵菌游动孢子悬浮液置于离心管中，置于摆长20~30cm的钟摆上，左右摆动实现瞬时超重和失重状态致鞭毛脱落形成休止孢。

所述的左右摆动的摆幅为30º~45º；摆动的时间为15~30min。

所述的低温离心浓缩是将休止孢于4~6℃低温2500~3000r/min离心15~30min，倾去吸除上清液，重新悬浮得到目标物休止孢悬浮液。

本发明所述的高效休止浓缩植物病原卵菌游动孢子的方法的应用为所述的高效休止浓缩植物病原卵菌的方法在制备高侵染活力休止孢中的应用。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

A、游动孢子悬浮液的制备：将植物病原卵菌接种至OA培养基平板，于24~26℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，将菌丝块加到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于24~26℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，用灭菌水冲洗3~5次，每天换灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子，10~20目纱网过滤去除菌丝，滤液即为植物病原卵菌游动孢子悬浮液；

B、休止游动孢子：将游动孢子液分装10~50mL带旋盖的离心管中，置于摆长20~30cm的钟摆上，摆幅30º~45º，摆动15~30min，左右摆动实现瞬时超重、失重，鞭毛脱落，快速形成休止孢，取处理液置于100~400倍光学显微观察游动孢子休止情况，95%以上休止即止；

C、浓缩休止孢：4~6℃低温2500~3000r/min离心15~30min，倾去吸除上清液，重新悬浮，取5μl于干净载玻片上，在排出悬浮液时枪头朝同一方向拖，拖成一条细短的带，在10×10倍显微镜下计测休止孢的总数，共取样5次，计算5μl悬浮液中休止孢平均值作为休止孢的浓度，按实验需要用灭菌水或10%V8汁稀释至工作浓度。

经测试，本实施例制备得到的休止孢悬浮液的休止效率比常规提高4倍，休止效果比常规提高1倍，侵染活力比常规提高10%~20%（表1）。

表1以烟草疫霉试验的效果比较表