阅读说明：本技术 一种海地瓜生物活性肽的制备方法 (Preparation method of acaudina molpadioides biological active peptide ) 是由 徐仰丽 苏来金 杨会成 胡世伟 于 2019-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种海地瓜生物活性肽的制备方法,包括下列步骤：(1)将海地瓜打浆；(2)微生物驯养；(3)微生物发酵降解；(4)酶解；(5)然后离心取上清液,得活性肽溶液。本发明利用海地瓜开展进一步的综合利用,有助于减少污染,提升副产物附加值,促进养殖增收增效。本发明在制备工艺中,在此前的研究基础上,改进工艺步骤,缩短工艺时间,将海地瓜中的胶原蛋白变成多肽,进一步提高海地瓜中多肽的提取率,制备的多肽中生物活性更高的小分子量的多肽含量大大提高,分子量小于1KDa的短肽占比为83.17%。(The invention discloses a preparation method of acaudina molpadioides bioactive peptide, which comprises the following steps: (1) pulping acaudina molpadioides; (2) domesticating microorganisms; (3) microbial fermentation degradation; (4) carrying out enzymolysis; (5) then centrifuging and taking supernatant fluid to obtain active peptide solution. The invention utilizes the acaudina molpadioides to carry out further comprehensive utilization, is beneficial to reducing pollution, improving the added value of byproducts and promoting the efficiency increase of cultivation and income. In the preparation process, on the basis of the previous research, the process steps are improved, the process time is shortened, the collagen in the acaudina molpadioides is changed into the polypeptide, the extraction rate of the polypeptide in the acaudina molpadioides is further improved, the content of the polypeptide with high biological activity and small molecular weight in the prepared polypeptide is greatly improved, and the short peptide with the molecular weight less than 1KDa accounts for 83.17 percent.)

一种海地瓜生物活性肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种海地瓜生物活性肽的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

海地瓜(Acaudina molpadioides Semper)，俗称海地瓜、海茄子、香参等，是芋参目(Molpadida)，尻参科(Caudinidae)、海地瓜属(Acaudina)动物，体长最大可达400mm，一般为100-200mm，主要分布在东海海域从潮问带到水深80米的海底软泥中。

我国东海海域资源非常丰富，目前的蕴藏量约106 t，每年捕获量约3000 t，民间常作为低值海参食用，由于海地瓜加热后质地坚硬，并且生活在浅海软泥中，体表积累了大量铅、镉、汞等有害重金属，使海地瓜资源尚未被充分开发和利用。研究表明，海地瓜营养成分十分丰富，含有丰富的蛋白质、多糖、较低的脂肪和氨基酸，钙、锌与铁元素含量极高，还含有硒、维生素A、维生素B6，维生素E等，其中海地瓜体壁粗蛋白的含量占海地瓜干重的89.16%，高于刺参粗蛋白含量，此类蛋白质主要成分为具有活性的胶原蛋白。近年来，海地瓜多肽被证明与海参多肽一样，具有良好的生物活性，此提取具有抗氧化活性的海地瓜胶原蛋白肽，是一种提高附加值、开发新产品的良好途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种海地瓜生物活性肽的制备方法，本发明是在现有技术CN108410934A的基础上，对海地瓜生物活性肽的工艺进行的完善和改进，制得分子量更小、生物活性更强的多肽。

本发明提供了 芽孢杆菌在制备海洋源生物活性多肽上的应用。具体是在海地瓜生物活性多肽上的应用。

进一步的，将芽孢杆菌和双歧杆菌、乳酸菌共同应用到海地瓜生物活性多肽的提取上。

进一步的，本发明所述的芽孢杆菌选自地衣芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌中的一种。芽孢杆菌为芽孢菌属的种类，革兰氏染色阳性，是一类好气性细菌。该菌无毒性，能分泌蛋白酶等多种酶类，如果能将其应用到生物多肽的提取上，控制好各个流程，其提取效率则大大优于商品化的复合酶。本发明就是在之前的研究基础上，进一步完善其提取流程，缩短工艺步骤，提高提取效率，改进和完善其协同作用的菌株。本发明研究发现，如果单纯只用芽孢杆菌，其发酵效率并不是最优的，之前的报道中，用的是米曲霉菌和酵母菌等，本发明换成了双歧杆菌、乳酸菌的组合，提发酵分解小分子多肽的效率更高。

利用上述研究，本发明提供一种海地瓜生物活性肽的制备方法，包括下列步骤：

（1）将海地瓜打浆，打浆过程中加入纯净水，纯净水和海地瓜的重量比为3-5:1，制得海地瓜浆液。

（2）微生物驯养：将芽孢杆菌和双歧杆菌、乳酸菌接种到海地瓜浆液中，培养1-2d，制得微生物浆液。

（3）微生物发酵降解：用食品级NaHCO₃调节步骤（1）的海地瓜浆液pH至弱碱性7.1-7.5；加入步骤（2）中的微生物浆液，微生物浆液和海地瓜浆液的重量比为1-5:100；充分拌匀，发酵5h-10h。

（4）酶解：继续加入复合蛋白酶，酶添加量4000-6000U/g，酶解时间8--12h，酶解结束后，将温度升高灭酶。

（5）然后离心取上清液，得活性肽溶液。

进一步的，步骤（3）和步骤（4）之间加入去糖的步骤，具体为：微生物发酵降解后加入乙醇，进行多糖沉淀，取上清液，然后用上清液进行步骤（4）。去糖操作后，用复合酶的酶解效果更好。

步骤（4）的复合蛋白酶是胰蛋白酶、组织蛋白酶和溶菌酶，其添加量比为3:2:1。进一步的，步骤（4）酶解的具体步骤是：先加入溶菌酶，温度为30-37℃维持1-3h；然后加入胰蛋白酶、组织蛋白酶，升温到37-40℃维持7-9h。

优选的，本发明的方法中。芽孢杆菌选自地衣芽胞杆菌、枯草芽孢杆、凝结芽孢杆菌中的一种。

进一步的，本发明在步骤（5）得活性肽溶液后，用超滤膜进行不同分子量的多肽的分离。

本发明的有益效果是：

本发明利用海地瓜开展进一步的综合利用，有助于减少污染，提升副产物附加值，促进养殖增收增效。

本发明在制备工艺中，在此前的研究基础上，改进工艺步骤，缩短工艺时间，将海地瓜中的胶原蛋白变成多肽，进一步提高海地瓜中多肽的提取率，制备的多肽中生物活性更高的小分子量的多肽含量大大提高，分子量小于1KDa的短肽占比为83.17%。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的一种海地瓜生物活性肽的制备方法，包括下列步骤：

（1）将海地瓜打浆，打浆过程中加入纯净水，纯净水和海地瓜的重量比为5:1，制得海地瓜浆液。

（2）微生物驯养：将芽孢杆菌和双歧杆菌、乳酸菌接种到海地瓜浆液中，培养1d，制得微生物浆液。

（3）微生物发酵降解：用食品级NaHCO₃调节步骤（1）的海地瓜浆液pH至弱碱性7.1；加入步骤（2）中的微生物浆液，微生物浆液和海地瓜浆液的重量比为1:100；充分拌匀，发酵5h。

（4）酶解：继续加入复合蛋白酶，酶添加量4000U/g，酶解时间12h，酶解结束后，将温度升高灭酶。

（5）然后离心取上清液，得活性肽溶液。

步骤（3）和步骤（4）之间加入去糖的步骤，具体为：微生物发酵降解后加入乙醇，进行多糖沉淀，取上清液，然后用上清液进行步骤（4）。

步骤（4）的复合蛋白酶是胰蛋白酶、组织蛋白酶和溶菌酶，其添加量比为3:2:1。步骤（4）酶解的具体步骤是：先加入溶菌酶，温度为30℃维持3h；然后加入胰蛋白酶、组织蛋白酶，升温到37℃维持9h。

本实施例的方法中。芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌中的一种。

实施例2 酶解上清液中多肽含量的测定

酶解液中多肽含量的测定参照文献（鲁伟, 任国谱, 宋俊梅. 蛋白水解液中多肽含量的测定方法[J]. 食品科学, 2005,26(7):169-171）进行，将Gly-Gly-Tyr-Arg标准品配置成0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mg/ml标准溶液，分别取标准溶液6ml放入10ml离心管中，加入双缩脲试剂A 2.4ml和双缩脲试剂B 1.6ml，混匀。静置10min，在2000r/min离心10min，离心后取上清液在540nm的分光光度计下测定OD值，以肽浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制标准曲线，样品中多肽含量通过回归方程计算求得。

酶解液中多肽得率

应用上述方法，检测酶解液酶解前后的多肽含量，计算多肽的得率：

多肽得率（%）=（酶解后测得多肽含量-酶解前多肽含量）/总蛋白含量

本发明中，Gly-Gly-Tyr-Arg标准样品的回归方程为y=1.7893x+0.1187（R2=0.9997），线性关系良好，可用于溶液中多肽的检测。

应用本实施例的方法测定实施例1中的多肽得率，可达到86.41%。

实施例3 酶解上清液中不同分子量的多肽的分布

肽的分子量测定通常应用经典的凝胶柱层析法，但是这种方法操作麻烦、周期长。采用HPLC中的凝胶排阻色谱法，以TSK-GEL G2000SWXL 为分析柱，分析小分子量肽的分子量分布，快速而简便。

实施例1制备的海地瓜生物活性肽分子量较为接近，集中度比较高，都在3000Da以下，其中以分子量小于 1000Da 的小肽为主，总共占到了83.17%。