阅读说明：本技术 使用t4噬菌体展示技术高效表达超敏蛋白的方法 (Method for efficiently expressing hypersensitive protein by using T4 phage display technology ) 是由 刘胜 蒙亮 刘欣 刘军鹏 李维 石聿勇 胡艳红 张会慧 于 2018-12-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种使用T4噬菌体展示技术高效表达超敏蛋白的方法,所述的方法包括如下步骤：(1)将所述超敏蛋白的编码基因与TEV蛋白酶、T4噬菌体Soc蛋白基因片段依次连接,制备融合重组蛋白编码基因,所述超敏蛋白的编码区在TEV-Soc融合蛋白基因的上游,且表达框一致；(2)将所述融合重组蛋白的编码基因转入pUC18质粒中；(3)将所述质粒转入大肠杆菌宿主中；(4)使用Soc蛋白缺失的Soc<Sup>-</Sup>T4噬菌体感染所述的大肠杆菌宿主,培养宿主表达展示所述融合重组蛋白的T4噬菌体；(5)分离展示有所述融合重组蛋白的T4噬菌体；(6)从所述T4噬菌体中分离所述融合重组蛋白,TEV蛋白酶切后获得所述超敏蛋白。(The invention relates toA method for efficiently expressing hypersensitive proteins using T4 phage display technology, said method comprising the steps of: (1) sequentially connecting the encoding gene of the hypersensitive protein with TEV protease and T4 phage Soc protein gene fragments to prepare a fusion recombinant protein encoding gene, wherein the encoding region of the hypersensitive protein is positioned at the upstream of the TEV-Soc fusion protein gene and has consistent expression frames; (2) transferring the coding gene of the fusion recombinant protein into a pUC18 plasmid; (3) transferring the plasmid into an escherichia coli host; (4) use of Soc protein-deleted Soc ‑ Infecting said E.coli host with a T4 bacteriophage, culturing the host to express a T4 bacteriophage displaying said fusion recombinant protein; (5) isolating the T4 phage displaying the fusion recombinant protein; (6) separating the fusion recombinant protein from the T4 bacteriophage, and obtaining the hypersensitive protein after TEV protease cleavage.)

使用T4噬菌体展示技术高效表达超敏蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种使用T4噬菌体展示技术高效表达超敏蛋白的方法。

背景技术

化肥和农药是提高作物产量和防治病虫害的主选产品，但同时产生了环境、能源以及成本等方面的问题，成为现在困扰世界各国的经济与社会发展的重大，严重制约着农业的可持续性发展。而利用来自微生物或真菌的蛋白质制备的生物制品(包括生物肥料和生物农药)是当代作物优质、高效和无公害生产的主要措施。近年来，国内外在此方面已开展了大量的科学研究。早期的微生物蛋白主要是来自苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白(ICP),新型微生物蛋白主要是蛋白激发子类物质，目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)，这些蛋白质不直接杀灭害虫和病原物，也不直接提供营养物质，而是在促进植物生长发育和对营养物质的吸收、增强植物的广谱抗病性(包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性)、增强植物的驱虫性、增强植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)、延长作物产品的储存时间、对盆花和苗木的塑形作用方面有广泛应用前景。因此，它们可以配制成生物制品，应用到以上方面。

这些新型微生物蛋白或多肽大都通过发酵重组大肠杆菌等生物工程菌来实现大批量生产，在发酵后的下一步工艺为溶解细菌悬浮液中的细菌细胞以释放微生物蛋白或多肽。细胞溶解的方法有非化学的方法，如高压或超声波处理，使用该方法对设备要求较高，能耗高且难以大规模应用。作为另外的选择，大部分厂商采用将细胞悬浮液与溶菌酶接触来进行，之后还需要进行40-42℃消化，离心去细胞碎片和变性蛋白，以及蛋白纯化工艺以达到需要的纯度。这些工艺操作复杂，成本昂贵，且由于步骤多，过程冗长，会降低微生物蛋白和多肽的收率，并降低它们的生物活性和稳定性。

因此，需要有步骤简便、成本低廉的方法用于这类新型微生物蛋白或多肽的生产。。

发明内容

为了解决上述问题，提供一种简便、快速的超敏蛋白的制备方法，本发明提供如下技术方案。

本发明首先涉及一种使用T4噬菌体展示表达目的蛋白的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)将所述目的蛋白的编码基因与TEV蛋白酶、T4噬菌体Soc蛋白基因片段依次连接，制备融合重组蛋白编码基因，所述目的蛋白的编码区在TEV-Soc融合蛋白基因的上游，且表达框一致；

(2)将所述融合重组蛋白的编码基因转入pUC18质粒中；

(3)将所述质粒转入大肠杆菌宿主中；

(4)使用Soc蛋白缺失的Soc^-T4噬菌体感染所述的大肠杆菌宿主，培养宿主表达展示所述融合重组蛋白的T4噬菌体；

(5)分离展示有所述融合重组蛋白的T4噬菌体；

(6)从所述T4噬菌体中分离所述融合重组蛋白，TEV蛋白酶切后获得所述目的蛋白。

步骤(1)所述的目的蛋白为超敏蛋白、优选为来源于菌株Erwinia amylovora的GeneBank编号为M92994.3的harpinEa蛋白；

步骤(1)所述融合重组蛋白的编码DNA序列的上游引入Soc启动子序列，下游引入Soc终止子序列；

步骤(3)所述将所述质粒转入大肠杆菌宿主中的方法为化学转化法；

步骤(4)所述的感染为，以MOI(感染复数)＝1的噬菌体浓度侵染培养的大肠杆菌细胞；

步骤(5)所述分离展示有所述融合重组蛋白的T4噬菌体的方法如下，

1)培养液预冷后以43000g离心力低温离心30min，弃上清；

2)以适量PI-Mg缓冲液(3.7g/L Na₂HPO₄、4g/L NaCl、3g/L KH₂PO₄、1mM MgSO₄)充分重悬沉淀，并加入DNase I至终浓度为10μg/ml以及数滴氯仿，在37℃以200rpm转速培养30min；

3)以4000-6000g离心去除细胞残骸，所得上清即为展示有重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液；

步骤(6)所述分离所述融合重组蛋白的方法是：将展示有重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液(悬浮液为PI-Mg缓冲液)使用43000g离心力低温离心30min，去除上清，沉淀以TEV酶切缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，0.5mM EDTA，1mM DTT)重悬；

步骤(6)所述的TEV蛋白酶切获得目的蛋白的方法为：以1000U的酶量30℃温育6h进行酶切处理，再使用43000g离心力低温离心30min，上清即为目的蛋白溶液。

附图说明

图1质粒pVB-harpinEa-TEV-Soc图谱示意图，以圆环示意环状质粒DNA分子，基因表达方向在片段末端以箭头显示；该质粒的结构区域包括：harpinEa-TEV-Soc重组蛋白(harpinEa-TEV-Soc fusion)，基因启动子(Soc promoter)、终止子(Soc terminator)及核糖体结合位(RBS)；harpinEa-TEV-Soc重组蛋白基因中间部位的TEV蛋白酶编码区；氨苄抗性基因(AmpR)及复制起始区(ori)。

图2 T4噬菌体表面展示的重组蛋白以及分离的超敏蛋白的电泳图，

图2A：泳道1为蛋白分子量标准，单位千道尔顿(KD)；泳道2表示展示有harpinEa-TEV-Soc重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液；泳道3：将展示有harpinEa-TEV-Soc重组蛋白(约54KD)的T4噬菌体颗粒悬浮液稀释2倍样品。

图2B：泳道1为蛋白分子量标准，单位千道尔顿(KD)；泳道2-5表示用TEV蛋白酶酶切展示有harpinEa-TEV-Soc重组蛋白(约54KD)的T4噬菌体颗粒悬浮液后的harpinEa超敏蛋白溶液(44KD)从原液到8倍稀释进行的2倍梯度稀释样品；泳道6-9表示小牛血清蛋白(BSA)从2mg/ml到0.125mg/ml进行2倍梯度稀释样品。

图3不同处理下“红颜”草莓作物植物学性状，左图为对照组即稀释用的清水处理区的草莓作物植物学性状实物图；右图为试验组即以上述方法纯化harpinEa蛋白(按终浓度50μg/ml喷雾施用)处理区的草莓作物植物学性状实物图。harpinEa蛋白(按终浓度50μg/ml喷雾施用)处理区的平均株高、开盘度分别为8.5cm和20.7cm，分别较对照增10.23％和9.20％，叶宽和叶长分别为4.9cm和6.4cm，分别较对照增11.4％和10.3％，平均百株座果和百果鲜重分别为733个和1559g，分别较对照增9.5％和12.2％。

具体实施方式

实施例1、超敏蛋白(harpinEa)的序列获取

来源于菌株Erwinia amylovora编码harpinEa蛋白的基因hrpN序列已经公开(GeneBank编号：M92994.3)。超敏蛋白(harpinEa)基因的获得可以采用基因合成、PCR扩增、提取染色体DNA并建立文库等行业内公知的技术。本发明采用基因合成方法，将超敏蛋白(hrapinEa)氨基酸序列送合成(中国苏州金唯智生物科技公司)。

实施例2、构建pVB-harpinEa-TEV-Soc质粒

质粒的骨架来自pUC18质粒。以pUC18质粒为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶以PCR方法扩增氨苄抗性基因和质粒复制区。PCR正向引物为pUC18氨苄抗性基因上游序列中的18个碱基，反向引物则为pUC18质粒复制区下游序列中18个碱基的反向互补序列。正、反向引物的5’端均添加了BglII限制性酶切位点。同时我们以T4噬菌体DNA为模板，使用特异性引物通过PCR扩增获得了Soc蛋白基因片段，其中正向引物的5’端引入了TEV蛋白酶的基因序列。再使用搭桥PCR将合成的harpinEa蛋白基因片段与TEV-Soc蛋白基因片段融合成一个DNA分子，其中harpinEa蛋白的编码区在TEV-Soc融合蛋白基因的上游，且表达框一致。所得的harpinEa-TEV-Soc融合重组蛋白DNA序列的上游由PCR引物引入了Soc启动子序列，而下游则引入了Soc终止子序列，并且在正、反向引物的5’端添加了BglII限制性酶切位点。

我们将上述方法获得的质粒骨架DNA片段及harpinEa-TEV-Soc融合重组蛋白基因片段经BglII限制性内切酶处理后，使用T4连接酶连接成环状DNA并使用化学转化法转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。经细胞培养以及碱裂解法抽提质粒，获得了T4噬菌体同步展示质粒pVB-harpinEa-TEV-Soc，质粒图谱见图1。该质粒序列的正确性经过了测序确认(中国苏州金唯智生物科技公司)。

实施例3、融合重组蛋白的体内表达及噬菌体展示

将T4噬菌体同步展示表达质粒pVB-harpinEa-TEV-Soc以化学转化法转化进入大肠杆菌P301株系感受态细胞中，并在氨苄抗生素压力下，在37℃摇床中以200rpm的转速培养至细菌密度达到3×10⁸个/ml。用Soc蛋白缺失的Soc^-T4噬菌体(由美国天主教大学生物系Rao教授实验室赠予)以MOI(感染复数)＝1侵染培养的大肠杆菌细胞，并继续在37℃摇床中以200rpm转速培养30min。在此过程中，harpinEa-TEV-Soc重组蛋白在T4噬菌体颗粒装配通路的调控下表达，并展示在衣壳上。

展示完成后，培养液立即用预冷的离心管分装，并使用43000g离心力低温离心30min。离心后弃上清，以适量PI-Mg缓冲液(3.7g/L Na₂HPO₄、4g/L NaCl、3g/L KH₂PO₄、1mMMgSO₄)充分重悬沉淀，并加入DNase I至终浓度为10μg/ml以及数滴氯仿，在37℃以200rpm转速培养30min然后再以4300g离心去除细胞残骸，所得上清即为展示有重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液，见图2A。测定噬菌体滴度后，于4℃保存，滴度测试结果见表1。

表1三次重复实验噬菌体滴度测定结果

注：经对三次实验噬菌体展示实验的噬菌体滴度测试，并每次做三组组内平行。结果为噬斑数均在50-150pfu之间，该实验数据表明噬菌体的侵染不影响宿主的生长。

实施例4、harpinEa蛋白的分离

将展示有重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液(悬浮液为PI-Mg缓冲液)使用43000g离心力低温离心30min，去除上清，然后以适量的TEV蛋白酶1×反应缓冲液(50mM Tri-HClpH8.0,0.5Mm EDTA,1mM DDT)重悬。利用TEV蛋白酶将harpinEa蛋白从上述展示有harpinEa-TEV-Soc重组蛋白的T4噬菌体颗粒上分离出来。harpinEa蛋白具有热稳定性，根据TEV Proteaase说明书进行小量测试蛋白酶切效率后选定1000U的酶量30℃温育6h条件处理，再使用43000g离心力低温离心30min，上清即为harpinEa蛋白溶液，见图2。将harpinEa蛋白溶液补至50％的甘油并于-20℃长期保存。

实施例5、harpinEa蛋白对草莓作物的应用及效果

选定安徽长丰县农业示范园区内某农户大棚品种为“红颜”的草莓作物，该作物于2017年9月1日移栽定植，垄高15cm，垄距80cm，垄面宽45cm，每垄2行，行距18cm，株距12cm，种植密度10000株/亩。土壤基础肥力水平如表2所示。

表2“红颜”草莓作物土壤基础肥力水平

按照随机区组试验设计，小区面积15m²。设计以上述方法纯化harpinEa蛋白(按终浓度50μg/ml喷雾施用)为实验组、稀释用的清水作为对照组，分别做2组组内平行。在草莓出叶8～11叶且基部现蕾10％时，喷雾一次，以第一次喷施开始计时15天后再喷雾1次，共喷雾2次。以第一次喷施开始计时50天后调查草莓植物学性状(株高、开盘度、同位叶片长度、宽度、叶柄)，以第一次喷施开始计时分别于55天、60天、65天、70天调查草莓灰霉病病果数、百穴果数和百果鲜重。试验重复3次。统计数据并使用SPSS17.0进行分析。结果参见表3和图3。

表3不同处理下“红颜”草莓作物植物学性状

通过室内试验研究分析超敏蛋白对于“红颜”草莓作物的果实生理学性状的影响，喷施了HarpinEa超敏蛋白的草莓果实糖度提升了21.6％，微生素C含量提升比例为18.95％，如表4所示。

表4不同处理下的“红颜”草莓作物的果实生理性指标(每100g含量)

试验结果表明，大棚草莓在花蕾期喷施2次超敏蛋白，能提高草莓品质。促进植株生长，提高抗病能力，对草莓灰霉病的防效在59.38％以上。同时HarpinEa超敏蛋白无毒无污染，喷施简单易行，易被农户接受，便于推广。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。