阅读说明：本技术 一种低废水产生量生产和提取谷氨酸的方法 (Method for producing and extracting glutamic acid with low wastewater production ) 是由 时夫龙 程士清 孙钦波 徐国莉 杨雪 于 2019-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于氨基酸生产技术领域,公开了一种低废水产生量生产和提取谷氨酸的方法,其包括：步骤1)生产工艺和步骤2)提取工艺；该生产工艺中使用了豆粕水解产物制备的发酵培养基。该方法发酵成本低廉,提取工艺废水量降低。(The invention belongs to the technical field of amino acid production, and discloses a method for producing and extracting glutamic acid with low wastewater production, which comprises the following steps: step 1) production process and step 2) extraction process; the production process uses a fermentation culture medium prepared from bean pulp hydrolysate. The method has low fermentation cost and reduced extraction process waste water amount.)

一种低废水产生量生产和提取谷氨酸的方法

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，涉及一种低废水产生量生产和提取谷氨酸的方法。

背景技术

随着氨基酸行业逐步发展，微生物发酵法成为氨基酸生产最有前途的生产技术，但在微生物发酵液制备过程中，存在发酵培养基成本高的缺陷。谷氨酸提取工艺主要存在以下弊端：1、国内现有的氨基酸生产仍采用板框、离交、脱色、干燥等传统技术手段，产品纯度低、酸碱用量大、废水产量大以及环境污染严重，成为制约生物发酵行业绿色发展的关键因素。2、传统的絮凝剂造成废液的波美度和粘度高，造成废水处理难度大的技术问题。3、在干燥过程中料液易产生焦化的现象，影响产品的品质，产生不良的气味。

发明内容

为了克服现有技术中谷氨酸发酵培养基以及提取工艺废水量过大等缺陷，本发明提供了一种低废水产生量生产和提取谷氨酸的方法，该方法发酵成本低廉，提取工艺废水量降低。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种低废水产生量生产和提取谷氨酸的方法，其包括：步骤1）生产工艺和步骤2）提取工艺；其特征在于，所述生产工艺中使用了豆粕水解产物制备的发酵培养基。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

步骤1）生产工艺：将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵48h，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35-37℃，通风比1∶0.6，搅拌转速200-300r/min，溶氧维持在20％，流加质量百分比浓度为20％的葡萄糖维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡；

步骤2）提取工艺：

取发酵液，采用高速碟片离心机以4000rpm的速度离心5min，收集滤液和菌体蛋白沉淀；往滤液中添加1%的絮凝剂，混匀，然后静置12h，板框过滤，收集液体；然后经过陶瓷膜进行过滤，收集滤液；将滤液引入脱色罐，活性炭的添加量为0.5%，脱色时间为60min，过滤收集脱色液；将脱色液经过脱色膜进行二次脱色，收集脱色清液；将脱色清液通过顺序式模拟移动床进行色谱分离得到提取液；将提取液经四效浓缩、离心、流化床喷雾干燥，检验、包装，即得。

进一步地，所述发酵培养基按照如下工艺制备而得：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制：葡萄糖50-100g/L，豆粕水解产物100-300g/L，K₂HPO₄ 1-3g/L，MgSO₄·7H₂O 30-80mg/L，MnSO₄·H₂O 2-5mg/L，FeSO₄·7H₂O 2-5mg/L，VB₁8-15mg/L，生物素5-10μg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6-7，灭菌，自然冷却，即得发酵培养基。

更进一步地，所述方法包括如下步骤：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/L，豆粕水解产物200g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，即得发酵培养基。

优选地，所述豆粕水解产物按照如下工艺制得：

将豆粕粉碎，置于反应釜中，然后添加玉米浆和谷氨酸渣，再加入柠檬酸，配置成固含量为30-40%的悬液，再采用高压均质机进行均质处理，使得粒径细化；升温至90℃，超声辅助水解5-20min；继续水解5-7h，然后微波辅助水解2-4min，停止微波，降温至45℃，添加氨水，调整pH为2.5-3.5，再添加酸性蛋白酶，酶解6-9h，95℃灭酶3min，然后过滤出渣，再添加活性炭脱色，过滤去除活性炭，得到豆粕水解产物。

更优选地，所述玉米浆的添加量占豆粕30-50%重量份，所述谷氨酸渣的添加量占豆粕20-40%重量份。

更优选地，所述柠檬酸的浓度为1-2mol/L。

更优选地，所述均质处理的参数为：压力为30MPa，温度为32℃，时间为10-20s。

更优选地，所述酸性蛋白酶的添加量为500U/L。

更优选地，所述絮凝剂由壳聚糖和海藻酸钠按照2:1的质量比混合制得。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明利用物理方法辅助酸+酶水解蛋白方法，具有水解迅速、彻底、成本低、投资小应用广泛等特点；

本发明将谷氨酸渣和玉米浆添加到豆粕中，通过优化工艺，能够对三种蛋白共同水解，水解产物中营养更加均衡全面，相对于单一的水解产物，发酵效果更佳；

本发明通过水解豆粕技术，利用玉米浆和谷氨酸渣配合豆粕，将玉米浆和谷氨酸渣中微生物较难利用的大分子蛋白，水解游离出菌体易于利用的氨基态氮及小分子物质，有效利用原料自身优势，作为发酵培养基的特定营养成分，减少发酵过程中产生泡沫较多的现象，增加发酵罐容的有效利用率，降低发酵染菌率；

本发明采用弱酸+蛋白酶同时水解多种蛋白的方式，并且采用多种高压均质、超声以及微波的辅助方式，提高了蛋白质浸出率，水解度也大大提高，水解条件温和，不会破坏氨基酸组分；高压均质机进行均质使得粒径细化，使得蛋白颗粒达到1-10微米级别，提高水解接触面积；合适频率的超声波处理不仅能够使得蛋白质萃取率提高，还能够使得蛋白质链被破坏，提高蛋白溶解性和亲水性，有利于克服弱酸水解不彻底的弊端；一定功率的微波使得肽分子在电磁场中发生震动，使得部分未能被柠檬酸水解的多肽结构变得松散，巯基被破坏，内部结构发生改变，从而有利于进一步的酶解。

本发明以获取高纯度高性价比的氨基酸产品、减少环境污染、提高绿色化水平为最终目标，采用“色谱+多级膜耦合分离纯化技术”为核心的综合化绿色分离提取技术，大幅度降低提取过程酸碱使用量和用水量，降低提取过程的能耗，降低提取过程的高氨氮废水的生成量；以“陶瓷膜+脱色膜”过滤技术实现氨基酸发酵液精细过滤，达到模拟移动床色谱的精度要求；绿色高效“壳聚糖+海藻酸钠新型絮凝剂”替代传统聚丙烯酰胺，在显著提高蛋白收率的同时，降低了废液的波美度和粘度，实现了行业絮凝剂绿色化的突破。

附图说明

图1：不同酸类型对水解率的影响；

图2：不同水解温度对水解率的影响；

图3：微波时间对水解率的影响；

图4：不同酶类型和酶活力对水解率的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种水解大豆豆粕的工艺，其包括如下步骤：

将豆粕粉碎，置于反应釜中，添加占豆粕50%重量的玉米浆和25%重量份的谷氨酸渣（谷氨酸渣的出处具体可以参见“谷氨酸渣对秦川肉牛生长发育和血液生化指标的影响，中国畜牧兽医 2017,44（8）：2295-2302”），再匀速加入1.5mol/L柠檬酸，配置成固含量为35%质量比的悬液，再采用高压均质机（压力为30MPa，温度为32℃，时间为20s）均质处理，使得粒径细化，控制颗粒为1-10微米级别；升温至90℃，超声辅助水解10min，超声频率为20kHz；继续水解6h，然后微波辅助水解3min，微波功率为300W，停止微波，降温至45℃，添加氨水，调整pH为3，再添加酸性蛋白酶（酶活力为5万U/g），添加量为500U/L，酶解6h，95℃灭酶3min，然后用硅藻土过滤机进行过滤出渣，再添加1%重量份的活性炭脱色30min，过滤去除活性炭，得到可用于发酵用的豆粕水解产物。

实施例2

一种水解大豆豆粕的工艺，其包括如下步骤：

将豆粕粉碎，置于反应釜中，添加占豆粕40%重量的玉米浆和30%重量份的谷氨酸渣，再匀速加入2mol/L柠檬酸，配置成固含量为40%的悬液，再采用高压均质机（压力为30MPa，温度为32℃，时间为15s）均质处理，使得粒径细化，控制颗粒为1-10微米级别；升温至90℃，超声辅助水解10min，超声频率为20kHz；继续水解5h，然后微波辅助水解3min，微波功率为300W，停止微波，降温至45℃，添加氨水，调整pH为2.5，再添加酸性蛋白酶（酶活力为5万U/g），添加量为500U/L，酶解7h，95℃灭酶3min，然后用硅藻土过滤机进行过滤出渣，再添加1%重量份的活性炭脱色30min，过滤去除活性炭，得到可用于发酵用的豆粕水解产物。

实施例3

水解率检测

1、总氮含量的测定

凯氏定氮法

其原理是蛋白质含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为的蛋白质含量。

计算公式：

样品中含氮量（%）=0.014×（A-B）×100%；

A----滴定样品用去的HCl溶液毫升数；

B----滴定空白用去的HCl溶液毫升数；

样品中蛋白质含量（%）=样品含氮量/0.16；

氨基态氮含量测定

利用甲醛滴定法进行测定，其原理和检测方法如下：

原理：

氨基酸态氮亦称氨态氮。氨基酸含有酸性的-COOH,也含有碱性的-NH₂,它们互相作用使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH₂,与甲醛结合，其碱性消失，使-COOH显示出酸性，可用氢氧化钠标准溶液滴定，以酸度计测定终点。

检测方法：

吸取5.0ml样品，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中，加60ml水。开动磁力搅拌器，用0.05N氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示PH=8.2。

加入10ml甲醛溶液混匀，再用0.05N氢氧化钠标准溶液滴定至PH=9.2，记下消耗0.05N氢氧化钠标准溶液的毫升数。

同时取80ml水，先用0.05N氢氧化钠标准溶液调节至PH为8.2，再加入10.0ml甲醛溶液，用0.05N氢氧化钠标准溶液调节至PH为9.2，做试剂空白试验。

水解率计算：

水解率=水解氨基酸态总量/原料含氮量×100。

一、不同酸类型对水解影响

选择不同的酸，包括盐酸、柠檬酸和醋酸，鉴于过高的酸浓度往往导致酸过多的挥发，这些挥发的酸会造成设备的严重腐蚀，中和时消耗的碱液增加，最终使得产品的盐分过高，不易于微生物的发酵生产；因此，选择酸浓度均为1.5mol/L，水解6h，内容物的固含量为30-40%，采用高压均质机均质处理，在采用超声处理，如图1所示，不同酸类型对水解率影响较大，最差的是醋酸，仅为27.8%，柠檬酸和盐酸差异不大，分别为36.7%和38.1%，但是盐酸属于强酸，不但对色氨酸等部分氨基酸造成破坏，还容易对设备产生腐蚀，因此，选择柠檬酸更为合适。

二、柠檬酸水解温度的确定

由于温度对酸水解影响较大，研究了温度对水解率的影响。添加1.5mol/L的柠檬酸，不同水解温度下水解6h，结果如图2所示，氨基氮生成率随温度的上升而增大，但温度到达90℃时，氨基氮的增幅逐渐变缓，这是因为在90℃以上，氨基酸比较容易发生脱羧反应以及氨基酸与醛类发生美拉德反应，这些反应消耗水解液中的氨基酸。

三、微波时间对水解率的影响。

均质、超声、柠檬酸水解后，采用多组对照进行验证微波时间对水解率的影响，微波使得肽分子在电磁场中发生震动，使得部分未能被柠檬酸水解的多肽结构变得松散，巯基被破坏，内部结构发生改变，从而有利于进一步的酶解；如图3所示，微波时间控制在3min较为合适，增加微波时间对水解率并没有影响，反而可能会破坏氨基酸结构，导致氨基酸营养价值的下降。

四、不同酶类型对水解率的影响。

均质、超声、柠檬酸水解、微波处理后，采用不同的酶进行处理，包括胰蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，在酶适合的温度条件下，进行酶解，如图4所示，随着酶活力的增加，水解率均有所提高，酸性蛋白酶组到达水解最高点所需要的酶活力最少，综合成本和水解率进行考虑，选择酸性蛋白酶进行水解最为合适。

实施例4

利用豆粕水解产物制备发酵培养基的方法，其包括如下步骤：

取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/L，豆粕水解产物（按照实施例1制备获得）200g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，即得发酵培养基。

酵母浸膏作为氮源的本领域常规的培养基：葡萄糖80g/L，酵母浸膏20g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3 mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L。

一半酵母膏替换为豆粕水解产物：葡萄糖80g/L，酵母浸膏10g/L，粕水解产物100g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3 mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L。

实施例5

一种低废水产生量生产和提取谷氨酸的方法，其包括：

1）生产工艺：将黄色短杆菌GDK-9按10％接种量将种子液接入装有30L发酵培养基的50L全自动发酵罐中进行发酵培养，菌体的接种浓度为OD_600nm为0.8，发酵48h，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.6，搅拌转速300r/min，溶氧维持在20％，流加质量百分比浓度为20％的葡萄糖维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡。

发酵结束后，检测发酵液中菌体浓度和谷氨酸浓度；不同氮源培养基（实施例4）的发酵情况具体见表1：

表1

组别	OD<sub>600nm</sub>	发酵液中谷氨酸产量g/L
			豆粕水解产物	54.9	139.4
酵母浸膏	49.1	126.5
			一半酵母浸膏替换为豆粕水解产物	52.8	135.3

结论：如上表1可见，与常规的酵母浸膏相比较，采用本发明的豆粕水解物作为氮源，无论在发酵菌体浓度还是谷氨酸产量方面，均有一定程度的提高，说明本发明采用水解豆粕+玉米浆+谷氨酸渣的方法制备的豆粕水解物，更适合微生物吸收和利用，并且能够大幅降低规模化生产氨基酸的成本，为企业创收，

2）提取工艺：

取发酵液，采用高速碟片离心机以4000rpm的速度离心5min，收集滤液和菌体蛋白沉淀；往滤液中添加1%（质量体积比，100ml滤液中添加1g絮凝剂）的絮凝剂（壳聚糖和海藻酸钠按照2:1的质量比混合制得），混匀，然后静置12h，板框过滤，收集液体；然后经过陶瓷膜进行过滤，收集滤液；将滤液引入脱色罐，活性炭的添加量为0.5%（质量体积比，100ml滤液中添加0.5g），脱色时间为60min，过滤收集脱色液；将脱色液经过脱色膜进行二次脱色，收集脱色清液；将脱色清液通过顺序式模拟移动床进行色谱分离得到提取液；将提取液经四效浓缩、离心、流化床喷雾干燥，检验、包装，即得。

本发明提取工艺较常规的离交工艺产品提取收率提高10%以上，产品纯度大于99%，提取过程酸碱使用量下降40%以上，用水量大幅度下降20%以上，提取过程高氨氮废水产生量下降50%以上；企业年减少氨基酸废水排放量25万m³，废水回用率达到70%以上，节能减排，降低了环境污染的压力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。