阅读说明：本技术 纳秒脉冲电场在提高细胞干性中的用途 (Application of nanosecond pulsed electric field in improving dryness of cells ) 是由 葛子钢 宁通 张珏 陈佳青 国晋菘 李可佳 于 2018-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及纳秒脉冲电场在提高细胞干性中的用途,具体地,通过对细胞特别是干细胞施加纳秒脉冲电场,可以有效地提高干性基因的表达量并降低细胞的甲基化水平,提高干细胞干性,并进一步促进干细胞接受诱导分化的能力。(The invention relates to application of a nanosecond pulse electric field in improving the dryness of cells, in particular to application of a nanosecond pulse electric field to cells, particularly stem cells, which can effectively improve the expression quantity of dryness genes, reduce the methylation level of the cells, improve the dryness of the stem cells and further promote the capacity of the stem cells to receive induced differentiation.)

纳秒脉冲电场在提高细胞干性中的用途

技术领域

本公开内容一般地涉及利用脉冲电场进行生物处理的技术，特别涉及使用纳秒脉冲电场对细胞特别是干细胞进行处理的技术。

背景技术

干细胞诱导分化是再生医学中重要的研究方向，但干细胞的诱导效率仍待提高，以获得较好的临床效果。为了提高干细胞诱导分化效率，多种多样的刺激手段被人们应用，如物理刺激、化学分子、细胞因子等。电信号作为十分重要的一种物理刺激，它可通过调控细胞内钙离子水平、离子通道等相关信号通路促进干细胞成神经分化、成骨分化、成心肌细胞分化等。但电信号的生物学作用弱，需要长时间的施加电场，作用时间从几十分钟到几天不等，不利于临床应用。

纳秒脉冲电场(nanosecond pulsed electric fields，nsPEFs)是近年来发展起来的可精确控制脉宽、场强和瞬时功率的前沿物理技术，比传统电场的生物学效应更强，作用时间短。但本领域仍然需要开发更多的纳秒脉冲电场的应用。

发明内容

发明人在研究中发现，传统电场的场强大都低于“百V/cm”，脉宽大都高于微秒或毫秒，从而仅能作用到细胞膜外部。而纳秒脉冲电场的脉宽能达到纳秒(ns)级别，场强能到达kV/cm级别，并且能够作用到细胞膜内部的细胞器。进一步地，发明人意外的发现，通过将nsPEFs施加于干细胞，能够大大提高干细胞的干性，并且进一步提高了其接受诱导的能力，从而完成了本发明。

在第一个方面中，本发明提供了电场在增强细胞干性、提高细胞干性基因表达量、降低细胞甲基化基因表达量和/或降低细胞甲基化水平中的用途。

优选地，所述电场为纳秒脉冲电场(nanosecond pulsed electric fields，nsPEFs)。

特别地，所述电场被施加于细胞从而对细胞进行电击。

在一个实施方案中，所述细胞为干细胞，优选为多能干细胞、单能干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、IPS或间充质干细胞。

在另一个实施方案中，所述纳秒脉冲电场的脉宽在1-300ns之间和/或场强在1kV/cm-30kV/cm之间。

在另一个实施方案中，所述脉宽范围在10ns-150ns、20ns-100ns、30ns-80ns、40ns-70ns、50-60ns之间，例如1ns、2ns、3ns、4ns、5ns、6ns、7ns、8ns、9ns、10ns、15ns、20ns、25ns、30ns、35ns、40ns、45ns、50ns、55ns、60ns、65ns、70ns、75ns、80ns、85ns、90ns、95ns、100ns、105ns、110ns、115ns、120ns、125ns、130ns、135ns、140ns、145ns、150ns、155ns、160ns左右；

在另一个实施方案中，所述场强为1kV/cm、2kV/cm、3kV/cm、4kV/cm、5kV/cm、6kV/cm、7kV/cm、8kV/cm、9kV/cm、10kV/cm、11kV/cm、12kV/cm、13kV/cm、14kV/cm、15kV/cm、16kV/cm、17kV/cm、18kV/cm、19kV/cm、20kV/cm、21kV/cm、22kV/cm、23kV/cm、24kV/cm、25kV/cm、26kV/cm、27kV/cm、28kV/cm、29kV/cm、30kV/cm左右。

在另一个实施方案中，所述电击的次数为1-1000次，例如10-900次、20-800次、30-700次、40-600次、50-500次、60-400次、70-300次、80-200次、90-100次，具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90和100次；和/或所述电击的频率为1-1000Hz，例如10-900Hz、20-800Hz、30-700Hz、40-600Hz、50-500Hz、60-400Hz、70-300Hz、80-200Hz、90-100Hz，具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100Hz、200Hz、300Hz、400Hz、500Hz、600Hz、700Hz、800Hz、900Hz、1000Hz左右。

在第二个方面中，本发明提供一种增强细胞干性、提高细胞干性基因表达量、降低甲基化基因表达量和/或降低细胞甲基化水平的方法，其中包括将电场施加于细胞从而对细胞进行电击的步骤，所述电场优选为纳秒脉冲电场；

所述细胞优选为干细胞，更优选为多能干细胞、单能干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、IPS或间充质干细胞。

在一个实施方案中，所述纳秒脉冲电场的脉宽在1-300ns之间和/或场强在1kV/cm-30kV/cm之间；

优选的，所述脉宽范围在10ns-150ns、20ns-100ns、30ns-80ns、40ns-70ns、50-60ns之间，例如1ns、2ns、3ns、4ns、5ns、6ns、7ns、8ns、9ns、10ns、15ns、20ns、25ns、30ns、35ns、40ns、45ns、50ns、55ns、60ns、65ns、70ns、75ns、80ns、85ns、90ns、95ns、100ns、105ns、110ns、115ns、120ns、125ns、130ns、135ns、140ns、145ns、150ns、155ns、160ns左右；

以及，优选的场强为1kV/cm、2kV/cm、3kV/cm、4kV/cm、5kV/cm、6kV/cm、7kV/cm、8kV/cm、9kV/cm、10kV/cm、11kV/cm、12kV/cm、13kV/cm、14kV/cm、15kV/cm、16kV/cm、17kV/cm、18kV/cm、19kV/cm、20kV/cm、21kV/cm、22kV/cm、23kV/cm、24kV/cm、25kV/cm、26kV/cm、27kV/cm、28kV/cm、29kV/cm、30kV/cm左右。

在另一个实施方案中，所述电击的次数为1-1000次，例如10-900次、20-800次、30-700次、40-600次、50-500次、60-400次、70-300次、80-200次、90-100次，具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90和100次；和/或所述电击的频率为1-1000Hz，例如10-900Hz、20-800Hz、30-700Hz、40-600Hz、50-500Hz、60-400Hz、70-300Hz、80-200Hz、90-100Hz，具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100Hz、200Hz、300Hz、400Hz、500Hz、600Hz、700Hz、800Hz、900Hz、1000Hz左右。

在另一个实施方案中，所述电场是通过电击杯施加的。

在另一个实施方案中，所述电场是通过导电膜施加的，优选地，所述导电膜由PLLA(左旋聚乳酸)和WCNT(多层碳纳米管)共混灌注或者静电纺丝而成。

在一个具体实施方案中，所述导电膜采用共混灌注的方式制备，具体如下：将左旋聚乳酸溶解在溶剂(例如三氯甲烷)中，直至完全溶解；同时将多层碳纳米管(例如羧基化碳纳米管)分散在相同溶剂中，超声(例如水浴超声)后加入到前述左旋聚乳酸溶液中，使左旋聚乳酸的终浓度为1-50％w/v，然后再经超声后，将溶液浇注到平板(例如玻璃板)上，放置(优选放置过夜)后将在板上形成的膜揭下，再把膜放到的烘箱(例如真空烘箱)处理确保溶剂完全挥发(优选在35℃温度下)，即得到所需的导电膜。

在另一个具体实施方案中，所述聚乳酸的分子量在1万-100万道尔顿之间，其特性粘数为1-20dL/g。

在第三个方面中，本发明提供一种提高间充质干细胞向软骨细胞、骨细胞或者脂肪细胞分化能力的方法，其中包括向所述间充质干细胞施加纳秒脉冲电场从而对所述间充质干细胞进行电击的步骤。

在一个实施方案中，所述纳秒脉冲电场的脉宽在1-300ns之间和/或场强在1kV/cm-30kV/cm之间；优选的脉宽范围在10ns-150ns、20ns-100ns、30ns-80ns、40ns-70ns、50-60ns之间，例如1ns、2ns、3ns、4ns、5ns、6ns、7ns、8ns、9ns、10ns、15ns、20ns、25ns、30ns、35ns、40ns、45ns、50ns、55ns、60ns、65ns、70ns、75ns、80ns、85ns、90ns、95ns、100ns、105ns、110ns、115ns、120ns、125ns、130ns、135ns、140ns、145ns、150ns、155ns、160ns左右；优选的场强为1kV/cm、2kV/cm、3kV/cm、4kV/cm、5kV/cm、6kV/cm、7kV/cm、8kV/cm、9kV/cm、10kV/cm、11kV/cm、12kV/cm、13kV/cm、14kV/cm、15kV/cm、16kV/cm、17kV/cm、18kV/cm、19kV/cm、20kV/cm、21kV/cm、22kV/cm、23kV/cm、24kV/cm、25kV/cm、26kV/cm、27kV/cm、28kV/cm、29kV/cm、30kV/cm左右。

在另一个实施方案中，所述电击的次数为1-1000次，例如10-900次、20-800次、30-700次、40-600次、50-500次、60-400次、70-300次、80-200次、90-100次，具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90和100次；和/或所述电击的频率为1-1000Hz，例如10-900Hz、20-800Hz、30-700Hz、40-600Hz、50-500Hz、60-400Hz、70-300Hz、80-200Hz、90-100Hz，具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100Hz、200Hz、300Hz、400Hz、500Hz、600Hz、700Hz、800Hz、900Hz、1000Hz左右。

在另一个实施方案中，所述电场是通过电击杯施加的。

在又一个实施方案中，所述电场是通过导电膜施加的，优选的，所述导电膜由PLLA(左旋聚乳酸)和WCNT(多层碳纳米管)共混灌注或者静电纺丝而成。

在一个具体实施方案中，所述导电膜采用共混灌注的方式制备，具体如下：将左旋聚乳酸溶解在溶剂(例如三氯甲烷)中，直至完全溶解；同时将多层碳纳米管(例如羧基化碳纳米管)分散在相同溶剂中，超声(例如水浴超声)后加入到前述左旋聚乳酸溶液中，使左旋聚乳酸的终浓度为1-50％w/v，然后再经超声后，将溶液浇注到平板(例如玻璃板)上，放置(优选放置过夜)后将在板上形成的膜揭下，再把膜放到的烘箱(例如真空烘箱)处理确保溶剂完全挥发(优选在35℃温度下)，即得到所需的导电膜。

在另一个具体实施方案中，所述左旋聚乳酸的分子量在1万-100万道尔顿之间，其特性粘数为1-20dL/g。

在第四个方面中，本发明提供了利用第二个方面和第三个方面的方法处理后所获得的细胞。

在第五个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其含有第四个方面中的细胞。

本发明首次发现了纳秒脉冲电场能够提高干细胞的干性，并且所述干性的提高适用于多种干细胞类型,而干细胞干性的提高则进一步促进了其接受诱导和进行分化的能力。因此本发明的技术方案对提高干细胞的活力和分化潜能，促进干细胞在再生医学中更广泛和高效的应用具有不可估量的价值。

附图说明

图1(A)纳秒脉冲电场的装置，(B)电击杯侧视图，(C)电击杯俯视图，(D)细胞实验采用的电击杯及其场强仿真：(E)不同的电击条件下对细胞存活状态的影响。

图2显示了纳秒脉冲电场刺激猪骨髓间充质干细胞后干性基因和甲基化相关基因的检测结果。

图3显示了纳秒脉冲电场刺激猪骨髓间充质干细胞后细胞整体甲基化水平检测。

图4显示了经纳秒脉冲电场刺激和诱导成软骨分化后，阿利新蓝染色(A)、GAG半定量(B)和COLII、ACAN以及Sox9基因的表达(C)。

图5显示了经纳秒脉冲电场刺激和诱导成骨分化后，茜素红半定量结果。

图6显示了经纳秒脉冲电场刺激和诱导成脂分化后，油红o半定量结果。

图7显示了纳秒脉冲电场刺激人胚胎干细胞后细胞干性基因OCT4、NANOG和SOX2的检测结果。

图8显示了导电膜的实物图(A)以及扫描电镜图(B)。

图9比较电击杯和导电薄膜刺激间充质干细胞对干性基因表达的影响

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例不是要限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

定义

术语“干性”，是指干细胞维持未分化状态的一种能力。干细胞在不断的自我更新的同时，还保持了向一种或多种细胞命运分化的潜在能力，以及接受外加诱导进行分化的能力。干细胞的干性可以通过形态学观察，也可以通过检测细胞的干性基因来检测。术语“干性基因”，也叫“干性标记基因”或“干性相关基因”，是指与干细胞的状态有关的基因，这些基因的表达有利于干细胞的干性维持。常见的干性基因包括Oct4、Nanog、Sox2等。

此外，干细胞的干性还可以通过细胞内降低程度的甲基化水平来表征，甲基化水平的降低可以通过甲基化基因的表达量下调实现。因此干细胞的干性进一步还可以通过细胞内甲基化基因的低表达(表达量降低)而表征。在本公开中，术语“甲基化相关基因”也叫作为“甲基化基因”，是指促进细胞甲基化从而提高细胞甲基化水平的基因，例如甲基转移酶基因，更具体例如Dnmt1。

术语“电击”，在本文中也被称为“电刺激”或者“电场刺激”，是指对目标对象如细胞(包括干细胞)以特定的次数和频率施加一定脉宽和场强的电场(或电脉冲)。在一个实施方案中，电击通过专门的装置实施。在一个具体实施方中，通过电击杯实施。在另一个具体实施方案中，通过导电膜(或者叫做导电薄膜)实施。

导电膜可以采用任何现有技术已知的材料和结构，只要其能够实现施加电场的功能，并且可以利用现有方法进行制备。作为一个备选方案，Zhu S,Jing W,Hu X,Huang Z,Cai Q,Ao Y,Yang X.2017.Time-dependent effect of electrical stimulation onosteogenic differentiation of bone mesenchymal stromal cells cultured onconductive nanofibers.J Biomed Mater Res Part A2017:105A:3369–3383中公开了一种纳米纤维(nanofiber)以及其制备方法，其全文通过引用包含在本公开中。

在一个实施方案中，导电膜由左旋聚乳酸(PLLA)和多层碳纳米管(WCNT)通过共混灌注或者静电纺丝而成，制备的导电薄膜表面光滑，并且电阻与PBS相近。

在一个实施方案中，待处理细胞被接种在导电膜上，并且在导电膜上直接进行电击，而无需进行先制备细胞悬液。

在又一个实施方案中，电击的脉宽在1-300ns之间，优选的脉宽范围在10ns-150ns、20ns-100ns、30ns-80ns、40ns-70ns、50-60ns之间，更具体如1ns、2ns、3ns、4ns、5ns、6ns、7ns、8ns、9ns、10ns、15ns、20ns、25ns、30ns、35ns、40ns、45ns、50ns、55ns、60ns、65ns、70ns、75ns、80ns、85ns、90ns、95ns、100ns、105ns、110ns、115ns、120ns、125ns、130ns、135ns、140ns、145ns、150ns、155ns、160ns左右。

在有一个实施方案中，场强范围在1kV/cm-30kV/cm，优选的场强为1kV/cm、2kV/cm、3kV/cm、4kV/cm、5kV/cm、6kV/cm、7kV/cm、8kV/cm、9kV/cm、10kV/cm、11kV/cm、12kV/cm、13kV/cm、14kV/cm、15kV/cm、16kV/cm、17kV/cm、18kV/cm、19kV/cm、20kV/cm、21kV/cm、22kV/cm、23kV/cm、24kV/cm、25kV/cm、26kV/cm、27kV/cm、28kV/cm、29kV/cm、30kV/cm左右。

需要说明的是，上述脉宽和场强值除了指代数值本身外，在某些实施方案中，由于施加电脉冲设备本身精度等原因，所施加的脉宽在该数值基础上具有一定的上下浮动，所述浮动可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，因此在这些实施方案中，所述脉宽和场强值也同样包含了围绕该数值上下的浮动值；此外，这种浮动在本发明中也可以用数值后的“左右”来体现。

术语“纳秒脉冲电场”，纳秒是十亿分之一秒，持续时间从几个至几十个纳秒的脉冲称为纳秒脉冲。纳秒脉冲电场的主要特点是高功率、低热量，因而在***过程中几乎没有热的产生；而且能够穿过细胞膜作用于细胞内的细胞器，进而影响细胞的生物学功能。

不同于长脉冲产生的细胞膜电穿孔现象，纳秒脉冲产生极高的功率(几十亿瓦特)，极短的持续时间(纳秒)和很高的场强(kV/cm)，因而可在细胞膜完全充电之前穿入细胞而作用于亚细胞结构。由于纳秒脉冲的持续时间比细胞膜的充电时间还短，因而对细胞膜几乎不产生影响，不会引起细胞膜的电穿孔效应。

实施例

材料和方法

设备

骨髓间充质干细胞提取及培养

试剂：DMEM(Gibco)；DMEM高糖培养液(Gibco)；胰酶(Trypsin，Invitrogen)；胎牛血清(FBS，Gibco)；***(dexamethasone，Life Technologies)；TGF-β3(Peprotech)；丙酮酸钠(Life Technologies)；维生素C(Vc，Sigma)；ITS(Insulin TransferrinSeleniumpremix，Life Technologies)；脯氨酸(国药集团)；甘油磷酸钠(Sigma)；固绿(Amresco)；碱性磷酸酶(ALP)测试盒(南京建成生物工程研究所)；TritonX-100(Sigma)；骨髓间充质干细胞培养液：用加样器向灭菌后的培养瓶中加入160mL DMEM原液、40mL融化的FBS，再加入1000×的PS 200μL。整个过程均在灭菌后的超净工作台里操作，并保持无菌环境。BDMatrigel^TM matrix(BD Biosciences公司,354277),mTeSR1Complete Kit(Stemcell公司，05850)

操作步骤：

(1)猪骨髓间充质干细胞提取

本实验采用猪骨髓间充质干细胞。实验用猪取自于北京阜外医院动物实验科室。动物许可通过北京阜外医院动物伦理答辩，所有研究过程中动物实验都遵守北京大学动物伦理委员会相关规定。

将猪腿用75％酒精浸泡20分钟，转移至超净台，用电钻打开骨髓腔。用PBS冲洗骨髓至培养皿中，直至清洗液清澈为止。将培养皿内液体收集并转移至15mL离心管中，以1000rpm速度在离心机中低速离心10min，收集细胞。

(2)细胞培养

将沉淀细胞团用骨髓间充质干细胞培养液悬浮后培养细胞，第一天采用半换液，之后每隔三天用PBS冲洗并更换培养基。培养过程中在显微镜下对细胞拍照观察并记录。

(3)细胞传代

当细胞长满80％时，向细胞培养皿中加入2mL胰酶，置于培养箱消化3分钟。待在显微镜下观察到骨髓间充质细胞悬浮，向培养皿中加入含2倍体积胰酶的细胞培养液，一并转移至15mL离心管中，在冷冻离心机中以1000rpm转速离心5分钟。收集细胞沉淀，用血球计数板计数，重悬于培养基中。以5000个/cm²的细胞密度培养细胞，每周两次换液。

(4)细胞冻存

将传代后的骨髓间充质细胞用胰酶消化，离心后弃上清，加入冻存液后吸至冻存管中。将冻存管放置在程序降温盒，-20℃放置3小时，-80℃低温冰箱过夜后放置在液氮罐中长期保存。

复苏细胞时，将冻存管在37℃水浴锅快速摇动使冰融化。后续实验采用第五代原代骨髓间充质干细胞。

人胚胎干细胞系H9的培养

(1)铺板：

使用BD Matrigel^TMmatrix(BD Biosciences公司,354277)在6孔板上进行铺板，根据其说明书使用预冷的DMEM/F-12稀释，将稀释后的基底胶置于6孔板中，每孔1mL,轻轻晃动培养皿，均匀的覆盖到培养皿的表面，混匀后室温孵育1h。

(2)培养：

使用mTeSR1Complete Kit(Stemcell公司，05850)培养基培养人胚胎干细胞系H9，每天换液，评估监控生长状态，直到下一次传代。

(3)传代：

使用DMEM/F-12进行清洗，使用分散酶(dispase)在37℃消化4-7分钟左右，吸掉分散酶，然后用DMEM/F-12轻轻的洗涤培养皿，通过血清学玻璃移液管或细胞刮刮取集落，收集并离心，重选混匀后以1:6至1:10的分配比例进行传代。

通过电击杯施加电刺激

(1)电脉冲装置

电脉冲装置可以以本领域技术人员熟知的任意方式连接和组合，在本发明的实施例中所采用的纳秒脉冲电场装置组成部分包括高压直流电源、同轴传输电缆、高压探头和刺激细胞的电击杯(BTX)(电击杯还可以采用市面上可购买的任意型号的电击杯)。其中，高压直流电源提供刺激电场，同轴传输电缆可以对电能进行压缩，通过高压探头形成纳秒脉冲电场，可以用纳秒级电场作用在负载电击杯上。本装置搭建的是脉宽为100纳秒的脉冲电场。高压直流电源的输出电压可以在示波器上读取，通过改变输出电压实现调控电击杯内不同的纳秒脉冲场强。

(2)电刺激以及诱导和/或分析

利用血球计数板对细胞(猪骨髓间充质干细胞或人胚胎干细胞)进行计数，将细胞悬浮于PBS中，制备10万-150万/ml的细胞悬浮液。取细胞悬液500μL-800μL置于电击杯中，实验组经过特定参数的纳秒脉冲电场刺激；电刺激结束后，低速离心收集细胞，分别使用成软骨、成骨、成脂诱导(下文有详细描述)对猪骨髓间充质干细胞进行为期两周左右的成软骨(pellet culture)、成脂、成骨诱导培养，并且同时在细胞被电刺激后4h以内，可取部分被电刺激后的细胞进行必要的分析检测，如实施例中进行的干性基因检测(此项检测使用到人胚胎干细胞及猪骨髓间充质干细胞)、DNA整体甲基化水平检测(猪骨髓间充质干细胞)。

通过导电膜施加电刺激

实施例中使用的导电膜以分子量为10万、特性粘数为2.7dL/g的左旋聚乳酸与WCNT(多层碳纳米管)作为原料，利用共混灌注法制成。具体步骤包括：将1g聚乳酸溶解在5mL三氯甲烷中，溶解8h直至完全溶解；同时将30mg羧基化碳纳米管分散在5mL三氯甲烷中，水浴超声30min后加入到左旋聚乳酸的三氯甲烷溶液中，使左旋聚乳酸的终浓度为10％w/v，然后再超声20min后，将溶液浇注到玻璃板上，放置过夜后揭下，再把膜放到35℃的真空烘箱一天确保溶剂完全挥发，即得到所需的导电膜。该导电膜表面光滑，并且电阻与PBS相近。

采用导电膜的纳秒脉冲电场装置组成部分包括高压直流电源、同轴传输电缆、高压探头、导电片和刺激细胞的导电膜。其中，高压直流电源提供刺激电场，同轴传输电缆可以对电能进行压缩，通过高压探头形成纳秒脉冲电场，通过在导电膜两侧的导电片，将纳秒级电场作用在导电膜上。本试验中使用的装置搭建脉宽为100纳秒的脉冲电场。高压直流电源的输出电压可以在示波器上读取，通过改变输出电压实现调控导电膜上不同的纳秒脉冲场强。

采用导电膜电击的具体步骤如下：采用猪骨髓间充质干细胞，当细胞长满80％时，向细胞培养皿中加入2mL胰酶，置于培养箱消化3分钟。待在显微镜下观察到骨髓间充质细胞悬浮，向培养皿中加入含2倍体积胰酶的细胞培养液，一并转移至15mL离心管中，在冷冻离心机中以1000rpm转速离心5分钟。收集细胞沉淀，用血球计数板计数，重悬细胞于培养基中，达到50～400万个/mL的细胞密度，取50μL均匀的滴加至导电薄膜上，常温孵育3～12h后加入培养基。每周两次换液。电刺激时将培养基更换为PBS缓冲液，两侧加入导电板，施加特定参数的纳秒脉冲电场刺激。电刺激结束后，更换为生长培养基继续培养，待到指定时间点消化细胞，进行后续检验。

成软骨分化诱导：

成软骨诱导培养基配方：High glucose DMEM(Gibco),10ng/mLTGF-β3(R&DSystems,Minneapolis,MN),10^-7M dexamethasone (D4902,Sigma),50μg/mL ascorbicacid(A5960,Sigma),1mM sodium pyruvate(P2256,Sigma),4mM proline(P5607,Sigma),1％(v/v)ITS(41400045,Gibco)。

培养步骤：将骨髓间充质干细胞用胰酶消化计数，弃掉培养液后用成软骨诱导培养液制备2.5×10⁵/mL的细胞悬浮液，吸取1mL至15mL离心管，在500g条件下低速离心5min，然后进行干细胞pellet小球培养，每3天更换培养液，培养至14天。

成脂肪分化诱导：

成脂诱导培养基配方：

A液-分化液：175mL骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基A液基础培养基，20mL胎牛血清，2mL Penicillin-Streptomycin，2mL Glutamine，400μL Insulin，200μL IBMX，200μL Rosiglitazone，200μLDexamethasone。

B液-维持液：175mL骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液基础培养基，20mL胎牛血清，2mL Penicillin-Streptomycin，2mLGlutamine，400μL Insulin。

培养步骤：

将骨髓间质干细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。当细胞融合度达到80％-90％时，用0.25％Trypsin-0.04％EDTA进行消化。将消化下来的间质干细胞按照2×10⁴cells/cm²的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2mL完全培养基。将细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。每隔三天换液，直到细胞融合度达到100％或者过融合。

小心地将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基A液。诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2mL骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液。24h后，吸走B液，换回A液进行诱导。

A液和B液交替作用3-5次后(12-20天)，继续用B液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大和圆。其中在B液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液。

成骨诱导分化

成骨诱导培养基：DMEM培养基配制，各成分浓度分别为10％FBS，100nM***，10mMβ-甘油磷酸钠，50μg/mL维生素C。

培养步骤：将骨髓间充质干细胞用胰酶消化计数，细胞悬液浓度稀释至50,000个/mL，吸取100μL细胞悬液到96孔板中。当细胞生长至约为70％，弃掉培养液并用PBS洗3次，加入成骨诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，每3天更换培养液。

成软骨、成骨和成脂检测

(1)成软骨检测：

A、基因检测，检测COL I,COL II,COL X,SOX 9,ACAN的基因表达情况。其中COLII,SOX9,ACAN是有利于成软骨的功能基因，COL 1,COLX是不利于成软骨的肥大基因。

B、组织学检测。4％多聚甲醛固定pellet小球，琼脂糖包埋后，进行脱水透明，石蜡包埋，切片后用阿利新蓝染细胞外基质，并同时采用HE染色法染细胞形态。

C、半定量检测-糖胺聚糖GAG定量法：用Proteinase K消化pellet小球56℃过夜，然后90℃加热10min，使用阳离子染色剂DMMB络合GAG半小时，使用解络液解络沉淀，在656nm波长处检测吸光值，计算细胞外基质GAG的含量。

(2)成骨诱导分化检测：

采用茜素红法：将茜素红pH调节至4.0-4.2，室温染色1h后，PBS孵育15min，弃去上清，PBS洗3遍，弃净上清，加入氯化十六烷基置室温下30min。吸取上清，使用紫外分光光度计.波长562nm处测样本吸光值，用氯化十六烷基溶液调零，并同时测定一组未加茜素红的单纯细胞的上清吸光值，每个样本重复3次，计算平均值及标准差。

(3)成脂诱导分化检测：进行油红O染色，1h，用PBS清洗两遍，再加入异丙醇进行萃取，在490nm处半定量检测。

干性基因和甲基化基因检测

试剂：购置于天根生化科技北京有限公司的TRNzol总RNA提取试剂(DP405)，FastQuant RT Kit(with gDNase)(KR106)及SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(FP205)；异丙醇、氯仿购于北京试剂厂。

操作步骤：

(1)提取RNA以及反转录：使用Tiangen公司的DP405提取RNA，随后使用Tiangen公司的KR106试剂盒按说明书进行反转录。

(2)Real-time PCR检测：利用Tiangen公司的FP205试剂盒进行荧光定量PCR。检测Oct4，CARM1，DNMT1，DNMT3A，DNMT3B，Mll1，Mll2，Nanog，PRMT5，Sox2等基因的表达水平。

DNA甲基化水平检测

试剂：MethylFlash Global DNAMethylation(5-mC)ELISAEasy Kit(p-1030)(Epigentek公司)

检测方法：根据试剂盒说明书，制作标准曲线，并检测样品的DNA甲基化程度。

实施例1电刺激的准备

在使用纳秒脉冲电场对细胞进行刺激时，最主要的参数为脉宽和场强，为了达到实验的目的并保证细胞的活性，需要将脉宽和场强控制在适宜的范围(J.C.Weaver等人,“Abrief overview of electroporation pulse strength–duration space:Aregionwhere additional intracellular effects are expected”,Bioelectrochemistry,87(2012)236–243；Tadej Kotnik等人,Electroporation-based applications inbiotechnology,Trends in Biotechnology,33(8),2015.8)。在本实施例中，通过电击杯对细胞进行电击(图1A-D)，通过将脉宽在1ns-300ns范围之间进行调整，场强则在1kV/cm-30kV/cm范围之间调整，将脉宽和场强进行组合进行电击点击结果表明，在上述范围内，并不会对细胞的存活带来明显的不利影响(图1E)，这也与目前本领域目前对纳秒脉冲电场脉宽和场强对细胞存活影响的理解相一致(J.C.Weaver等人,“Abrief overview ofelectroporation pulse strength–duration space:Aregion where additionalintracellular effects are expected”,Bioelectrochemistry,87(2012)236–243；TadejKotnik等人,Electroporation-based applications in biotechnology,Trends inBiotechnology,33(8),2015.8)。

后续的试验中，通过组合两种参数对细胞进行电刺激，试验中根据需要选择刺激的次数，次数范围在1-1000次之间，频率1-1000Hz之间，温度室温，或者具体选择在20-37℃范围内的适当温度。其中多种条件的组合均能产生程度不同的效果，对于猪骨髓间充质干细胞，效果较好的参数包括如下所示的三组(A、B和C组)为了表述的方便，后续实施例中使用到上述参数组合时，有时也会直接使用A组、B组或C组代替。

A组：脉宽10ns，场强20kV/cm；

B组：脉宽100ns，场强10kV/cm；

C组：脉宽60ns，场强5kV/cm。

刺激次数5次，频率1Hz，温度为室温；

对于人胚胎干细胞的刺激实验，也同样在前述1ns-300ns的脉宽范围之间，以及1kV/cm-30kV/cm的场强范围之间调整，通过不同的参数组合对细胞进行刺激，实施例4中则具体构建了六种组合，即：10ns+5kV/cm、10ns+10kV/cm、10ns+20kV/cm、100ns+5kV/cm、100ns+10kV/cm和100ns+20kV/cm，在这六种条件的刺激下，检查了目标基因的表达。

需要说明的是，上述具体的参数组合仅是部分优选的方案，在上述施加纳秒脉冲电场的条件范围内，实际上可以存在多种适宜的参数组合，而且针对不同种类的干细胞，其最合适的条件也并不相同，也需要根据不同的目标细胞设置具体的参数组合。但是本领域技术人员已经清楚的知晓纳秒脉冲所施加的条件范围，这也在本公开中得到了进一步的支持，因此可以理解的是，本领域技术人员基于本公开内容，有能力得到需要的参数组合。

实施例2纳秒脉冲电场刺激增强了间充质干细胞的干性

1、纳秒脉冲电场促进干性基因的提升

已知电信号刺激有可能促进干细胞分化(例如间充质干细胞)，其原因一般推测为电信号能够激活与细胞分化相关信号或通路，进而促进了干细胞向多种组织细胞分化的能力，但由于干细胞分化机制非常复杂，对外界刺激究竟如何增强干细胞的分化能力的原因仍然知之甚少。发明人出人意料的发现，经过纳秒脉冲电场刺激后(实验重复进行5次，在电刺激0.5h至2h后收集细胞)，检测这些细胞干性相关基因的表达，可以发现对维持干性非常重要的常见基因的表达量显著上升。如图2A-C所示，与未加电场的对照组相比，OCT4基因的表达量提高了将近3倍，NANOG和SOX2的表达量也显著提升。这意味着间充质干细胞在经过纳秒脉冲电场刺激后，细胞干性获得了提高。

已知DNA甲基化在细胞的干性维持和命运分化方面具有重要的作用，例如干性越强的细胞，DNA甲基化的水平通常也越高；而DNA甲基化的降低则伴随着细胞命运的分化，而甲基化基因的表达与细胞的甲基化状态具有密切关联。为了进一步了解经过纳秒脉冲电场刺激后的间充质干细胞的干性增强情况，接下来检测了细胞中甲基化相关基因的表达情况，结果表明：与细胞甲基化水平具有紧密关联的基因DNMT1的表达量及蛋白表达水平显著下降(图2D-H)。而DNMT3a和DNMT3b并不受影响，这说明电击对甲基化的影响是通过特异性的影响DNMT1的表达而实现的。

为了更直接的分析细胞DNA的甲基化状态，随后使用MethylFlash Global DNAMethylation(5-mC)ELISA Easy Kit检测了经过刺激后的细胞内整体DNA的甲基化水平，结果显示，纳秒脉冲电场降低DNA整体甲基化水平达40％-80％(图3)。

以上结果表明了，纳秒脉冲电场刺激能够提高干细胞的干性，也就是说，本发明在本领域中首次发现并证实了纳秒脉冲电场能够提高细胞干性。

实施例3经电击后的间充质干细胞向成软骨、成骨和成脂分化的能力显著提升

本实施例检测了经过纳秒脉冲电场刺激后的间充质干细胞分化能力的变化。首先，对于成软骨分化能力，在14天时进行了阿利新蓝染色，结果显示，经纳秒脉冲电场预处理后，再经软骨诱导培养后，细胞外基质分泌明显增加(图4A)。

随后，利用Dimethylmethylene Blue Assay(DMMB)对糖胺聚糖定量检测，发现GAG含量提高到1.5倍左右(图4B)；进一步检测了能够显著促进软骨功能的基因COL II、ACAC和SOX 9的表达情况，发现这两个基因的表达显著上升(图4C)，同时不显著影响COL I,COL X的表达(结果未显示)。这表明间充质干细胞成软骨分化能力获得了显著提升。

接下来，研究了纳秒脉冲电场对间充质干细胞进行刺激后，成骨分化能力的改变。经纳秒脉冲电场预处理后，再经成骨诱导培养，相比于仅使用诱导培养基，成骨诱导效率显著提升1.5倍左右，实验重复进行3次(n＝3)(图5)。

经纳秒脉冲电场预处理后，再经成脂诱导培养后(相比于仅使用诱导培养基)，成脂诱导效率显著提升，实验重复进行3次(n＝3)(图6)。

以上结果表明，经过纳秒脉冲电场刺激后的间充质干细胞干性的提高也直接带来了分化能力的增强。这也证实了纳秒脉冲电场刺激后的干细胞具有广阔的实际应用前景。

实施例4纳秒脉冲电场能够提高胚胎干细胞的干性

为了研究纳秒脉冲电场增强干性的效果对其它干细胞类型的影响，进一步对人胚胎干细胞使用不同的脉宽和场强组合进行了纳秒脉冲处理，具体构建了六种组合，即：10ns+5kV/cm、10ns+10kV/cm、10ns+20kV/cm、100ns+5kV/cm、100ns+10kV/cm和100ns+20kV/cm。结果显示，在脉宽100ns，场强10kV/cm的条件下，纳秒脉冲电场能够显著促进OCT4、NANOG的表达水平提高；脉宽10ns，场强5kV/cm的条件，也能够显著提高NANOG和SOX2基因的表达量(图7A-C)，以上结果表明所述胚胎干细胞的干性经过纳秒脉冲电场刺激后被有效增强。

实施例5借助导电膜实施电刺激能够更加有效的提高干细胞干性

目前使用电击杯施加纳秒脉冲电场的主要局限在于电击杯存在下列不利的限制：仅能单次作用而不能多个时间点连续作用、电场作用的细胞数有限、而且电击杯只能作用于悬浮的单细胞，不能是成团和粘附状态的细胞，因此在电击前需要消化细胞至悬浮影响，这有可能会影响到细胞的状态，以及不能作用于体内组织等。

于是发明人对施加电场的方式进行了改进，即使用导电膜(图8)替代电击杯。本实施例进一步比较了导电膜与电击杯对猪骨髓间充质细胞施加电场的效果。

使用100ns，10kV/cm参数的电脉冲分别刺激电击杯中的细胞悬液和导电膜上接种的猪骨髓间充质干细胞，检测干性基因Nanog和OCT 4的表达情况。结果发现，直接对导电膜上的接种细胞进行电击与电击杯对细胞悬液进行电击均能有效的提高干性基因的表达，而利用导电膜进行电击后的提高甚至更高，特别是Nanog基因表达量的提升更加显著(图9，其中**代表p<0.01极显著差异；*代表p<0.05，显著性差异)。除了电击效果的优势外，由于利用导电膜电击无需对细胞进行消化制备悬液，这一方面节省了操作的成本和时间，另一方面还最大程度保留了细胞的活力，细胞经过点击后，还可以进一步进行多种后续处理，如还可以将电击后附着于导电膜上的细胞进行短暂培养后继续电击等，极大提高了操作的灵活性。这也说明了导电膜来施加纳秒脉冲电场具有非常好的应用前景。