阅读说明：本技术 一种对神经细胞进行诱导培养的方法 (Method for inducing and culturing nerve cells ) 是由 陈刚 王国航 栗国贝 孙冰冰 于 2019-12-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种对神经细胞进行诱导培养的方法,包括如下步骤：1)制备神经细胞悬浮液；2)准备石墨烯薄膜,石墨烯薄膜的表面具有沟槽状结构的图案；3)以步骤2)获得的石墨烯薄膜为培养基底材料,将步骤1)获得的神经细胞悬浮液涂布于所述步骤2)获得的石墨烯薄膜具有沟槽状结构图案的表面,以获得装载神经细胞的石墨烯薄膜；4)将步骤3)获得的装载神经细胞的石墨烯薄膜置于培养箱中培养。本申请提供的神经细胞的诱导培养方法,通过将表面具有沟槽状结构石墨烯薄膜作为神经细胞的培养基底材料,使得神经细胞能够被诱导沿其若干个沟槽线性定向的生长,提高神经细胞培养效率。(The invention discloses a method for carrying out induction culture on nerve cells, which comprises the following steps: 1) preparing a neural cell suspension; 2) preparing a graphene film, wherein the surface of the graphene film is provided with a pattern with a groove-shaped structure; 3) coating the neural cell suspension obtained in the step 1) on the surface of the graphene film obtained in the step 2) with a groove-shaped structure pattern by taking the graphene film obtained in the step 2) as a culture substrate material to obtain a graphene film loaded with neural cells; 4) placing the graphene film loaded with the nerve cells obtained in the step 3) into an incubator for culture. According to the induction culture method of the nerve cells, the graphene film with the groove-shaped structure on the surface is used as a culture substrate material of the nerve cells, so that the nerve cells can be induced to grow in a linear orientation mode along a plurality of grooves of the nerve cells, and the culture efficiency of the nerve cells is improved.)

一种对神经细胞进行诱导培养的方法

技术领域

本发明属于生物细胞培养技术领域，具体涉及一种对神经细胞进行诱导培养的方法。

背景技术

神经细胞的定向分化生长对于伤口愈合、神经修复等有重要意义。而现有技术中多采用细胞培养皿进行细胞培养，使用时将细胞悬浮液注入培养皿，再置于二氧化碳培养箱中静置培养，促使细胞贴壁生长。但上述培养方式生长的细胞杂乱无序，并且生长速度仅能够依靠细胞本身，显然不适用于对神经细胞培养以及定向生长的实验研究。

石墨烯具有由碳原子通过sp²杂化形成的二维纳米结构的六角形的蜂巢状结构，此种独特的结构赋予了石墨烯独特的物理及电学等特性、优良的机械性能、导电性、较大的比表面积以及良好的生物相容性等，可以作为神经修复材料进行应用。

目前，现有技术中已经将石墨烯用于细胞培养，如CN208748112U和CN208776741U均利用了石墨烯的导热性，将石墨烯作为加热膜用于细胞培养或观测的系统中；CN10243304A提供了一种石墨烯衬底，可以适用于肿瘤细胞、原代神经细胞以及神经干细胞的生长；CN207877745U提供了一种生物细胞培养器皿，其接触培养细胞的界面设有石墨烯玻璃。专利文献CN110467177A以及文献[1]中还提供了一种双面的三维石墨烯支架，并可用于神经细胞的分化，但其制备方法非常复杂繁琐不易操作，并且获得的石墨烯支架壁厚特别薄，只有单层或几层石墨烯，精度过小，无疑加大了实际应用的难度([1]马迅，可控石墨烯支架对神经祖细胞的生物学研究[D].2019.5.)。

上述方案中虽然都将石墨烯用于细胞培养，但仍没有提供一种快速便捷、实用性强，同时还能促使神经细胞定向生长的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明旨在提供一种能够促进神经细胞快速生长、提高神经细胞培养效率，并且还能够对神经细胞进行定向分化、线性生长的诱导培养方法，所述方法包括如下步骤：

1)制备神经细胞悬浮液；

2)准备石墨烯薄膜，所述石墨烯薄膜的表面具有沟槽状结构的图案；

3)以步骤2)获得的石墨烯薄膜为培养基底材料，将步骤1)获得的神经细胞悬浮液涂布于所述步骤2)获得的石墨烯薄膜具有沟槽状结构图案的表面，以获得装载神经细胞的石墨烯薄膜；

4)将步骤3)获得的装载神经细胞的石墨烯薄膜置于培养箱中培养；

其中，所述步骤2)中的石墨烯薄膜采用以下方法制备：以片径2μm的氧化石墨烯分散液为原料，抽滤制成氧化石墨烯薄膜；再利用倒模的方法制备具有沟槽状表面的硅胶模板，将干燥后的氧化石墨烯薄膜平铺在用水润湿的硅胶模板上，静置晾干成型；使用碘化氢溶液和无水乙醇配制成的还原液对成型的氧化石墨烯薄膜进行还原后，取下薄膜清洗干净即可。

上述神经细胞的诱导培养方法，采用石墨烯材质的培养基底对神经细胞无毒无害，并对神经细胞的生长培养起到一定的促进作用；与此同时，石墨烯薄膜表面的沟槽状结构，有利于诱导细胞沿其沟槽结构线性定向的生长。其中石墨烯薄膜的制备方法利用了表界面效应，实现了介观尺度下石墨烯薄膜的可操控自定义图案制作，并且操作简单易行。

进一步地，所述步骤1)中神经细胞悬浮液的制备方法包括：将神经细胞收集在培养液中，用酶溶液在37℃下处理30分钟，研磨并离心，再将神经细胞重新悬浮于所述培养液，获得神经细胞悬浮液。

更进一步地，所述培养液包括90％培养基，10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素；所述酶溶液为含有5mg/ml蛋白酶和1mg/ml I型胶原酶的磷酸缓冲液。

进一步地，所述步骤2)中石墨烯薄膜表面的沟槽状结构包括若干个沟槽，单个沟槽的宽度为5-200μm，优选10-100μm，更优选15-100μm，更优选20-50μm，单个沟槽的深度为10-50μm，优选20-50μm，更优选20μm。

进一步地，所述石墨烯薄膜的厚度为8-12μm。

进一步地，相邻的所述单个沟槽之间具有线性凸起，所述线性凸起的内部中空贯通。优选的，所述线性凸起的高度为10-50μm，优选15-40μm，更优选20-30μm，更优选20-25μm，更优选20μm；线性凸起的宽度为20-100μm，优选20-80μm，更优选20-60μm，更优选20-50μm。

线性凸起结构的设置一方面可以简化沟槽状结构的制备方法，例如，使得具有一定厚度的片层状石墨烯的部分片层，沿薄膜厚度方向上凸起延伸即可，而无需对其进行刻蚀，另一方面，还可以用于装载促细胞生长因子或胶质细胞源性神经营养因子，例如NGF、NT-3、NT-4、BDNF等，提高神经细胞生长培养效率。此外，沟槽状结构的尺寸范围与大多数细胞的尺寸相匹配，有利于诱导神经细胞沿沟槽的设定方向定向生长。

进一步地，所述步骤3)还包括：向所述装载神经细胞的石墨烯薄膜施加电刺激。

进一步地，所述装载神经细胞的石墨烯薄膜外接有0.1mA的恒流电源，以用于施加电刺激。

如此设置利用了石墨烯的导电性，以使得能够直接对置于其中的神经细胞施以电刺激，促进其生长分化。

进一步地，所述步骤3)中石墨烯薄膜具有沟槽状图案的表面还涂有细胞贴壁生长促剂，以促使生物细胞在石墨烯薄膜表面贴壁生长。

更进一步地，所述细胞贴壁生长促剂包括聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白。

进一步地，所述步骤4)还包括：向装载神经细胞的石墨烯薄膜添加神经生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。

进一步地，所述神经细胞包括背根神经节细胞。其中，背根神经节细胞可以来源于人源或鼠源，优选为鼠源，更优选为3-6周龄大的C57BL/6小鼠。

在一种实施方式中，上述石墨烯薄膜可以通过以下方法制备获得：以片径2μm的2mg/ml氧化石墨烯分散液为原料，利用抽滤法制成厚度10μm的氧化石墨烯薄膜；再利用倒模的方法制备具有微米尺度的图案化表面的硅胶模板，通过将干燥后的氧化石墨烯薄膜平铺在润湿的硅胶模板上，静置晾干成型；使用碘化氢溶液和无水乙醇配制成的还原液对成型的氧化石墨烯薄膜进行还原后，取下薄膜清洗干净即可得到表面具有沟槽状结构图案的石墨烯薄膜。

本发明的有益效果是：

本申请提供的神经细胞的诱导培养方法，通过将表面具有沟槽状结构石墨烯薄膜作为神经细胞的培养基底材料，使得神经细胞能够被诱导沿其若干个沟槽线性定向的生长，此外，还利用了石墨烯本身的导电性为神经细胞的诱导培养施加电刺激，进一步促进细胞快速生长、提高细胞培养效率。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本申请提供的对神经细胞诱导培养的方法使用的装置结构示意图；

图2为石墨烯薄膜的表面结构示意图；

图3为背根神经节细胞在不同石墨烯薄膜上生长效果的共聚焦激光扫描显微镜图，其中图a为对比例1所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图b为对比例2所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图c为实施例1所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图d为实施例2所得的共聚焦激光扫描显微镜图；

图中：1、盖子；2、底板；3、培养室壁；4、石墨烯薄膜；41、线性沟槽；42、线性凸起；5、恒流电源。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

如未特殊说明，下述实施例中的各试剂以及器材均可通过商业途径购得，其中，C57BL/6小鼠由北京大学第三医院提供；生物试剂均由Invitrogen公司提供；共聚焦激光扫描显微镜由德国Leica公司提供，型号为SP8 LIGHTNING。

在一种实施方式中，本申请提供的对神经细胞进行诱导的方法采用通过以下方法制备获得的石墨烯薄膜：以氧化石墨烯分散液为原料，利用抽滤法制成厚度10μm的氧化石墨烯薄膜；再利用倒模的方法制备具有微米尺度的图案化表面的硅胶模板，通过将干燥后的氧化石墨烯薄膜平铺在润湿的硅胶模板上，静置晾干成型；使用碘化氢溶液和无水乙醇配制成的还原液对成型的氧化石墨烯薄膜进行还原后，取下薄膜清洗干净即可得到表面具有沟槽状结构图案的石墨烯薄膜。

在以下实施例提供的对神经细胞进行诱导的方法中，采用通过以下方法制备获得的石墨烯薄膜，具体步骤如下：

S1，制备氧化石墨烯薄膜：将浓度为2mg/ml、片径大小为2μm的氧化石墨烯分散液按照0.8ml/cm²的使用比例，在直径4cm的滤膜上抽滤10ml分散液；使用孔隙0.45μm的醋酸纤维素水性滤膜，-0.8大气压抽滤约8h；取下带有氧化石墨烯薄膜的滤膜，室温自然完全晾干；从滤膜上剥下氧化石墨烯薄膜；

S2，制作平行排列的沟槽状图案硅片，其沟槽图案的规格尺寸为宽50μm、间隔50μm、深度20μm，利用该硅片倒模制作聚二甲基硅氧烷硅胶模板，并用等离子清洗仪处理硅胶模板图案表面，150W功率处理90s；用纯水润湿硅胶图案表面，然后平铺上干燥的实施例1制备获得的氧化石墨烯薄膜，静置晾干；用质量比为1:1～1:3的47％碘化氢溶液和无水乙醇配制还原液，涂覆在氧化石墨烯薄膜的表面，避光静置7h，以获得还原氧化石墨烯，并且为表面具有沟槽状结构的石墨烯薄膜，如图2所示，其中，石墨烯薄膜的厚度为10μm，线性沟槽41的宽度为50μm，深度为20μm，线性凸起42的高度为20μm，宽度50μm。

在以下实施例提供的对神经细胞进行诱导的方法中，采用如图1所示的细胞培养装置进行培养，其中，石墨烯薄膜4铺设于底板2上，再将培养室壁3和盖子1与其组装形成细胞培养室，其中恒流电源5可以不与石墨烯薄膜连接，如实施例1，也可以将石墨烯薄膜4延伸出底板2与恒流电源5连接以施加电刺激，如实施例2。

实施例1

本实施例提供了一种对神经细胞进行诱导培养的方法，所述方法包括如下步骤：

1)制备神经细胞悬浮液：先准备培养基DH10溶液和酶溶液，其中DH10溶液包括90％Dulbecco改良培养基/F-12、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，酶溶液包括5mg/ml dispase(中性蛋白酶)、1mg/ml I型胶原酶溶于不含钙镁离子的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS)；再将4周龄大的C57BL/6小鼠的背根神经节细胞快速分离后收集在冷的DH10溶液中，并用酶溶液在37℃下处理30分钟，研磨和离心后，将细胞重新悬浮于DH10中，获得神经细胞悬浮液；

2)准备采用上述方法制备的石墨烯薄膜，其中石墨烯薄膜的表面具有沟槽状结构的图案；

3)以步骤2)获得的石墨烯薄膜为培养基底材料，并在其沟槽状的图案表面涂上聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白，再将步骤1)获得的神经细胞悬浮液涂布于所述步骤2)获得的石墨烯薄膜具有沟槽状结构图案的表面，以获得装载神经细胞的石墨烯薄膜；

4)将步骤3)获得的装载神经细胞的石墨烯薄膜置于如图1所示的细胞培养装置中，再置于二氧化碳培养箱(95％O₂和5％CO₂)中培养，添加神经生长因子(25ng/ml)和胶质细胞源性神经营养因子(50ng/ml)，控制温度37℃培养24小时。

实施例2

本实施例提供的对神经细胞进行诱导培养的方法与实施例1大致相同，区别仅在于步骤4)中，将步骤3)获得的装载神经细胞的石墨烯薄膜置于如图1所示的细胞培养装置中，并将石墨烯薄膜与恒流电源连接，以施加0.1mA的恒流电，再置于二氧化碳培养箱中培养。

对比例1

本对比例提供的对神经细胞进行诱导培养的方法与实施例1大致相同，区别仅在于，采用通过以下方法制备获得的石墨烯平面薄膜为基底材料，具体步骤如下：

将浓度为2mg/ml、片径大小为2μm的氧化石墨烯分散液按照0.8ml/cm²的使用比例，在直径4cm的滤膜上抽滤10ml分散液；使用孔隙0.45μm的醋酸纤维素水性滤膜，-0.8大气压抽滤约8h；取下带有氧化石墨烯薄膜的滤膜，室温自然完全晾干；从滤膜上剥下氧化石墨烯薄膜；用47％碘化氢溶液和无水乙醇配制还原液，涂覆在氧化石墨烯薄膜的表面，避光静置7h，获得表面没有沟槽状结构的石墨烯平面薄膜。

对比例2

本对比例提供的对神经细胞进行诱导培养的方法与对比例1大致相同，区别仅在于，对石墨烯平面薄膜施加0.1mA的恒流电。

上述各示例培养结束后，将神经细胞固定在4％多聚甲醛中，用PBS中的0.1％Triton X-100透化，然后在1％牛血清白蛋白中封闭。将小鼠抗-β-微管蛋白III的一抗以1：100的稀释度与细胞在4℃温育过夜。用PBS洗涤后，将FITC缀合的二抗以1：100的稀释度加入细胞中60分钟，细胞核用DAPI标记。制作成装片后使用共聚焦激光扫描显微镜进行相应的观测，结果如图3所示，其中图a为对比例1(使用普通石墨烯平面薄膜未施加电刺激)所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图b为对比例2(使用普通石墨烯平面薄膜施加0.1mA恒流电刺激)所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图c为实施例1(使用表面具有沟槽状结构的石墨烯平面薄膜未施加电刺激)所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图d为实施例2(使用表面具有沟槽状结构的石墨烯平面薄膜未施加0.1mA恒流电刺激)所得的共聚焦激光扫描显微镜图。

图3所示的结果表明，采用本申请提供的神经细胞的诱导培养方法，能够诱导神经细胞线性定向生长培养，并且在电刺激的条件下能够有效促进细胞快速生长，提高细胞培养效率。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。