阅读说明：本技术 一种利拉鲁肽裂解液的后处理方法 (Post-processing method of liraglutide lysate ) 是由 周黎 黄保胜 郑春旭 宋亮 王良友 于 2019-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利拉鲁肽裂解液的后处理方法,属于多肽提取纯化技术领域。本发明提供一种利拉鲁肽裂解液的后处理方法,本发明方法利用利拉鲁肽等电点4.9,在碱性水条件下易溶,在酸性条件下易析出,以水为洗涤溶剂,通过调整pH达到析出的目的,避免了使用常规固相裂解沉降和洗涤用到的无水乙醚或甲基叔丁基醚,降低了安全风险,同时减少了采用醚类沉降利拉鲁肽粗品携带的杂质,有助于延长制备柱的使用寿命,降低了纯化的难度,有利于进行工业化生产。(The invention discloses a post-treatment method of liraglutide lysate, belonging to the technical field of polypeptide extraction and purification. The invention provides a post-treatment method of liraglutide lysate, which utilizes the isoelectric point of liraglutide of 4.9, is easy to dissolve under the condition of alkaline water and is easy to separate out under the condition of acidity, water is used as a washing solvent, and the purpose of separating out is achieved by adjusting pH, so that anhydrous ether or methyl tert-butyl ether used in conventional solid-phase cracking and settling and washing is avoided, the safety risk is reduced, impurities carried by ether-based settling liraglutide crude product are reduced, the service life of a preparation column is prolonged, the difficulty of purification is reduced, and the industrial production is facilitated.)

一种利拉鲁肽裂解液的后处理方法

技术领域

本发明涉及一种利拉鲁肽裂解液的后处理方法，属于多肽提取纯化技术领域。

背景技术

利拉鲁肽为丹麦诺和诺德公司研发，是一种长效治疗II型糖尿病的胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物，属于GLP-1受体激动剂。该药于2010年1月25获得FDA批准上市，于2011年3月4日获SFDA批准在中国上市。利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然GLP-1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危险因素有保护作用，为2型糖尿病的治疗带来了新的选择，临床治疗效果令人鼓舞，市场潜力巨大。

目前已公开的利拉鲁肽固相合成肽树脂的裂解后处理均采用无水***或甲基叔丁基醚。如专利CN110291099A利拉鲁肽的合成中使用TFA、苯酚、TIS、H₂O硫代苯甲醚混合物进行该肽的总切割，浓缩肽-TFA混合物并加入到冰MTBE 5-15v中。通过离心和/或过滤分离沉淀的化合物，并在VTD中干燥；专利CN108976296A一种利拉鲁肽的合成方法中切割结束后，将反应器中溶液经砂芯过滤到冰***中，混合均匀，离心弃上清，重复操作3次得到利拉鲁肽粗肽产品；专利CN107903317A一种利拉鲁肽的合成方法中配制裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT＝90:5:3:2，冰浴条件下加入到全保护肽中，反应结束后，加入无水***沉淀，离心沉淀，干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽。专利CN105111303A一种固液结合制备利拉鲁肽的方法将利拉鲁肽(未修饰)肽树脂，加入到冷冻的裂解液(体积配比为TFA/TIS/H₂O＝95/2.5/2.5)中，裂解反应结束，过滤树脂，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至1600ml，倒入16L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀，静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得N端三氟乙酰化利拉鲁肽(未修饰)粗肽。专利CN102875665A一种合成利拉鲁肽的方法中配置570ml裂解液TFA:EDT:PHOH:H₂O＝92:3:3:2，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到5700ml无水***中沉淀，离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到14.1g利拉鲁肽粗肽。

利拉鲁肽市场需求巨大，常规的裂解沉降工艺消耗大量无水***或甲基叔丁基醚，无水***和甲基叔丁基醚均易燃，大量使用有很大的安全隐患。本发明从利拉鲁肽本身的溶解性质考虑，力求避免无水***或甲基叔丁基醚的使用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种利拉鲁肽裂解液的后处理方法，本发明方法利用利拉鲁肽等电点4.9，在碱性水条件下易溶，在酸性条件下易析出，以水为洗涤溶剂，通过调整pH达到析出的目的，避免了使用常规固相裂解沉降和洗涤用到的无水***或甲基叔丁基醚，降低了安全风险，同时减少了采用醚类沉降利拉鲁肽粗品携带的杂质，有助于延长制备柱的使用寿命，降低了纯化的难度，有利于进行工业化生产。

本发明的第一个目的是提供一种利拉鲁肽裂解液的后处理方法，包括如下步骤：

(1)将利拉鲁肽裂解液加入到无机碱溶液中，调整无机碱用量，至样品大量析出，析出后进行固液分离，收集沉淀；

(2)将步骤(1)收集的沉淀用无机碱溶液溶解，溶解后搅拌滴加酸液，至样品大量析出，析出后进行固液分离，收集沉淀；

(3)将步骤(2)收集的沉淀干燥得到利拉鲁肽粗肽。

进一步地，所述的利拉鲁肽裂解液与碱液的体积比为1:5-10。

进一步地，所述的无机碱溶液为稀氨水或氢氧化钠溶液。

进一步地，所述的稀氨水的浓度为2-10％。

进一步地，所述的氢氧化钠的浓度为30-500mg/L。

进一步地，所述的酸液为三氟乙酸、醋酸或磷酸。

进一步地，所述的固液分离为离心或过滤。

进一步地，所述的后处理方法中，步骤(2)重复操作1-2次。

本发明的原理是：基于利拉鲁肽等电点4.9，其在碱性(pH8.0以上)水溶液条件下易溶，在酸性条件下(pH在4.0-6.0左右)易析出，第一步将利拉鲁肽裂解液加入到无机碱溶液中，因为裂解液含有大量三氟乙酸，此时样品是溶解的，需加入碱性溶液提高pH至样品大量析出，析出后进行固液分离，收集沉淀；第二步将收集的沉淀用无机碱溶液溶解，溶解后搅拌滴加酸液，至样品大量析出，析出后进行固液分离，收集沉淀，达到洗涤的目的。

本发明的有益效果是：

本发明方法避免了使用常规固相裂解沉降和洗涤用到的无水***或甲基叔丁基醚，降低了安全风险，同时减少了采用醚类沉降利拉鲁肽粗品携带的杂质，有助于延长制备柱的使用寿命，降低了纯化的难度，有利于进行工业化生产。

附图说明

图1为实施例4中采用氨水沉降得到的利拉鲁肽粗品HPLC图。

图2为实施例4中采用甲基叔丁基醚沉降得到的利拉鲁肽粗品HPLC图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：

取10g利拉鲁肽肽树脂，按体积比TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT＝90:5:3:2配制80mL，将裂解液加入到树脂中，室温反应2.5h，过滤树脂，收集滤液。将滤液加入到800mL5％稀氨水中，搅拌后静置10min左右，离心，弃上层液体。将离心后的产物用200mL 5％稀氨水溶解，搅拌滴加醋酸至溶液大量析出，离心，弃上层液体，再重复此步骤一遍。上述离心产物经真空干燥箱干燥14h，得到利拉鲁肽粗肽5.0g。

实施例2：

取10g利拉鲁肽肽树脂，按体积比TFA：TIS：H₂O＝95：2.5：2.5配制80mL，将裂解液加入到树脂中，室温反应2.5h，过滤树脂，收集滤液。将滤液加入到800mL 100mg/L氢氧化钠中，搅拌后静置10min左右，离心，弃上层液体。将离心后的产物用200mL 100mg/L氢氧化钠溶解，搅拌滴加TFA至溶液大量析出，离心，弃上层液体，再重复此步骤一遍。上述离心产物经真空干燥箱干燥14h，得到利拉鲁肽粗肽5.3g。

实施例3：

取10g利拉鲁肽肽树脂，按体积比TFA:EDT:苯酚:H₂O＝92:3:3:2配制80mL，将裂解液加入到树脂中，室温反应2.5h，过滤树脂，收集滤液。将滤液加入到400mL 10％稀氨水中，搅拌后静置10min左右，离心，弃上层液体。将离心后的产物用200mL 10％稀氨水溶解，搅拌滴加磷酸至溶液大量析出，离心，弃上层液体，再重复此步骤一遍。上述离心产物经真空干燥箱干燥14h，得到利拉鲁肽粗肽5.1g。

实施例4：

取20g利拉鲁肽肽树脂，按体积比TFA：TIS：H₂O＝95：2.5：2.5配制160mL，将裂解液加入到树脂中，室温反应2.5h，过滤树脂，收集滤液。将一半滤液加入到800mL 5％稀氨水中，搅拌后静置10min左右，离心，弃上层液体。将离心后的产物用200mL 5％稀氨水溶解，搅拌滴加醋酸至溶液大量析出，离心，弃上层液体，再重复此步骤一遍。上述离心产物经真空干燥箱干燥14h，得到利拉鲁肽粗肽5.1g，250mL 2％的稀氨水溶解，进样20μL，HPLC见表1和图1。将另一半滤液加入到800mL冷冻甲基叔丁基醚中沉淀，离心，甲基叔丁基醚洗涤3次，离心产物经真空干燥箱干燥14h，得到利拉鲁肽粗肽5.5g，250mL 2％的稀氨水溶解，进样20μL，同样分析条件下HPLC见表2和图2。数据显示，采用稀氨水沉降的样品主峰面积为261.088，主峰纯度为54.78％，采用甲基叔丁基醚沉降的样品主峰面积为230.688，主峰纯度为36.96％。

表1采用氨水沉降得到的利拉鲁肽粗品HPLC统计结果

No.	出峰时间	高度	峰面积	峰面积比例
						min	mAU	mAU*min	％
1	1.16	189.218	58.049	12.18
					2	15.67	24.269	12.920	2.71
3	21.86	7.712	6.990	1.47
					4	24.11	299.759	261.088	54.78
5	25.03	8.732	7.754	1.63
					6	30.74	2.765	3.090	0.65
7	33.36	1.603	1.625	0.34
					8	37.33	4.887	4.392	0.92
9	43.35	218.426	120.724	25.33
					Total:		757.371	476.632	100.00

表2采用甲基叔丁基醚沉降得到的利拉鲁肽粗品HPLC统计结果

No.	出峰时间	高度	峰面积	峰面积比例
						min	mAU	mAU*min	％
1	1.17	448.708	74.930	12.00
					2	15.96	25.597	14.754	2.36
3	21.74	5.217	6.293	1.01
					4	24.23	245.285	230.688	36.96
5	25.26	10.918	5.402	0.87
					6	27.57	7.281	7.191	1.15
7	31.03	5.643	6.051	0.97
					8	35.26	4.220	3.604	0.58
9	38.41	8.946	12.056	1.93
					10	43.35	392.945	263.250	42.17
Total:		1154.760	624.219	100.00

综上，实施例1-3说明不同的利拉鲁肽裂解试剂均可以采用本发明方法处理。实施例4表明，采用稀氨水沉降的样品纯度和含量高于甲基叔丁基醚样品。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。