一种从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法
阅读说明：本技术 一种从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法 (Method for separating various natural active ingredients from gynostemma pentaphylla ) 是由 吴国亮 黄华学 李伟 于 2021-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供的了一种从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法,包括以下步骤：S1)对绞股蓝全草进行酶解；S2)对酶解产物进行渗漉提取,得渗漉液和渗漉渣；S3)将渗漉液用陶瓷膜过滤,并脱色,得脱色液；S4)将脱色液减压浓缩至无溶剂,用纯水稀释得到水溶液,将上述水溶液通过聚酰胺树脂柱,收集流出液并浓缩干燥得到绞股蓝总皂苷,聚酰胺树脂柱用洗脱剂解吸并浓缩干燥得到绞股蓝黄酮类化合物；S5)将步骤S2)得到的渗漉渣用热水进行提取,提取液冷却至室温后用纳滤膜过滤,收集纳滤膜截留液并浓缩干燥得到绞股蓝多糖。本发明提供了一种全新的从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法,可获得三种绞股蓝活性成分,且产品收率高,含量高。(The invention provides a method for separating various natural active ingredients from gynostemma pentaphylla, which comprises the following steps: s1) carrying out enzymolysis on the gynostemma pentaphylla whole grass; s2) carrying out percolation extraction on the enzymolysis product to obtain a percolation liquid and percolation residues; s3) filtering the percolate by using a ceramic membrane, and decolorizing to obtain a decolorized solution; s4) concentrating the decolorized solution under reduced pressure until no solvent exists, diluting with pure water to obtain an aqueous solution, passing the aqueous solution through a polyamide resin column, collecting the effluent, concentrating and drying to obtain gynostemma pentaphylla total saponin, desorbing the polyamide resin column with an eluent, concentrating and drying to obtain a gynostemma pentaphylla flavonoid compound; s5) extracting the percolation residue obtained in the step S2) with hot water, cooling the extracting solution to room temperature, filtering with a nanofiltration membrane, collecting the nanofiltration membrane trapped fluid, concentrating and drying to obtain the gynostemma pentaphylla polysaccharide. The invention provides a brand-new method for separating various natural active ingredients from gynostemma pentaphylla, three active ingredients of gynostemma pentaphylla can be obtained, and the product yield is high and the content is high.)
技术领域
本发明涉及绞股蓝天然有效成分的分离技术领域，尤其涉及一种从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法。
背景技术
绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino为葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属(Gynostemma)多年生草质藤本植物，全草入药。
绞股蓝性寒、味苦，其主要有效成分是绞股蓝皂甙，此外还含有甾醇类、黄酮类成分，以及维生素C、谷氨酸等17种氨基酸和铁、锌、铜等18种微量元素。由于绞股蓝具有较高的药用和保健价值，早在1986年国家科委的“星火计划”中，绞股蓝被列为待开发的名贵中药材之首；2002年3月5日原卫生部又将其列入保健品名单。绞股蓝还被中国各地的茶叶加工企业成功地制成绞股蓝茶在市场销售，并获得相当的市场份额和较可观的经济效益。
绞股蓝皂苷为绞股蓝的主要活性成分，由于其酸水解产物与人参皂苷的酸水解产物——人参二醇具有相同的理化性质，因而被称为“南方人参”。绞股蓝有清热解毒、止咳清肺祛痰、养心安神、补气生精之功效，可用于降血压、降血脂、护肝、促进睡眠以及肠胃炎、气管炎、咽喉炎的治疗，并用于多种癌症的抗癌临床治疗。
目前已发现的绞股蓝中含有多种黄酮类化合物，主要为芦丁、槲皮素、山奈酚、商陆素、异鼠李素等，这些黄酮类化合物有很强的生物学活性，具有调节血管渗透性、抗菌消炎、抗氧化等能力，对氧自由基也有较强的消除作用。
研究发现，绞股蓝根、茎、叶中都含有多糖成分，以叶中含量最高，根中最低。绞股蓝多糖是由10个以上的单体组成的大分子糖，具有保护质粒DNA、保护肝脏、消除氧自由基、对抗脂质过氧化、提高免疫力等多种生物学活性。
现有技术对绞股蓝有效成分的提取，关注的重点主要是绞股蓝皂苷，仅对绞股蓝总皂苷做了提取、分离和利用，没有对绞股蓝中的其它天然活性成分开发并综合利用，因此无形中对珍贵的自然资源造成了浪费。且目前的工艺总皂苷收率偏低。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法，可分离得到多种活性成分，且活性成分的含量及收率较高。
为解决上述问题，本发明提供了一种从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法，包括以下步骤：
S1)对绞股蓝全草进行酶解；
S2)对酶解产物进行渗漉提取，得渗漉液和渗漉渣；
S3)将渗漉液用陶瓷膜过滤，并脱色，得脱色液；
S4)将脱色液减压浓缩至无溶剂，用纯水稀释得到水溶液，将上述水溶液通过聚酰胺树脂柱，收集流出液并浓缩干燥得到绞股蓝总皂苷，聚酰胺树脂柱用洗脱剂解吸并浓缩干燥得到绞股蓝黄酮类化合物；
S5)将步骤S2)得到的渗漉渣用热水进行提取，提取液冷却至室温后用纳滤膜过滤，收集纳滤膜截留液并浓缩干燥得到绞股蓝多糖。
本发明优选的，所述步骤S1)具体为：
将绞股蓝干燥全草原料粉碎，用含有纤维素酶的水浸润，酶解。
所述水的用量优选为原料重量的0.5～1倍。
所述纤维素酶的用量优选为原料重量的0.1％～0.01％。
所述酶解的温度优选为室温。
所述酶解的时间优选为6～12h。
本发明将破碎后的绞股蓝原料浸润、酶解的目的，第一是用酶将植物的细胞组织破坏，有利于溶剂的渗透；第二是使原料粉末充分膨胀再投料，防止渗漉器内物料堵塞。若水和酶的用量过少，都将无法充分的达到上述目的；若水和酶的用量过多，不但会造成浪费，而且会对渗漉操作造成消极影响。
然后进行渗漉提取，优选具体的：
将酶解产物用甲醇或乙醇进行渗漉提取。
本发明对所述渗漉提取的具体操作过程并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的渗漉提取过程。
在本发明的一些具体实施例中，将酶解后的产物投入渗漉器，压紧，加入甲醇或乙醇溶液进行渗漉即可。
所述甲醇或乙醇的体积分数优选为50％～95％。
所述甲醇或乙醇的用量优选为原料重量的10～20倍(L/kg)。
所述渗漉提取的温度优选为室温。
所述渗漉提取的流速优选为0.2～1BV/小时。
本发明使用甲醇或乙醇室温渗漉提取，可以在杂质浸出最少的前提下，将原料中的黄酮和总皂苷充分浸出。
然后将渗漉液用陶瓷膜过滤，得甲醇或乙醇滤液。
所述陶瓷膜的孔径优选为10～50nm。
所述陶瓷膜过滤的压力优选为0.01～0.08mpa。
本发明使用陶瓷膜过滤，可以除去渗漉液中的少量大分子杂质和细微的原料颗粒，使物料澄清。
然后进行脱色，依次采用阴离子交换树脂柱、阳离子交换树脂柱进行脱色。
所述阴离子交换树脂柱优选为强碱性大孔型阴离子交换树脂柱；所述强碱性大孔型阴离子交换树脂柱中的阴离子交换树脂包括但不限于D945、D941、LSA-700。
所述阴离子交换树脂柱中的阴离子交换树脂和绞股蓝原料的体积质量比优选为5～10：1(L/kg)。
所述阴离子交换树脂柱的高径比优选为5～8:1，上柱的流速优选为0.5～1.0BV/小时。
所述阳离子交换树脂柱为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；所述阳离子交换树脂柱中的阳离子交换树脂包括但不限于001×7、001×8、001×16。
所述阳离子交换树脂柱中的阳离子交换树脂和绞股蓝原料的体积质量比优选为5～10：1(L/kg)。
所述阳离子交换树脂柱的高径比优选为5～8:1，上柱的流速优选为0.5～1.0BV/小时。
本发明使用阴离子交换树脂柱、阳离子交换树脂柱依次进行脱色的目的是除去甲醇或乙醇滤液中的色素，提高黄酮和皂苷的含量，并减少后续聚酰胺树脂吸附的负担。若离子交换树脂的用量过少、高径比过小或上柱流速过快，都将导致脱色不充分，造成黄酮和皂苷的含量偏低；若离子交换树脂的用量过多、高径比过大或上柱流速过慢，都将造成物料和能源的浪费。
然后进行黄酮和皂苷的分离。脱色液减压浓缩至无醇溶剂，用纯水稀释至原体积，稀释之后的水溶液通过聚酰胺树脂柱，收集聚酰胺树脂柱流出液。将聚酰胺树脂柱流出液浓缩、干燥，得绞股蓝总皂苷。聚酰胺树脂柱用洗脱剂解吸，收集解吸液，浓缩、干燥，得绞股蓝黄酮类化合物。
所述聚酰胺树脂柱中的聚酰胺树脂和绞股蓝原料的体积质量比优选为5～10：1(L/kg)。
所述聚酰胺树脂柱的高径比优选为8～10:1，上柱的流速优选为0.5～1.0BV/小时。
本发明将脱色液浓缩至无醇溶剂、用纯水稀释后，通过聚酰胺树脂柱的目的，是利用聚酰胺树脂选择性吸附绞股蓝黄酮、而不吸附绞股蓝皂苷，进而将两者分离。
上述洗脱剂优选选自体积分数为60％～80％的甲醇或乙醇水溶液。
所述洗脱剂的用量优选为2～3BV。
所述洗脱剂的流速优选为0.5～1.0BV/小时。
采用上述洗脱剂对聚酰胺树脂柱洗脱，可以将吸附在聚酰胺树脂柱中的黄酮类化合物解吸。
然后取上述渗漉渣用热水进行提取，将渗漉渣投入提取罐，用热水搅拌提取。
所述热水的温度优选为60～90℃。
所述热水的用量优选为绞股蓝原料重量的10～20倍(L/kg)。
所述提取的时间优选为2～3小时。
采用热水提取，可以将渗漉渣中的绞股蓝多糖浸出。若热水的温度过低、用量过少或搅拌提取的时间过短，都将导致绞股蓝多糖提取不充分，造成多糖的收率偏低；若热水的温度过高、用量过多或搅拌提取的时间过长，不但会造成能源和物料的浪费，还会导致水溶性杂质过多的浸出，造成多糖产品的含量偏低。
将提取液冷却至室温后用纳滤膜过滤，收集纳滤膜截留液。
所述纳滤膜的截留分子量优选为500～1000Da。
所述过滤的压力优选为1.0～2.0Mpa。
本发明使用纳滤膜过滤，可以除去热水提取液中的小分子糖类和盐。若纳滤膜的截留分子量过大或者过滤的压力过大，都有可能导致部分多糖分子透过纳滤膜，造成绞股蓝多糖的损失；若纳滤膜的截留分子量过小或者过滤的压力过小，都将导致小分子糖类和盐无法完全透过纳滤膜，造成多糖产品的含量偏低。
本发明优选的，将收集的纳滤膜过滤液通过活性炭柱脱色。
所述活性炭柱中的活性炭的目数优选为30～40目。
所述活性炭和绞股蓝原料的体积质量比优选为5～10：1(L/kg)。
所述活性炭柱的高径比优选为1～3:1，上柱的流速优选为1.0～1.5BV/小时。
本发明使用活性炭柱，可以除去纳滤截留液中的色素，以进一步提高绞股蓝多糖的含量。若活性炭的用量过少、活性炭柱的高径比过小或上柱的流速过快，都将无法达到充分除去色素的目的；若活性炭的用量过多、活性炭柱的高径比过大或上柱的流速过慢，不但会造成物料和能源的浪费，还将造成绞股蓝多糖的损耗。
收集活性炭柱流出液，浓缩，干燥，即可得到绞股蓝多糖。
本发明对上述浓缩、干燥的方法并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的浓缩、干燥方法。
本发明方法中，1BV＝1个柱体积。
与现有技术相比，本发明提供的了一种从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法，包括以下步骤：S1)对绞股蓝全草进行酶解；S2)对酶解产物进行渗漉提取，得渗漉液和渗漉渣；S3)将渗漉液用陶瓷膜过滤，并脱色，得脱色液；S4)将脱色液减压浓缩至无溶剂，用纯水稀释得到水溶液，将上述水溶液通过聚酰胺树脂柱，收集流出液并浓缩干燥得到绞股蓝总皂苷，聚酰胺树脂柱用洗脱剂解吸并浓缩干燥得到绞股蓝黄酮类化合物；S5)将步骤S2)得到的渗漉渣用热水进行提取，提取液冷却至室温后用纳滤膜过滤，收集纳滤膜截留液并浓缩干燥得到绞股蓝多糖。
本发明提供了一种全新的从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法，可以获得三种绞股蓝活性成分，且产品收率高，含量高，工艺过程可操作性强，不使用有毒有害、易燃易爆的化工溶剂，安全环保，无污染，生产成本低，还实现了绞股蓝资源的高效综合利用，适宜于工业化生产。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的从绞股蓝中分离多种天然活性成分的方法进行详细描述。
本发明实施例所使用的绞股蓝干燥全草购于陕西平利，其中，总皂苷、总黄酮、总多糖的质量含量分别为6.55％、2.39％和2.17％；本发明实施例所使用的陶瓷膜和纳滤膜均购于南京福林德环保科技有限公司；本发明实施例所使用的离子交换树脂购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用香草醛-高氯酸比色法检测绞股蓝总皂苷的含量、采用三氯化铝比色法测定绞股蓝总黄酮的含量，采用苯酚-硫酸比色法测定绞股蓝多糖的含量。
实施例1
(1)酶解：取绞股蓝干燥全草原料50kg，粉碎至粒径为1～2mm，加入50kg水(含纤维素酶0.05kg)浸润，室温酶解6小时；
(2)渗漉提取：酶解后的原料投入渗漉器，压紧，加入500L体积分数为80％的甲醇溶液，室温渗漉提取，渗漉的流速为0.3BV/小时，得渗漉液，渗漉渣保留待用；
(3)过滤：渗漉液用孔径为50nm的陶瓷膜过滤(过滤压力为0.03mpa)，得甲醇滤液；
(4)脱色：将甲醇滤液依次用阴、阳离子交换树脂柱脱色(阴离子交换树脂的型号为LSA-700，阴离子交换树脂的用量为250L，阴离子交换树脂柱的高径比为5:1，上柱的流速为0.5BV/小时；阳离子交换树脂的型号为001×16，阳离子交换树脂的用量为250L，阳离子交换树脂柱的高径比为5:1，上柱的流速为0.5BV/小时)，得脱色液；
(5)黄酮和皂苷的分离：脱色液减压浓缩至无醇，用纯水稀释至原体积，稀释之后的水溶液通过聚酰胺树脂柱(聚酰胺树脂的用量为250L，聚酰胺树脂柱的高径比为10:1，上柱的流速为0.5BV/小时)，收集聚酰胺树脂柱流出液。将聚酰胺树脂柱流出液浓缩、干燥，得绞股蓝总皂苷产品3.40kg。聚酰胺树脂柱用洗脱剂(体积分数为80％的乙醇水溶液，用量为2BV)解吸，洗脱的流速为1.0BV/小时，收集解吸液，浓缩、干燥，得绞股蓝总黄酮产品1.20kg。
(6)多糖的分离和纯化：将步骤(1)渗漉渣投入提取罐，用700L温度为90℃的热水搅拌提取2小时，热水提取液冷却至室温后，用截留分子量为500Da的纳滤膜过滤，过滤的压力为2.0Mpa，收集纳滤膜截留液。将纳滤膜截留液通过活性炭柱脱色(活性炭目数为30目，活性炭用量为250L，活性炭柱的高径比为2.5:1，上柱的流速为1.0BV/小时)，收集活性炭柱流出液，浓缩，干燥，得绞股蓝多糖产品1.16kg。
经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得绞股蓝总皂苷产品的含量为91.54％，绞股蓝总皂苷的收率为95.03％；经三氯化铝比色法检测，本实施例所得绞股蓝总黄酮产品的含量为92.48％，绞股蓝总黄酮的收率为92.87％；经苯酚-硫酸比色法测定，本实施例所得绞股蓝多糖产品的含量89.07％，绞股蓝多糖的收率为95.23％。
实施例2
(1)酶解：取绞股蓝干燥全草原料50kg，粉碎至粒径为1～2mm，加入30kg水(含纤维素酶0.04kg)浸润，室温酶解8小时；
(2)渗漉提取：酶解后的原料投入渗漉器，压紧，加入800L体积分数为70％的乙醇溶液，室温渗漉提取，渗漉的流速为0.4BV/小时，得渗漉液，渗漉渣保留待用；
(3)过滤：渗漉液用孔径为50nm的陶瓷膜过滤(过滤压力为0.03mpa)，得乙醇滤液；
(4)脱色：将乙醇滤液依次用阴、阳离子交换树脂柱脱色(阴离子交换树脂的型号为D941，阴离子交换树脂的用量为300L，阴离子交换树脂柱的高径比为6:1，上柱的流速为0.7BV/小时；阳离子交换树脂的型号为001×8，阳离子交换树脂的用量为300L，阳离子交换树脂柱的高径比为6:1，上柱的流速为0.7BV/小时)，得脱色液；
(5)黄酮和皂苷的分离：脱色液减压浓缩至无醇，用纯水稀释至原体积，稀释之后的水溶液通过聚酰胺树脂柱(聚酰胺树脂的用量为300L，聚酰胺树脂柱的高径比为9:1，上柱的流速为0.6BV/小时)，收集聚酰胺树脂柱流出液。将聚酰胺树脂柱流出液浓缩、干燥，得绞股蓝总皂苷产品3.49kg。聚酰胺树脂柱用洗脱剂(体积分数为70％的甲醇水溶液，用量为3BV)解吸，洗脱的流速为0.8BV/小时，收集解吸液，浓缩、干燥，得绞股蓝总黄酮产品1.21kg。
(6)多糖的分离和纯化：将步骤(1)渗漉渣投入提取罐，用800L温度为85℃的热水搅拌提取2.5小时，热水提取液冷却至室温后，用截留分子量为1000Da的纳滤膜过滤，过滤的压力为1.5Mpa，收集纳滤膜截留液。将纳滤膜截留液通过活性炭柱脱色(活性炭目数为30目，活性炭用量为300L，活性炭柱的高径比为3:1，上柱的流速为1.0BV/小时)，收集活性炭柱流出液，浓缩，干燥，得绞股蓝多糖产品1.15kg。
经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得绞股蓝总皂苷产品的含量为90.24％，绞股蓝总皂苷的收率为96.16％；经三氯化铝比色法检测，本实施例所得绞股蓝总黄酮产品的含量为90.77％，绞股蓝总黄酮的收率为91.91％；经苯酚-硫酸比色法测定，本实施例所得绞股蓝多糖产品的含量88.78％，绞股蓝多糖的收率为94.10％。
实施例3
(1)酶解：取绞股蓝干燥全草原料50kg，粉碎至粒径为1～2mm，加入40kg水(含纤维素酶0.05kg)浸润，室温酶解6小时；
(2)渗漉提取：酶解后的原料投入渗漉器，压紧，加入1000L体积分数为65％的甲醇溶液，室温渗漉提取，渗漉的流速为0.4BV/小时，得渗漉液，渗漉渣保留待用；
(3)过滤：渗漉液用孔径为20nm的陶瓷膜过滤(过滤压力为0.04mpa)，得甲醇滤液；
(4)脱色：将甲醇滤液依次用阴、阳离子交换树脂柱脱色(阴离子交换树脂的型号为D945，阴离子交换树脂的用量为250L，阴离子交换树脂柱的高径比为5:1，上柱的流速为0.5BV/小时；阳离子交换树脂的型号为001×7，阳离子交换树脂的用量为250L，阳离子交换树脂柱的高径比为5:1，上柱的流速为0.5BV/小时)，得脱色液；
(5)黄酮和皂苷的分离：脱色液减压浓缩至无醇，用纯水稀释至原体积，稀释之后的水溶液通过聚酰胺树脂柱(聚酰胺树脂的用量为350L，聚酰胺树脂柱的高径比为8:1，上柱的流速为0.8BV/小时)，收集聚酰胺树脂柱流出液。将聚酰胺树脂柱流出液浓缩、干燥，得绞股蓝总皂苷产品3.43kg。聚酰胺树脂柱用洗脱剂(体积分数为70％的乙醇水溶液，用量为2.5BV)解吸，洗脱的流速为1.0BV/小时，收集解吸液，浓缩、干燥，得绞股蓝总黄酮产品1.18kg。
(6)多糖的分离和纯化：将步骤(1)渗漉渣投入提取罐，用1000L温度为70℃的热水搅拌提取3小时，热水提取液冷却至室温后，用截留分子量为500Da的纳滤膜过滤，过滤的压力为2.0Mpa，收集纳滤膜截留液。将纳滤膜截留液通过活性炭柱脱色(活性炭目数为30目，活性炭用量为250L，活性炭柱的高径比为2.5:1，上柱的流速为1.5BV/小时)，收集活性炭柱流出液，浓缩，干燥，得绞股蓝多糖产品1.16kg。
经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得绞股蓝总皂苷产品的含量为90.01％，绞股蓝总皂苷的收率为94.27％；经三氯化铝比色法检测，本实施例所得绞股蓝总黄酮产品的含量为91.92％，绞股蓝总黄酮的收率为90.77％；经苯酚-硫酸比色法测定，本实施例所得绞股蓝多糖产品的含量87.75％，绞股蓝多糖的收率为93.82％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
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