阅读说明：本技术 一种重组果胶甲酯酶PbrPME的体外表达方法及其编码基因与应用 (In-vitro expression method of recombinant pectin methylesterase PbrPME, coding gene and application thereof ) 是由 张绍铃 汤超 吴巨友 王鹏 朱晓璇 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组果胶甲酯酶PbrPME的体外表达方法及其编码基因与应用。通过设计引物克隆梨PbrPME基因；构建大肠杆菌重组表达载体PbrPME-pCold-TF；将构建的重组表达载体PbrPME-pCold-TF转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,构建表达梨PbrPME蛋白的重组菌株；对重组菌株进行表达,并用镍柱亲和层析法纯化重组梨PbrPME蛋白；利用重组梨PbrPME蛋白处理梨花粉管,统计处理后花粉管长度,验证重组梨PbrPME蛋白活性。通过本发明的方法,实现了梨PbrPME蛋白的体外表达及其应用,完全可以满足相关实验的需求。(The invention discloses an in vitro expression method of recombinant pectin methylesterase PbrPME, and a coding gene and application thereof. Cloning pear PbrPME gene by designing primer; constructing an escherichia coli recombinant expression vector PbrPME-pCold-TF; transforming the constructed recombinant expression vector PbrPME-pCold-TF into escherichia coli Rosetta (DE3) to construct a recombinant strain for expressing pear PbrPME protein; expressing the recombinant strain, and purifying the recombinant pear PbrPME protein by using a nickel column affinity chromatography; and (3) treating the pear pollen tube by using the recombinant pear PbrPME protein, counting the length of the treated pollen tube, and verifying the activity of the recombinant pear PbrPME protein. The method realizes the in vitro expression and the application of the pear PbrPME protein and can completely meet the requirements of related experiments.)

一种重组果胶甲酯酶PbrPME的体外表达方法及其编码基因与 应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种梨PbrPME蛋白的体外表达方法及其应用。

背景技术

高等植物细胞壁中都存在果胶，它存在并富集于细胞壁的初生壁与胞间层之间，与其他在初生壁中的纤维素、半纤维素、木质素及一些细胞壁延展蛋白交织在一起，共同形成了一个坚硬的结构。

果胶是花粉管细胞壁中的主要成分，是花粉管细胞壁中的基本多糖。果胶以高度甲酯化的形态被合成并分泌到细胞壁中，再经果胶甲酯酶(PME)去甲酯化，在这一过程中会产生氢离子及甲醇这两种代谢产物，而形成的去甲酯化果胶则会暴露出羧基基团。PME不仅参与花粉的萌发及花粉管的生长，同时也参与了果实的成熟及形成层的分化等过程。PME参与细胞壁结构改变的功能存在两个方面，一方面使果胶产生大量暴露的羧基基团，与细胞外大量的Ca²⁺结合，细胞壁变得坚硬，阻碍细胞的延展和生长；另一方面，去甲酯化反应的发生会使得细胞外的pH下降，多种如果胶裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性上升，引发细胞壁结构的松弛。

PME在梨等果蔬类产品的生产加工过程中也起着重要的作用。例如果蔬硬度主要受到果皮中果胶的影响，PME则可有效改善罐头果蔬和腌渍类蔬菜的脆度，提高其商品价值。因此，有关PME的研究具有理论价值和实践价值的双重意义。至今为止，国内外对于果胶甲酯酶进行了很多研究，其中面临的一个问题就是PbrPME的表达及提取。利用基因工程技术制备重组蛋白是一种具有广阔前景的技术手段。到目前为止，已有多种蛋白质表达系统，如原核表达系统、真核表达系统、无细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统是最常用的一种原核表达系统，相比传统从活体材料中提取蛋白的方法，该系统具有遗传背景和生化特性清楚、生长快、成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单和便于大规模生产等优点。长期以来，已有无数成功表达重组蛋白的案例。综上所述，利用基因工程技术制备重组PME是解决上述问题的一个有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种低成本、高产率、易纯化的梨PbrPME蛋白体外表达的制备方法及其应用。

本发明的目的可以采用以下技术方案来实现：

一种梨PbrPME蛋白体外表达的方法，包括以下步骤：

a.提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物PCR扩增梨PbrPME基因；

b.构建表达梨PbrPME蛋白的原核重组表达载体；

c.将步骤b构建的原核重组表达载体转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建PbrPME重组表达菌株；

d.培养步骤c所构建的PbrPME重组表达菌株至OD₆₀₀达到0.3-0.5，并低温处理后，加入诱导剂IPTG，诱导表达梨PbrPME蛋白；

e.纯化诱导表达的梨PbrPME蛋白。

f.利用重组PbrPME蛋白处理梨花粉管，观察重组PbrPME蛋白对花粉管的影响。

作为一种优选技术方案，步骤a中，用于PCR扩增梨PbrPME基因的正向引物为5’-

CCCTCGAGATGAAAAACAAAGGAGGAGGAG-3’，反向引物为5’-GCTCTAGAAACGGAAACCATGCCAGC-3’。

进一步优选的，步骤a中，PCR扩增梨PbrPME基因的PCR反应体系为：ddH₂O 31μl，上下游引物各2.5μl,cDNA 1μl,5×Phusion GC Buffer 10μl,10mM dNTPs 1μl,50mM MgCl₂solution 1μl,Phusion DNA Polymerase 1μl；PCR反应条件为：98℃预变性30min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

作为一种优选技术方案，步骤b中，构建表达梨PbrPME蛋白的原核重组表达载体时，所使用的原核表达载体为大肠杆菌表达载体pCold-TF，克隆梨PbrPME基因的***位点为Xho I和Xba I酶切位点之间。

进一步优选的，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，回收产物用XhoI和Xba I限制性内切酶双酶切后连接到经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pCold-TF的XhoI和Xba I位点上。

作为一种优选技术方案，步骤d中，所述的低温处理为置于冰上5-10min，然后10-15℃静置40-50min，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.3-0.5mmol/L，所述诱导表达的条件为15℃诱导22-24h。

进一步优选的，步骤d中诱导表达梨PbrPME蛋白的详细过程为：将构建的PbrPME重组表达菌株按照1:50的比例接种到100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200-250rpm震荡培养过夜，然后按1:50的比例转接到300ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200-250rpm震荡培养至菌液OD₆₀₀达到0.3-0.6，迅速置于冰上5-10min，然后15℃静置40-50min；然后加入终浓度为0.3-0.5mmol/L的诱导剂IPTG，15℃、200～250rpm震荡培养,诱导表达22-24h；

作为一种优选技术方案，步骤e中纯化诱导表达的梨PbrPME蛋白的详细过程为：诱导表达完成后，于4℃下12000rpm离心10min后弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入裂解液重悬沉淀；重悬后菌液使用超声破碎，功率240W，条件为：开启3s，停7s，共27min。超声破碎完成后，12000rpm离心10min，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨PbrPME蛋白进行纯化，使用镍柱亲和层析介质纯化蛋白前，需用10倍柱体积的平衡缓冲液来平衡层析介质；收集纯化蛋白，使用截流量为30kDa的超滤管在4℃下8000rpm转速下进行浓缩、脱盐,最后放入-80℃保存备用；

进一步优选的，步骤f中重组PbrPME蛋白处理梨花粉管的详细过程为：利用Nanodrop2000测定蛋白浓度，取5-8μg蛋白处理在200-400μl液体培养基中预培养1-2h的梨花粉管。处理1-2h后于光学显微镜下，取10-20μl梨花粉管样品观察花粉管长度，并使用Image-Pro Plus 6.0软件进行统计。

所述裂解液的配方为：150mM氯化钠，50mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸，0.1％十二烷基硫酸钠(w/v，g/100ml)，0.1％Triton X-100(v/v)，50×EDTA-freeprotease inhibitor cocktail III(德国默克密理博)，pH为7.3；

所述平衡缓冲液的配方为：500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH为7.3。

所述花粉液体培养基的配方为：0.55mM硝酸钙，1.60mM硼酸，1.60mM硫酸镁，1.00mM硝酸钾，440.00mM蔗糖和5.00mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸,4-吗啉乙磺酸，pH为6.0-6.2。

所述梨PbrPME蛋白体外表达的方法，所述梨PbrPME蛋白N端带有6个组氨酸标签(His-Tag)。

本发明梨PbrPME蛋白体外表达的方法的最优选技术方案包括以下步骤：

(1)梨PbrPME基因的序列分析及克隆

(1.1)一种梨PbrPME基因，其核苷酸序列为SEQ ID.1，氨基酸序列为SEQ ID.2。利用跨膜域分析网站TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析并去除跨膜域序列。

(1.2)按照植物总RNA提取试剂盒说明书提取砀山酥梨花粉RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA。

(1.3)引物设计及PCR反应：设计正向引物(PbrPME-pCold-Xho I-Lp)为5’-CCCTCGAGATGAAAAACAAAGGAGGAGGAG-3’(下划线为Xho I酶切位点，加粗部分为起始密码子)，反向引物(PbrPME-pCold-Xba I-Rp)为5’-GCTCTAGAAACGGAAACCATGCCAGC-3’(下划线为Xba I酶切位点)；PCR反应体系为：ddH₂O 31μl，上下游引物各2.5μl,cDNA 1μl,5×Phusion GC Buffer 10μl,10mM dNTPs 1μl,50mM MgCl₂ solution 1μl,Phusion DNAPolymerase 1μl；PCR反应条件为：98℃预变性30min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

(1.4)上述PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，如附图2可见，在2000bp左右有一清晰亮带，与预期大小符合。回收产物用Xho I和Xba I限制性内切酶双酶切后连接到经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pCold-TF的Xho I和Xba I位点上(参见TAKARA公司载体图谱)。

(1.5)构建好重组表达载体PbrPME-pCold-TF，酶切鉴定正确后，再经苏州金唯智生物科技有限公司DNA测序验证其正确性。

(2)表达菌株的构建

将验证正确的重组表达载体PbrPME-pCold-TF经化学法转化到大肠杆菌株Rosetta(DE3)中，在LB固体平板(含100μg/ml氨苄青霉素)上37℃培养，挑取单菌落到1mlLB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、250rpm震荡培养过夜，吸取1μl菌液做模板经PCR验证正确后，按700μl菌液加入300μl灭菌的50％(v/v)甘油，混匀后液氮速冻并于-80℃冰箱保存，保存的菌株即为重组表达菌株。

(3)梨PbrPME蛋白的诱导表达及纯化

(3.1)梨PbrPME蛋白的诱导表达

将步骤(2)中保存的PbrPME重组表达菌株按照1:50的比例接种到100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200-250rpm震荡培养过夜，然后按1:50的比例转接到300ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200-250rpm震荡培养至菌液OD₆₀₀达到0.3-0.6，迅速置于冰上5-10min，然后15℃静置40-50min；然后加入终浓度为0.3-0.5mmol/L的诱导剂IPTG，15℃、200-250rpm震荡培养,诱导表达22-24h。

(3.2)梨PbrPME蛋白的纯化

诱导表达完成后，于4℃下12000rpm离心10min后弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入裂解液(150mM氯化钠，50mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸，0.1％十二烷基硫酸钠(w/v)，0.1％Triton X-100(v/v)，50×EDTA-free protease inhibitor cocktailIII(德国默克密理博)，pH为7.3)重悬沉淀；重悬后菌液使用超声破碎，功率240W，条件为：开启3s，停7s，共27min。超声破碎完成后，12000rpm离心10min，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨PbrPME蛋白进行纯化，使用镍柱亲和层析介质纯化蛋白前，需用10倍柱体积的平衡缓冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH为7.3)来平衡层析介质；收集纯化蛋白，使用截流量为30kDa的超滤管在4℃下8000rpm转速下进行浓缩、脱盐。之后取50μl纯化后样品，加入50μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液，取10μl进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后确定梨PbrPME蛋白纯化条件，收集纯化蛋白，最后放入-80℃保存备用。

(4)梨PbrPME蛋白处理梨花粉管

纯化后的蛋白经浓缩、脱盐后，与Nanodrop2000仪器上测定蛋白浓度。梨花粉使用200-400μl花粉液体培养基(0.55mM硝酸钙，1.60mM硼酸，1.60mM硫酸镁，1.00mM硝酸钾，440.00mM蔗糖和5.00mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸,4-吗啉乙磺酸，pH为6.0-6.2)预培养1-2h。1-2h后加入总量为5-8μg的梨PbrPME蛋白处理1-2h，之后取10-20μl样品于光学显微镜下观察并利用Image-Pro Plus 6.0软件统计花粉管长度。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明所述的梨PbrPME重组蛋白体外表达方法，最适表达温度为15℃，充分保证了PbrPME重组蛋白的活性，且该方法低成本、高产率。本发明所纯化的梨PbrPME重组蛋白，条带单一、纯度高，不仅可以满足梨花粉相关实验的需求，还可以用于叶片原生质体提取等。

附图说明

图1是梨PbrPME基因序列跨膜域预测示图。

图2是PCR扩增梨PbrPME基因的琼脂糖凝胶电泳示图；

其中，1为DNA标准分子质量；2为PCR扩增产物。

图3是重组梨PbrPME蛋白的诱导表达及纯化后SDS-PAGE示图；

其中，M为蛋白质标准分子量；1为不含IPTG诱导菌体总蛋白；2为0.5mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；3为纯化后的重组梨PbrPME蛋白。

图4是重组PbrPME蛋白处理梨花粉管示图；

其中，-PbrPME为不加入重组梨PbrPME蛋白对照；+PbrPME为加入重组梨PbrPME蛋白处理组。

图5是重组PbrPME蛋白处理梨花粉管后花粉管长度统计示图；

其中，横坐标为对应处理；纵坐标为花粉管长度；-PbrPME为不加入重组梨PbrPME蛋白对照；+PbrPME为加入重组梨PbrPME蛋白处理组。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1：PbrPME-pCold-TF重组质粒的构建与鉴定

取新鲜砀山酥梨梨花粉，植物总RNA提取试剂盒提取花柱总RNA，用反转录试剂盒反转录得到总cDNA；如图1所示，分析并去除梨PbrPME基因的跨膜域序列，设计引物，以cDNA为模板进行PCR扩增。

设计正向引物(PbrPME-pCold-Xho I-Lp)为5’-CCCTCGAGATGAAAAACAAAGGAGGAGGAG-3’(下划线为Xho I酶切位点，加粗部分为起始密码子)，反向引物(PbrPME-pCold-Xba I-Rp)为5’-GCTCTAGAAACGGAAACCATGCCAGC-3’(下划线为Xba I酶切位点)；

PCR反应体系(总反应体系50μl)为：ddH₂O 31μl，上下游引物各2.5μl,cDNA 1μl,5×Phusion GC Buffer 10μl,10mM dNTPs 1μl,50mM MgCl₂ solution 1μl,Phusion DNAPolymerase 1μl。

PCR反应条件为：98℃预变性30min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。由图2可见，在2000bp左右有一清晰的亮带，与预期大小吻合。

PCR产物参考康为世纪公司Gel extraction kit快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行回收。回收后的PCR产物经Xho I和Xba I双酶切后通过T4-DNA连接酶***到经同样双酶切的pCold-TF表达载体中，4℃连接18h，构建PbrPME-pCold-TF重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α，在LB固体平板(含100μg/ml氨苄青霉素)上于37℃培养，挑选单菌落经酶切鉴定正确后，再通过苏州金唯智生物科技有限公司DNA测序验证其序列正确性。测序结果表明，所获得的梨PbrPME基因编码区序列与预计相符。说明重组质粒构建成功并将其命名为PbrPME-pCold-TF。梨PbrPME基因编码区序列与pCold-TF连接克隆测序结果为SEQ ID.3，其氨基酸序列为SEQ ID.4。

实施例2：梨PbrPME在大肠杆菌中的表达

1.获得表达梨PbrPME的重组表达菌株

挑测序成功的菌接种到4ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜，按照康为世纪公司的QuickPure Plasmid Mini kit快速质粒小提取试剂盒将PbrPME-pCold-TF重组表达载体提取出来，取1ng重组表达载体PbrPME-pCold-TF化学法转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子，培养温度为37℃，250rpm振荡培养培养过夜，获得重组子为表达梨PbrPME的基因工程菌，随机选取1个单菌落进行划线培养，取少量长出的划线培养菌接种于1ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜，然后按700μl菌液加入300μl灭菌50％(v/v)甘油，混匀后用液氮速冻贮存于﹣80℃冰箱，得到表达梨PbrPME重组表达菌株。

2.梨PbrPME重组蛋白的表达

将上述得到的梨PbrPME重组表达菌株按1:50的体积比接种到100ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃、250rpm振荡培养过夜，活化重组表达菌株。将活化的重组表达菌株再按1:50的体积比转至300ml LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，培养条件为37℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时后取5ml菌液作为阴性对照，其余菌液迅速置于冰上10min，然后放入15℃摇床中静置40min，最后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，15℃、240rpm震荡培养，诱导表达24h。表达完成后取5ml菌液离心，收集菌体沉淀，沉淀与阴性对照各加入200μl 10％SDS(w/v，g/100ml)，混匀后100℃沸水水浴10min，置于冰中冷却2min，之后于4℃下12000rpm离心10min，各取上清50μl，加入50μl 2×蛋白上样缓冲液后取10μl进行12％常规SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色后检测重组蛋白表达情况，结果如图3第1、2条泳道显示。

实施例3：重组梨PbrPME蛋白的分离纯化及鉴定

将梨PbrPME重组表达菌株按1:50接种100ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃、250rpm振荡培养过夜，活化重组表达菌株。将活化的重组表达菌株再按1:50转至300ml LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，培养条件为37℃，200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6后，迅速置于冰上10min，然后放入15℃摇床中静置40min，最后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，15℃、240rpm震荡培养诱导表达24h。表达完成后4℃、12000rpm离心10min后弃上清，收集菌体沉淀，用裂解液(150mM氯化钠，50mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸，0.1％十二烷基硫酸钠(w/v)，0.1％Triton X-100(v/v)，50×EDTA-freeprotease inhibitor cocktail III(德国默克密理博)，pH为7.3)重悬菌体后超声波破碎，功率240W，条件为：开启3s，停7s，共27min，破碎至溶液澄清。超声破碎完成后，于4℃下12000rpm离心10min，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤去除杂质。利用德国默克密理博公司的Ni-NTA琼脂糖亲和层析填料纯化梨PbrPME重组蛋白，具体操作为：10倍柱体积的平衡缓冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH 7.3)平衡柱子，控制流速为1ml/min；经滤膜过滤后的20ml蛋白上清样经过纯化柱，控制流速为1ml/min；20倍柱体积含30mM咪唑的清洗液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，30mM咪唑，pH 7.3)冲洗柱子，控制流速为1ml/min；10倍柱体积含80mM咪唑的洗脱冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，80mM咪唑，pH 7.3)洗脱纯化柱，控制流速为1ml/min，收集洗脱液得纯化蛋白，使用超滤管(截流量为30kDa)于4℃下8000rpm进行浓缩、脱盐，最后﹣80℃保存。取少量蛋白进行SDS-PAGE电泳纯度分析和Western Blotting鉴定，结果如图3第3条泳道所示。

实施例4：重组梨PbrPME蛋白的活性检测

于Nanodrop2000仪器上测定重组梨PbrPME蛋白浓度。梨花粉使用200μl花粉液体培养基(0.55mM硝酸钙，1.60mM硼酸，1.60mM硫酸镁，1.00mM硝酸钾，440.00mM蔗糖和5.00mM2-(N-吗啉基)乙磺酸,4-吗啉乙磺酸，pH为6.0-6.2)预培养2h。2h后加入总量为5μg的梨PbrPME蛋白处理1h，之后取10μl样品于光学显微镜下观察并利用Image-Pro Plus 6.0软件统计花粉管长度，结果如图4和图5所示。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种重组果胶甲酯酶PbrPME的体外表达方法及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1737

<212> DNA

<213> 梨(Pyrus spp)

<400> 1

atgaacgctg aacataataa gaagaagaag ttcgccatca tcggcgtttc atctgtgatt 60

ctagtagcca tggtggttgc cgtaacggtt ggggtaaccg caaaaaacaa aggaggagga 120

gggcacaaaa actcggacgg cgggcatgtc accacgtcga caaaagcaat aaaggctata 180

tgccagccga cggattataa ggaaacctgc gagaggagtc tggaatcggc tgctggcaac 240

agcacggagc cgaaggacct catcaaggca ggtttcaacg ttaccatgga caaacttcgg 300

gccatcataa aaaactccac cacattgcaa gaactggcca aggacgaaag tacaaaccaa 360

gctctagaaa attgcaagga gctcttggag tatgccatcg acgatatcac gacatctttc 420

caaaaattgg gtcctttcga catcagcaag atcgacgatt acgcggaaga tctcaaggtc 480

tggctcagcg cggctattac ttaccaacaa acatgcttgg acgggtttca gaacaccaaa 540

ggtgacgcag gcgaaaagat gaagcatttc ttgaacacca cgcaacagct caccagcaac 600

ggacttgcca tggtgaccga aattacgtcc gttcttgggt ctctgaattt gaaagcaaac 660

cggcgtcgtt tgctggcagg gggagggggt ggaagtaatg cgaagaatgc tccaaaggtt 720

attcctacgt ggatcaacaa taagcgtagc ctcgacgtgt ctaccgtgac tccacagtcg 780

attaaaccag acgcggtggt ggctaaggat gggagcggac agtacgagac tattggtgaa 840

gctgtgaaga tgatcccgaa gaacaatgcg gacaagacgt ttgtgattta tgtgaaggag 900

ggagtgtaca gtgagtatgt catgattgac aagtatatga ccaacgtcat gttgattggg 960

gatggcgcta ctaagaccaa ggtcaccggt agcaaaaact tcgctgcggg agtccaaact 1020

tttcagactg caacagttgt tgtagttggg gactacttca ttgctaagga catagggatt 1080

gagaactcag caggagccga agggcaccaa gccgtggctc tgcgagtgca gtcggacttg 1140

tccatcttct accgctgcca aatggacggg taccaagaca ctctctacac tcaaacccac 1200

cggcaattct accgcgactg caccatcagc ggcacaatcg actttatctt tggtgacgct 1260

gccgtagtgt tccagaactg caagatgatc gtaagaaaac caatggacaa ccaagcttgt 1320

atggtcacag cccaagggag aattgaccgg cgtcagccct cgggtatcat cctccaaaac 1380

tgcaccatct ccggggaccc ggagtacatt cccgtgaagg acaagaacaa gtcgtacctg 1440

gggaggccgt ggaagaacct cgctaggacc gtcgttatgc agtcgcagat tgatggcatc 1500

attgctccgg aagggtggat ggagtggacg ggttcgaaca atcatcaaag ttgctggttt 1560

ggcgaataca gaaacagagg gcctggctcc gacatgagca agagggtgaa gtggagcggt 1620

atcaagaatc ttggtgccga ccaggctgtc gctttcacct ccggtaaatt tgttgagggt 1680

gataagtgga tcaagcccag cggtgtgcct tacgttgctg gcatggtttc cgtttag 1737

<210> 2

<211> 578

<212> PRT

<213> 梨(Pyrus spp)

<400> 2

Met Asn Ala Glu His Asn Lys Lys Lys Lys Phe Ala Ile Ile Gly Val

1 5 10 15

Ser Ser Val Ile Leu Val Ala Met Val Val Ala Val Thr Val Gly Val

20 25 30

Thr Ala Lys Asn Lys Gly Gly Gly Gly His Lys Asn Ser Asp Gly Gly

35 40 45

His Val Thr Thr Ser Thr Lys Ala Ile Lys Ala Ile Cys Gln Pro Thr

50 55 60

Asp Tyr Lys Glu Thr Cys Glu Arg Ser Leu Glu Ser Ala Ala Gly Asn

65 70 75 80

Ser Thr Glu Pro Lys Asp Leu Ile Lys Ala Gly Phe Asn Val Thr Met

85 90 95

Asp Lys Leu Arg Ala Ile Ile Lys Asn Ser Thr Thr Leu Gln Glu Leu

100 105 110

Ala Lys Asp Glu Ser Thr Asn Gln Ala Leu Glu Asn Cys Lys Glu Leu

115 120 125

Leu Glu Tyr Ala Ile Asp Asp Ile Thr Thr Ser Phe Gln Lys Leu Gly

130 135 140

Pro Phe Asp Ile Ser Lys Ile Asp Asp Tyr Ala Glu Asp Leu Lys Val

145 150 155 160

Trp Leu Ser Ala Ala Ile Thr Tyr Gln Gln Thr Cys Leu Asp Gly Phe

165 170 175

Gln Asn Thr Lys Gly Asp Ala Gly Glu Lys Met Lys His Phe Leu Asn

180 185 190

Thr Thr Gln Gln Leu Thr Ser Asn Gly Leu Ala Met Val Thr Glu Ile

195 200 205

Thr Ser Val Leu Gly Ser Leu Asn Leu Lys Ala Asn Arg Arg Arg Leu

210 215 220

Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ala Lys Asn Ala Pro Lys Val

225 230 235 240

Ile Pro Thr Trp Ile Asn Asn Lys Arg Ser Leu Asp Val Ser Thr Val

245 250 255

Thr Pro Gln Ser Ile Lys Pro Asp Ala Val Val Ala Lys Asp Gly Ser

260 265 270

Gly Gln Tyr Glu Thr Ile Gly Glu Ala Val Lys Met Ile Pro Lys Asn

275 280 285

Asn Ala Asp Lys Thr Phe Val Ile Tyr Val Lys Glu Gly Val Tyr Ser

290 295 300

Glu Tyr Val Met Ile Asp Lys Tyr Met Thr Asn Val Met Leu Ile Gly

305 310 315 320

Asp Gly Ala Thr Lys Thr Lys Val Thr Gly Ser Lys Asn Phe Ala Ala

325 330 335

Gly Val Gln Thr Phe Gln Thr Ala Thr Val Val Val Val Gly Asp Tyr

340 345 350

Phe Ile Ala Lys Asp Ile Gly Ile Glu Asn Ser Ala Gly Ala Glu Gly

355 360 365

His Gln Ala Val Ala Leu Arg Val Gln Ser Asp Leu Ser Ile Phe Tyr

370 375 380

Arg Cys Gln Met Asp Gly Tyr Gln Asp Thr Leu Tyr Thr Gln Thr His

385 390 395 400

Arg Gln Phe Tyr Arg Asp Cys Thr Ile Ser Gly Thr Ile Asp Phe Ile

405 410 415

Phe Gly Asp Ala Ala Val Val Phe Gln Asn Cys Lys Met Ile Val Arg

420 425 430

Lys Pro Met Asp Asn Gln Ala Cys Met Val Thr Ala Gln Gly Arg Ile

435 440 445

Asp Arg Arg Gln Pro Ser Gly Ile Ile Leu Gln Asn Cys Thr Ile Ser

450 455 460

Gly Asp Pro Glu Tyr Ile Pro Val Lys Asp Lys Asn Lys Ser Tyr Leu

465 470 475 480

Gly Arg Pro Trp Lys Asn Leu Ala Arg Thr Val Val Met Gln Ser Gln

485 490 495

Ile Asp Gly Ile Ile Ala Pro Glu Gly Trp Met Glu Trp Thr Gly Ser

500 505 510

Asn Asn His Gln Ser Cys Trp Phe Gly Glu Tyr Arg Asn Arg Gly Pro

515 520 525

Gly Ser Asp Met Ser Lys Arg Val Lys Trp Ser Gly Ile Lys Asn Leu

530 535 540

Gly Ala Asp Gln Ala Val Ala Phe Thr Ser Gly Lys Phe Val Glu Gly

545 550 555 560

Asp Lys Trp Ile Lys Pro Ser Gly Val Pro Tyr Val Ala Gly Met Val

565 570 575

Ser Val

<210> 3

<211> 1635

<212> DNA

<213> 梨(Pyrus spp)

<400> 3

atgaaaaaca aaggaggagg agggcacaaa aactcggacg gcgggcatgt caccacgtcg 60

acaaaagcaa taaaggctat atgccagccg acggattata aggaaacctg cgagaggagt 120

ctggaatcgg ctgctggcaa cagcacggag ccgaaggacc tcatcaaggc aggtttcaac 180

gttaccatgg acaaacttcg ggccatcata aaaaactcca ccacattgca agaactggcc 240

aaggacgaaa gtacaaacca agctctagaa aattgcaagg agctcttgga gtatgccatc 300

gacgatatca cgacatcttt ccaaaaattg ggtcctttcg acatcagcaa gatcgacgat 360

tacgcggaag atctcaaggt ctggctcagc gcggctatta cttaccaaca aacatgcttg 420

gacgggtttc agaacaccaa aggtgacgca ggcgaaaaga tgaagcattt cttgaacacc 480

acgcaacagc tcaccagcaa cggacttgcc atggtgaccg aaattacgtc cgttcttggg 540

tctctgaatt tgaaagcaaa ccggcgtcgt ttgctggcag ggggaggggg tggaagtaat 600

gcgaagaatg ctccaaaggt tattcctacg tggatcaaca ataagcgtag cctcgacgtg 660

tctaccgtga ctccacagtc gattaaacca gacgcggtgg tggctaagga tgggagcgga 720

cagtacgaga ctattggtga agctgtgaag atgatcccga agaacaatgc ggacaagacg 780

tttgtgattt atgtgaagga gggagtgtac agtgagtatg tcatgattga caagtatatg 840

accaacgtca tgttgattgg ggatggcgct actaagacca aggtcaccgg tagcaaaaac 900

ttcgctgcgg gagtccaaac ttttcagact gcaacagttg ttgtagttgg ggactacttc 960

attgctaagg acatagggat tgagaactca gcaggagccg aagggcacca agccgtggct 1020

ctgcgagtgc agtcggactt gtccatcttc taccgctgcc aaatggacgg gtaccaagac 1080

actctctaca ctcaaaccca ccggcaattc taccgcgact gcaccatcag cggcacaatc 1140

gactttatct ttggtgacgc tgccgtagtg ttccagaact gcaagatgat cgtaagaaaa 1200

ccaatggaca accaagcttg tatggtcaca gcccaaggga gaattgaccg gcgtcagccc 1260

tcgggtatca tcctccaaaa ctgcaccatc tccggggacc cggagtacat tcccgtgaag 1320

gacaagaaca agtcgtacct ggggaggccg tggaagaacc tcgctaggac cgtcgttatg 1380

cagtcgcaga ttgatggcat cattgctccg gaagggtgga tggagtggac gggttcgaac 1440

aatcatcaaa gttgctggtt tggcgaatac agaaacagag ggcctggctc cgacatgagc 1500

aagagggtga agtggagcgg tatcaagaat cttggtgccg accaggctgt cgctttcacc 1560

tccggtaaat ttgttgaggg tgataagtgg atcaagccca gcggtgtgcc ttacgttgct 1620

ggcatggttt ccgtt 1635

<210> 4

<211> 545

<212> PRT

<213> 梨(Pyrus spp)

<400> 4

Met Lys Asn Lys Gly Gly Gly Gly His Lys Asn Ser Asp Gly Gly His

1 5 10 15

Val Thr Thr Ser Thr Lys Ala Ile Lys Ala Ile Cys Gln Pro Thr Asp

20 25 30

Tyr Lys Glu Thr Cys Glu Arg Ser Leu Glu Ser Ala Ala Gly Asn Ser

35 40 45

Thr Glu Pro Lys Asp Leu Ile Lys Ala Gly Phe Asn Val Thr Met Asp

50 55 60

Lys Leu Arg Ala Ile Ile Lys Asn Ser Thr Thr Leu Gln Glu Leu Ala

65 70 75 80

Lys Asp Glu Ser Thr Asn Gln Ala Leu Glu Asn Cys Lys Glu Leu Leu

85 90 95

Glu Tyr Ala Ile Asp Asp Ile Thr Thr Ser Phe Gln Lys Leu Gly Pro

100 105 110

Phe Asp Ile Ser Lys Ile Asp Asp Tyr Ala Glu Asp Leu Lys Val Trp

115 120 125

Leu Ser Ala Ala Ile Thr Tyr Gln Gln Thr Cys Leu Asp Gly Phe Gln

130 135 140

Asn Thr Lys Gly Asp Ala Gly Glu Lys Met Lys His Phe Leu Asn Thr

145 150 155 160

Thr Gln Gln Leu Thr Ser Asn Gly Leu Ala Met Val Thr Glu Ile Thr

165 170 175

Ser Val Leu Gly Ser Leu Asn Leu Lys Ala Asn Arg Arg Arg Leu Leu

180 185 190

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ala Lys Asn Ala Pro Lys Val Ile

195 200 205

Pro Thr Trp Ile Asn Asn Lys Arg Ser Leu Asp Val Ser Thr Val Thr

210 215 220

Pro Gln Ser Ile Lys Pro Asp Ala Val Val Ala Lys Asp Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gln Tyr Glu Thr Ile Gly Glu Ala Val Lys Met Ile Pro Lys Asn Asn

245 250 255

Ala Asp Lys Thr Phe Val Ile Tyr Val Lys Glu Gly Val Tyr Ser Glu

260 265 270

Tyr Val Met Ile Asp Lys Tyr Met Thr Asn Val Met Leu Ile Gly Asp

275 280 285

Gly Ala Thr Lys Thr Lys Val Thr Gly Ser Lys Asn Phe Ala Ala Gly

290 295 300

Val Gln Thr Phe Gln Thr Ala Thr Val Val Val Val Gly Asp Tyr Phe

305 310 315 320

Ile Ala Lys Asp Ile Gly Ile Glu Asn Ser Ala Gly Ala Glu Gly His

325 330 335

Gln Ala Val Ala Leu Arg Val Gln Ser Asp Leu Ser Ile Phe Tyr Arg

340 345 350

Cys Gln Met Asp Gly Tyr Gln Asp Thr Leu Tyr Thr Gln Thr His Arg

355 360 365

Gln Phe Tyr Arg Asp Cys Thr Ile Ser Gly Thr Ile Asp Phe Ile Phe

370 375 380

Gly Asp Ala Ala Val Val Phe Gln Asn Cys Lys Met Ile Val Arg Lys

385 390 395 400

Pro Met Asp Asn Gln Ala Cys Met Val Thr Ala Gln Gly Arg Ile Asp

405 410 415

Arg Arg Gln Pro Ser Gly Ile Ile Leu Gln Asn Cys Thr Ile Ser Gly

420 425 430

Asp Pro Glu Tyr Ile Pro Val Lys Asp Lys Asn Lys Ser Tyr Leu Gly

435 440 445

Arg Pro Trp Lys Asn Leu Ala Arg Thr Val Val Met Gln Ser Gln Ile

450 455 460

Asp Gly Ile Ile Ala Pro Glu Gly Trp Met Glu Trp Thr Gly Ser Asn

465 470 475 480

Asn His Gln Ser Cys Trp Phe Gly Glu Tyr Arg Asn Arg Gly Pro Gly

485 490 495

Ser Asp Met Ser Lys Arg Val Lys Trp Ser Gly Ile Lys Asn Leu Gly

500 505 510

Ala Asp Gln Ala Val Ala Phe Thr Ser Gly Lys Phe Val Glu Gly Asp

515 520 525

Lys Trp Ile Lys Pro Ser Gly Val Pro Tyr Val Ala Gly Met Val Ser

530 535 540

Val

545