阅读说明：本技术 一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法 (Preparation method of low-sensitization fishy smell-removed antarctic ice algae oligosaccharide ) 是由 于建伟 赵乐荣 陶宇 牟维林 邹鹏飞 隋海松 毕利顺 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法,按制备顺序依次包括粗寡糖制备、超滤、闪蒸、膜分级；所述的膜分级为使用半透膜装置将闪蒸获得的浓缩寡糖液分离成多个分子量不同的组分,分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量,将过敏原含量最高的组分与分子量最小的组分抛弃,并将其他组分收集合并。本发明通过多层定向透析技术有效脱除南极冰藻寡糖中的致敏物质,同时采用超滤闪蒸串联的一步浓缩法,获得的南极冰藻寡糖,具有低致敏性、无腥味等特点。本发明制造过程效率高,易于产业化,寡糖活性高,功效明显,同时脱敏脱腥,拓展了冰藻寡糖的应用范围,使其可广泛应用于营养品、护肤品、药品等领域。(The invention relates to a preparation method of low-sensitization fishy smell-removed antarctic ice algae oligosaccharide, which sequentially comprises the steps of crude oligosaccharide preparation, ultrafiltration, flash evaporation and membrane classification according to the preparation sequence; the membrane fractionation is to separate the concentrated oligose liquid obtained by flash evaporation into a plurality of components with different molecular weights by using a semi-permeable membrane device, detect the allergen content of each component except the component with the minimum molecular weight, discard the component with the highest allergen content and the component with the minimum molecular weight, and collect and combine other components. The invention effectively removes the sensitizing substances in the Antarctic ice algae oligosaccharide by a multilayer directional dialysis technology, and simultaneously adopts a one-step concentration method of ultrafiltration flash evaporation series connection to obtain the Antarctic ice algae oligosaccharide which has the characteristics of low sensitization, no fishy smell and the like. The invention has high efficiency of the manufacturing process, easy industrialization, high oligosaccharide activity and obvious effect, simultaneously desensitizes and removes fishy smell, expands the application range of the ice algae oligosaccharide and can be widely applied to the fields of nourishment, skin care products, medicines and the like.)

一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法

技术领域

本发明具体涉及一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法。

背景技术

南极冰藻主要指在南极极端环境海冰中生长的大类微型藻类。合理的开发南极的低温藻类资源，不仅可以从应用上丰富我国现有的微生物资源，从中开发出有价值的生理活性物质和产品，更可为基础研究提供新型研究材料和新思路。目前得到开发的南极冰藻包含两类，海茸(Durvillaea antarctica)和紫晶藻(Utricularia amethystina)。海茸是一种深海褐藻；紫晶藻通常固著于海底或某种固体结构上，是基础细胞所构成的单株或一长串的简单植物。两种藻类都全年生长在平均水温不超过5℃的南极圈未经污染的海域中。极端的生长条件赋予其纯净、丰富的营养物质，富含岩藻糖、葡聚糖、海藻胶等多种功能性多糖，具有显著的免疫调节、抗氧化、降血糖等生物学活性，在化妆品、营养食品、药品领域应用潜力巨大。

然而，南极冰藻寡糖制备过程中产生过敏物质；制备中添加的助剂也容易引入过敏物质，一般会出现瘙痒、皮疹、红肿等症状。南极冰藻多糖中的过敏物质为多种，体系复杂，难以通过普通纯化方法脱除。此外，海洋生物所特有的腥味也影响其应用。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种低致敏性脱腥南极磷虾肽的制备与纯化方法，工艺简单易操作，成本低，脱敏效率高。

具体技术方案如下：

一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法，按制备顺序依次包括粗寡糖制备、超滤、闪蒸、膜分级；

所述的粗寡糖制备即以南极冰藻多糖为原料，将其裂解为寡糖。

所述膜分级为使用半透膜装置将闪蒸获得的浓缩寡糖液分离成多个分子量不同的组分，分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，将过敏原含量最高的组分与分子量最小的区间组分抛弃，并将其他组分收集。收集得的组分可分别利用，也可合并。

所述将闪蒸获得的浓缩寡糖液分离成多个分子量不同的组分，即利用半透膜将提取液分成多个分子量区间。

所述的南极冰藻，优选为海茸(Durvillaea antarctica)和紫晶藻(Utriculariaamethystina)。

发明人意外地发现，过敏物质在冰藻寡糖产物中存在一定程度的分子量聚集情况。

此外，小分子组分中过敏物质也较多，将此部分剔除，还具备脱盐和脱除其他小分子杂质的作用。

冰藻寡糖提取液中的致敏成分即过敏原主要为小分子蛋白、小分子极性物质等成分，检测方法为噻唑蓝法，简称MTT法，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的甲臜(Formazan)结晶并沉积在细胞中，结晶物能被酸性异丙醇溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，通过MTT细胞活性检测方法即可进行受试物ET50检测。

优选的，使用半透膜装置将浓缩寡糖提取液分离成3～5个分子量不同的组分。

组分的数量是综合考虑脱敏效果、得率和工艺成本获得的。

进一步优选，使用4个半透膜装置将浓缩寡糖液分离成5个分子量不同的组分，4个半透膜装置的截留分子量分别为700～1600Da，500～1200Da，300～800Da，100～500Da。

优选的，所述半透膜装置为透析袋。

可选用不同截留分子量的透析袋按照其截留分子量从大到小依次透析。具体为用截留分子量最大的透析袋对寡糖液进行透析，保留袋内液体，将透析流出物(即剩余液体)使用次一级截留分子量的透析袋进行透析，依次类推。

进一步优选，所述半透膜装置包括按截留分子量从大到小的多个依次从内到外套接的透析袋。

所述透析袋优选为4个，其截留分子量从内到外依次为700～1600Da，500～1200Da，300～800Da，100～500Da；透析温度为4～15℃，透析时间为12～48h。

其中，最优选为截留分子量从内到外依次为800Da，550Da，350Da，150Da。

使用按截留分子量从大到小的多个依次从内到外套接的透析袋，可同时获得多个分子量的组分，达到多层定向透析，简化生产工艺。

本发明还设计了一种多层定向透析装置，包括透析容器和置于容器中的多个按截留分子量从大到小的多个依次从内到外套接的透析袋，所述透析袋的截面直径从内到外依次增大。所述的多层定向透析装置还可包括多个与透析袋形状、尺寸相应的套筒骨架，透析袋粘附于套筒骨架上，以固定透析袋的形状。使用该装置时，将超滤获得的浓缩酶解液倒入最内层的透析袋，容器中倒入适量的水或缓冲液，由于各个透析袋之间的连续截留分子量差值，将浓缩酶解液分隔成多个分子量不同的组分。

优选的，所述的粗寡糖制备，为以冰藻多糖为原料，采用过氧化氢法制备冰藻寡糖，其具体工作条件为：南极冰藻多糖占反应体系0.1～3wt％，过氧化氢添加量占反应体系0.1～5.0wt％，余量为水，反应时间30～180mi n，反应结束后离心，收集清液，获得粗寡糖液。

使用过氧化氢裂解法对冰藻寡糖进行制备，能获得更显著的过敏物质分子量集中度。

优选的，所述的超滤，其具体工作条件为：将粗寡糖制备后获得的粗寡糖液通入超滤装置，膜孔径为5～1000nm。

优选使用高通量超滤装置，通量优选为50～100L/h，操作压力差为50～500kPa。

优选的，所述的闪蒸，其具体工作条件为：将超滤获得的寡糖液在100～200℃条件下闪蒸10～100s。

超滤装置可与超高温闪蒸装置串联，提高工作效率。采用超滤闪蒸串联的一步浓缩法，提高浓缩效率的同时可实现冰藻寡糖液的有效脱腥。

本发明的有益效果如下：

本发明通过多层定向透析技术有效脱除南极冰藻寡糖中的致敏物质，同时采用超滤闪蒸串联的一步浓缩法，获得的南极冰藻寡糖，具有低致敏性、无腥味等特点。本发明制造过程效率高，易于产业化，寡糖活性高，功效明显，同时脱敏脱腥，拓展了冰藻寡糖的应用范围，使其可广泛应用于营养品、护肤品、药品等领域。

附图说明

图1为本发明中多层定向透析装置的示意图；

图中：1、透析容器；2、透析袋。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本实施例中南极冰藻多糖是以采集自南极的海茸或紫晶藻通过碱提法制备获得。

实施例1

一种多层定向透析装置，如图1所示，包括向上开口的透析容器1和四个置于容器中的、按截留分子量从大到小的多个依次从内到外套接的透析袋2，所述透析袋2的截面直径从内到外依次增大。

一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法，步骤如下：

(1)寡糖制备：为采用过氧化氢法制备海茸寡糖，其具体工作条件为：将海茸多糖溶于水中，添加过氧化氢进行裂解；海茸多糖占反应体系1wt％，过氧化氢添加量占反应体系2wt％，余量为水，反应时间100mi n，反应结束后离心，收集清液，获得粗寡糖液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗寡糖液通入100L/h的大通量超滤装置，膜孔径为20nm，操作压力差为150kPa；超滤后的寡糖液进行闪蒸，闪蒸温度140℃，闪蒸时间70s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为800Da，550Da，350Da，150Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为8℃，透析时间为24h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为800Da以上、550～800Da、350～550Da、150～350Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为0.6、1.0、1.51、0.8。将吸光值最大的组分即350～550Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥冰藻寡糖。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

实施例2

一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法，步骤如下：

(1)寡糖提取：为采用过氧化氢法制备海茸寡糖，其具体工作条件为：将南极海茸多糖溶于水中，添加过氧化氢进行裂解；海茸多糖占反应体系0.1wt％，过氧化氢添加量占反应体系0.1wt％，余量为水，反应时间180mi n，反应结束后离心，收集清液，获得粗寡糖液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗寡糖液通入100L/h的大通量超滤装置，膜孔径为1000nm，操作压力差为50kPa；超滤后的寡糖液进行闪蒸，闪蒸温度100℃，闪蒸时间100s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：使用实施例1中的多层定向透析装置；多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为1600Da，1200Da，800Da，500Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为4℃，透析时间为48h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为1600Da以上、1200～1600Da、800～1200Da、500～800Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为0.84、0.9、1.62、1.11。将吸光值最大的组分即800～1200Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥冰藻寡糖。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

实施例3

一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法，步骤如下：

(1)寡糖提取：为采用过氧化氢法制备海茸寡糖，其具体工作条件为：将南极海茸多糖溶于水中，添加过氧化氢进行裂解；海茸多糖占反应体系3wt％，过氧化氢添加量占反应体系5wt％，余量为水，反应时间30mi n，反应结束后离心，收集清液，获得粗寡糖液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗寡糖液通入100L/h的大通量超滤装置，膜孔径为5nm，操作压力差为500kPa；超滤后的寡糖液进行闪蒸，闪蒸温度200℃，闪蒸时间10s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：使用实施例1中的多层定向透析装置；多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为700Da，500Da，300Da，100Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为15℃，透析时间为12h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为700Da以上、500～700Da、300～500Da、100～300Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为0.75、1.75、1.0、0.9。将吸光值最大的组分即500～700Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥冰藻寡糖。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

实施例4

一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法，步骤如下：

(1)寡糖制备：为采用过氧化氢法制备紫晶藻寡糖，其具体工作条件为：将紫晶藻多糖溶于水中，添加过氧化氢进行裂解；紫晶藻多糖占反应体系2wt％，过氧化氢添加量占反应体系1.5wt％，余量为水，反应时间120mi n，反应结束后离心，收集清液，获得粗寡糖液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗寡糖液通入100L/h的大通量超滤装置，膜孔径为100nm，操作压力差为200kPa；超滤后的寡糖液进行闪蒸，闪蒸温度150℃，闪蒸时间50s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：使用实施例1中的多层定向透析装置；多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为1200Da，900Da，600Da，300Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为8℃，透析时间为24h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为1200Da以上、900～1200Da、600～900Da、300～600Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为1.01、1.14、1.71、0.97。将吸光值最大的组分即600～900Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥冰藻寡糖。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

实施例5

一种低致敏性脱腥南极冰藻寡糖的制备方法，步骤如下：

(1)寡糖制备：为采用过氧化氢法制备紫晶藻寡糖，其具体工作条件为：将紫晶藻多糖溶于水中，添加过氧化氢进行裂解；紫晶藻多糖占反应体系1wt％，过氧化氢添加量占反应体系1.5wt％，余量为水，反应时间160mi n，反应结束后离心，收集清液，获得粗寡糖液。

(2)超滤与闪蒸串联一步浓缩：将超滤装置与超高温闪蒸装置串联，将步骤(1)收集的粗寡糖液通入100L/h的大通量超滤装置，膜孔径为10nm，操作压力差为150kPa；超滤后的寡糖液进行闪蒸，闪蒸温度150℃，闪蒸时间50s，收集闪蒸浓缩液。

(3)膜分级：使用实施例1中的多层定向透析装置；多层定向透析装置中的透析袋由内至外的截留分子量分别为800Da，550Da，350Da，150Da；将步骤(2)获得的浓缩液导入所述多层定向透析装置的最内层透析袋，透析容器中可加入适量超纯水；透析温度为10℃，透析时间为20h；透析完成后，将最外层透析袋之外、容器内的组分抛弃，剩余的四个组分分子量范围分别为800Da以上、550～800Da、350～550Da、150～350Da。

用MTT法分别检测除分子量最小的组分之外的每个组分的过敏原含量，各组分在570nm处的吸光值A(570nm)按分子量从大到小排列依次为1.06、1.88、0.97、0.76。将吸光值最大的组分即550～800Da的组分抛弃，将其他三个组分合并，得低致敏性脱腥冰藻寡糖。

需要注意的是，如果吸光值最大的组分与相邻组分吸光值接近，说明各个透析袋的截留分子量安排不合理，需要重新设置。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。