阅读说明：本技术 利用响应面法优化水提小蓝粉总皂苷的提取方法 (Method for optimizing extraction of total saponins of water-extracted small blueberries by using response surface method ) 是由 刘全宏 王布雷 殷刚 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物提取技术领域,尤其涉及一种利用响应面法优化小蓝粉总皂苷的提取方法,具体包括(1)制备小蓝粉样品溶液；(2)使用香草醛-冰醋酸法测定样品溶液皂苷含量；(3)试验设计与统计分析；(4)数据处理。本发明方法具有得率高,提取工艺准确、可靠等优点,同时简单易行,提取成本较低,响应面法的采用,保证了最优提取条件的科学性,可以带来良好的经济效益和社会效益。(The invention belongs to the technical field of plant extraction, and particularly relates to an extraction method for optimizing total saponins of small blue powder by using a response surface method, which specifically comprises the following steps of (1) preparing a small blue powder sample solution; (2) measuring the saponin content of the sample solution by using a vanillin-glacial acetic acid method; (3) experimental design and statistical analysis; (4) and (6) data processing. The method has the advantages of high yield, accurate and reliable extraction process, simplicity, practicability, low extraction cost and the like, ensures the scientificity of the optimal extraction condition by adopting a response surface method, and can bring good economic benefit and social benefit.)

利用响应面法优化水提小蓝粉总皂苷的提取方法

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，尤其涉及一种利用响应面法优化小蓝粉总皂苷的提取方法。

背景技术

绞股蓝，为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，别名五叶参、七叶参等。其最早载于明代的《救荒本草》，此外，《中华本草》、《中药大辞典》、《全国中草药汇编》中也均有收录。绞股蓝具有消炎解毒，止咳祛痰之功效，民间多用于治疗慢性支气管炎，传染性肝炎，肾炎和肠胃炎等疾病。现代药理学研究证明：绞股蓝中所含有的皂苷(Gyp)是其主要的活性成分，Gyp有着和人参皂苷相似的四环三萜达玛型结构，而绞股蓝是除五加科外唯一含有此皂苷资源的植物，因此被冠以“南方人参”美誉。

Gyp因其具有的抗肿瘤，抗氧化，抗衰老，抗炎及免疫调节等一系列生物活性而备受研究者青睐,依照相似相溶原理，学者主要以乙醇回流提取Gyp,如中国专利CN201810458420.2公布了一种提取绞股蓝总甙的方法，包括药材的粉碎，乙醇浸提和大孔树脂纯化,其中乙醇浸提是其中关键步骤,然而，乙醇的引入一方面提高了皂苷的生产成本，另一方面也带来了有机试剂的污染,而且目前绞股蓝资源的开发主要以茶饮料为主，其茶汤本质为绞股蓝的水提取物，理论研究与实际应用存在较大脱节。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种利用响应面法优化小蓝粉总皂苷的提取方法，首次以绞股蓝总皂苷得率为指标，提高绞股蓝茶中的皂苷总含量其包括以下步骤：

S1：制备小蓝粉样品溶液；

S2：使用香草醛-冰醋酸法测定样品溶液皂苷含量；

S201：以绞股蓝皂苷标准品为对照绘制标准曲线，计算回归方程；

S202：将小蓝粉样品溶液的吸光值代入上述回归方程中计算出皂苷浓度，然后代入以下公式得到皂苷得率：

皂苷得率(％)＝样品液中皂苷浓度×样品液体积×稀释倍数/初始绞股蓝质量/1000×100；

S3：试验设计与统计分析；

S301：以步骤S202中皂苷得率为指标依次考察液料比、提取时间、提取温度这些单因素对皂苷得率的影响；

S302：在单因素试验结果的基础上，以绞皂苷得率为响应值，以料液比、提取时间和提取温度三个因素为自变量，设计三因素三水平响应面试验，分析小蓝粉皂苷的最佳提取工艺条件；

S4：数据处理：以皂苷得率为得率优化提取工艺，通过对液料比、提取时间和提取温度三因素的多元回归和二项拟合建立回归方程，得到二维和三维响应面图，再通过对试验结果的分析，确定小蓝粉皂苷的最佳提取工艺范围。

作为上述方案的进一步说明，所述步骤S301中各因素对皂苷得率影响的大小为提取温度＞料液比＞提取时间。

作为上述方案的进一步说明，所述步骤S302中分析的最佳提取工艺范围为：液料比30:1～50:1ml/g、提取时间60～120min、提取温度50～70℃。

作为上述方案的进一步说明，所述步骤S4中，确定的最佳提取工艺为：液料比45ml/g，提取时间105min，提取温度70℃。

本发明的有益效果：

1.为避免乙醇带来的污染，同时兼顾实际开发的需求，本发明首次选用水为提取溶剂且不使用任何有机试剂，在单因素试验的基础上，利用响应面法优化小蓝粉皂苷的提取工艺，为小蓝粉茶的进一步开发提供理论依据和工艺基础。通过Design-Expert 8.0软件和BBD试验设计得到最佳工艺：为液料比(45:1ml/g)，提取时间(105min)，提取温度(70℃)，皂苷得率为5.02％。

2.与正交法相比，本发明采用的BBD响应面试验设计用3个变化因子、3个水平和少量的实验组(仅17组)就可以得到最优结果，提高得率，此法不仅降低了能耗，同时又避免了污染物的排放，具有大规模工业化生产的实际意义。

3.本发明具有得率高，提取工艺准确可靠等优点，同时简单易行，提取成本较低，响应面法的采用，保证了最优提取条件的科学性，可以带来良好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1：小蓝粉皂苷标准曲线。

图2：单因素试验，液料比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)对小蓝粉皂苷得率的影响。

图3：因素交互作用对皂苷得率影响的响应面和等高线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，本发明的小蓝粉是以绞股蓝为原料，利用超微粉工艺制得的一种绞股蓝超微粉，本实施例提供的利用响应面法优化小蓝粉总皂苷的提取方法，按照以下方式进行：

第一步，制备样品溶液。

准确称取小蓝粉1g，加水浸取，5000rpm离心10min，收集上清液后备用，按照香草醛-冰醋酸法测定并计算提取液中总皂苷含量。

第二步，香草醛-冰醋酸法测定并计算提取液中总皂苷含量。

首先制作标准曲线：准确称取10mg绞股蓝皂苷标准品，配置为1mg/mL的溶液，分别稀释至0.2,0.4,0.5,0.6,0.8mg/mL，以蒸馏水为对照；取100μL不同浓度的标准溶液，加入100μL香草醛(5％)和500μL高氯酸于65℃水浴反应15min，待反应液冷却置室温后，加1mL冰醋酸混匀；移取200μL于550nm检测吸光值；以皂苷浓度mg/mL为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，所得回归方程为y＝0.0006x+0.0179，R2＝0.09954(参考图1)；然后进行样品皂苷含量测定：取样品液100μL，其余操作均于制作标准曲线步骤相同，利用标准曲线回归方程求得样品皂苷浓度；最后将样品皂苷浓度带入公式：皂苷得率(％)＝样品液中皂苷浓度×样品液体积×稀释倍数/初始绞股蓝质量/1000×100，求得皂苷得率。

第三步：通过试验设计与统计分析皂苷的最佳提取工艺。

首先进行单因素试验：以皂苷得率为指标，依次考察液料比(10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1ml/g，固定时间60min，温度70℃)、提取时间(30、60、90、120、150、180min，固定液料比40:1，温度70℃)、提取温度(30、40、50、60、70、80℃，固定液料比40:1:，时间100min)这3个因素对皂苷得率的影响(参考图2)；

然后进行响应面优化试验方法：在上述单因素试验结果的基础上，采用Design-Expert 8.0(RSM)软件设计试验条件，选用Box-Behnken(BBD)模型，以绞皂苷得率为响应值(R)，以料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)3个因素为自变量，设计三因素三水平响应面试验(见表1)，预测皂苷的最佳提取工艺(见表2)；对其结果进行多元线性回归拟合，得到绞股蓝皂苷得率对料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)的二次多项回归方程模型：

Y＝4.92+0.096×A+6.250×10^-3×B+0.23×C-0.23×AB+0.060×AC+0.18×BC-0.36×A²-0.27×B²-0.17×C²

表1响应面分析因素及水平表

表2响应面试验方案设计结果

其中a为三次试验平均值。

最后回归模型方差分析与显著性检验：对二次回归方程的响应面模型方差分析结果如表3所示，从中可以看出，模型极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)；同时R2＝0.9814，校正R2＝0.9603，说明该模型拟合度较好；CV＝1.52，此值较小，显示试验操作具有可信度；因此该模型可以用于指导优化小蓝粉的水提工艺。

表3方差分析表

a极显著P<0.01

b显著P<0.05

c不显著P>0.05

回归方程各项的方差分析表明：显著性最强的是提取温度和液料比，而提取时间皂苷得率影响不显著；因素间交互效应中，仅有料液比和提取时间的交互效应不显著；三个因素的二次项效应均显著；根据F值大小，可以得出各因素对皂苷的影响大小为提取温度＞料液比＞提取时间。

第四步，进行数据处理。

使用Origin 9.0进行图表的绘制和SPSS 17.0进行数据分析，所有试验均重复三次，最后通过响应面法优化得到的小蓝粉皂苷最佳提取工艺为：液料比(45:1ml/g)，提取时间(105min)，提取温度(70℃)，最终皂苷得率为5.02％。

以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内,本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。