阅读说明：本技术 一种谷氨酸发酵培养基制备方法 (Preparation method of glutamic acid fermentation medium ) 是由 李德衡 赵凤良 翟德亮 赵杰 于 2019-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于氨基酸生产技术领域,公开了一种谷氨酸发酵培养基的制备方法,其包括如下步骤：取发酵培养基原料：葡萄糖,菌体蛋白浸膏,K<Sub>2</Sub>HPO<Sub>4</Sub>,MgSO<Sub>4</Sub>·7H<Sub>2</Sub>O,MnSO<Sub>4</Sub>·H<Sub>2</Sub>O,FeSO<Sub>4</Sub>·7H<Sub>2</Sub>O,VB<Sub>1</Sub>,生物素；将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基。本发明制备方法中使用菌体蛋白酶解浸膏来替代酵母浸膏,大幅降低了成本,提高了菌体蛋白的附加值,而且产酸效率更高。(The invention belongs to the technical field of amino acid production, and discloses a preparation method of a glutamic acid fermentation medium, which comprises the following steps: taking fermentation medium raw materials: glucose, mycoprotein extract, K 2 HPO 4 ，MgSO 4 ·7H 2 O，MnSO 4 ·H 2 O，FeSO 4 ·7H 2 O，VB 1 Biotin; stirring the raw materials uniformly, adjusting pH to 6.5, sterilizing at 121 deg.C for 15min, and naturally cooling to obtain fermentation culture medium. The preparation method of the invention uses the mycoprotein enzymolysis extract to replace the yeast extract, thereby greatly reducing the costThe added value of the mycoprotein is improved, and the acid production efficiency is higher.)

一种谷氨酸发酵培养基制备方法

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种谷氨酸发酵培养基制备方法。

背景技术

谷氨酸发酵废菌体是味精生产过程中的副产品，是提取精制味精过程中经分离得到的单细胞蛋白，每年产量可达上百万吨。为了节约资源，目前大多数味精生产企业将谷氨酸菌体蛋白作为饲料出售，虽然取得了一定的经济效益，但是还没有完全挖掘出其应用价值。通过对菌体蛋白进行营养成分分析发现其蛋白质含量丰富，氨基酸组份齐全，并含有丰富的维生素、核酸、多糖等。因此，将谷氨酸菌体蛋白作为原料探索并开发出具有更高价值的副产品意义重大。目前这方面的研究主要集中于将菌体蛋白开发为动物饲料、生物肥料、调味品、制备发酵培养基等。

发酵制备谷氨酸工艺中发酵培养基的成本是制约企业发展的一个核心问题，如何降低成本是我们研究的方向。以酵母粉作为谷氨酸发酵培养基的氮源，价格较高，在副产品方面，发酵遗留菌体是其中最主要的副产物。一般的菌体处理方法都是将菌体经过简单处理后用作有机肥料，这样不仅降低了其产品附加值，还造成了资源的极大浪费。因此为了降低生产成本和实现绿色生产，将发酵废弃菌体蛋白进行处理后用作其发酵原料，实现资源的循环利用。

发酵制备谷氨酸工艺中发酵培养基的优化是提高发酵效率的重要因素，申请人之前的专利技术“利用谷氨酸发酵废弃菌体制备发酵培养基的方法”对现有技术培养基进行了改进和优化，其包括高粱秸秆水解液15%，菌体水解液12%，葡萄糖5%，米糠提取物1.2%，玉米浆1%，贝壳粉0.02%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，其余为水；该培养基降低了成本，但是存在色素较多，粘度大以及杂质多的发酵氮源和碳源物质，使得发酵过程难以控制，极易造成发酵的不稳定性及分离提取的困难；而且该专利文献对菌体蛋白的处理方法采用了盐酸，容易对氨基酸造成破坏，导致水解产物的营养价值较低。我们继续对发酵培养基进行进一步地研究，旨在开发一种发酵效率高，成本低廉的发酵培养基。

酶解菌体得到的复合氨基酸组分齐全，此外还含有丰富的维生素等，非常适合作为氨基酸发酵培养基的组分进行使用，能够替代价格昂贵的酵母膏以及维生素等组分，降低了发酵成本；但是如何获得高营养价值的酶解菌体产物，并且质量可控，维持发酵效率的稳定性，是我们需要解决的技术问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种谷氨酸发酵培养基制备方法，该方法中使用菌体蛋白酶解浸膏来替代酵母浸膏，大幅降低了成本，提高了菌体蛋白的附加值，而且产酸效率更高。

本发明是通过如下方案来实现的：

一种谷氨酸发酵培养基的制备方法，其包括如下步骤：取发酵培养基原料：葡萄糖，菌体蛋白浸膏，K₂HPO₄，MgSO₄·7H₂O，MnSO₄·H₂O，FeSO₄·7H₂O，VB₁，生物素；将各原料搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得发酵培养基。

进一步地，所述发酵培养基中各原料按照以下浓度配制：葡萄糖80g/L，菌体蛋白浸膏20g/L， K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L。

进一步地，所述菌体蛋白浸膏按照工艺制备而得：

步骤1）分离菌体：将谷氨酸发酵液通过碟片分离机进行分离，收集菌体沉淀；

步骤2）高压匀浆：往菌体沉淀中添加磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为100-300g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理；

步骤3）离心：停止匀浆处理，1000rpm离心3-5min，收集上层液体和沉淀物；

步骤4）超声处理：往沉淀物中添加5-10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用超声波进行处理，处理时间为20-30min；

步骤5）酶解：调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，酶解时间为6-9h；

步骤6）蒸发浓缩：然后升温至90-100℃，灭酶3-5min，再与步骤3）所得上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为60-70％的菌体蛋白浸膏。

优选地，所述碟片离心机的转速为4000-5000rpm，离心时间为3-5min。

优选地，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为5-10g/L。

优选地，所述匀浆处理参数为：匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次。

优选地，所述超声波的频率为20kHz。

优选地，所述中性蛋白酶的添加量为500u酶活力/g干物质。

本发明还要求保护按照上述的制备方法得到的发酵培养基。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明不采用酸或碱水解的方式，减少了污染，避免了对设备的腐蚀，而且仅仅通过酶解的方式，条件比较温和，不会对营养物质造成破坏，而且酶解产物成分较为稳定，质量可控，利于规模化发酵体系的质量控制。

本发明首先采用高压匀浆处理，能够充分破碎细胞壁，释放胞内蛋白，采用磷酸二氢钾水溶液作为缓冲液，能够提高破碎率，并且磷酸二氢钾还可作为发酵培养基的组分，一举两得；

匀浆处理的操作压力对细胞破碎及释放蛋白都至关重要，综合破碎动力学和破碎工艺效果匀浆压力，进行多次试验，选择为90MPa为宜；匀浆前2次细胞破碎率迅速上升，再次匀浆，细胞破碎率并没有明显提升，但是第3次匀浆后，大分子蛋白也会在匀浆作用下裂解成小分子短肽或游离氨基酸，氨基酸态氮的含量有一定量的增加，蛋白水解度增大，继续增加匀浆次数，蛋白水解度并没有明显增加，而且对设备有一定的损害；

匀浆后进行离心，上层液体含有氨基酸态氮水平较高，无需对该部分产物进行酶解处理，从而降低了酶的使用量，降低了成本；沉淀物为细胞碎片和大分子蛋白质，而且细胞壁碎片中仍然含有一定量的蛋白，而且部分蛋白会黏附在细胞壁碎片上，通过对沉淀物进行超声处理，使得细胞碎片上的蛋白和多糖释放出来，多糖被菌株作为营养物质利用，超声处理后，进而采用中性蛋白酶进行酶解处理，酶的使用量和作用时间大幅降低，节约了成本。

与常规的酵母浸膏氮源进行比较，使用本发明的发酵培养基，无论在发酵菌体浓度还是谷氨酸产量方面，均有小幅的提升，说明本发明制备的菌体蛋白浸膏与常规使用的氮源酵母浸膏（干物质含量为65-70％）相比较，营养成分更加丰富和全面，有利于微生物利用和产酸。

附图说明

图1：高压匀浆次数对菌体细胞破碎率的影响；

图2：高压匀浆次数对水解度的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为5g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为200g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后往沉淀物中添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

实施例2

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为4000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为7g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为250g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心4min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后添加8倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为30min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为7h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为70％的浸膏。

实施例3

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为10g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为220g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后往沉淀物中添加9倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例1

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀干燥，粉碎，然后采用中性蛋白酶水解，添加量为5000u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例2

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为5g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为200g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例3

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀干燥，粉碎，添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后采用中性蛋白酶水解，添加量为1000u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

实施例4

以谷氨酸发酵液为例，菌体蛋白为谷氨酸棒杆菌。

总氮的测定：采用凯氏定氮法测定总氮，计为N1；

氨基酸态氮的测定：采用甲醛滴定法测定氨基酸态氮，计为N2。

水解度：（N2/N1）×100％。

高压匀浆次数对菌体细胞破碎率、水解度的影响，设置次数为1,2,3,4次，如图1-2所示，匀浆前2次细胞破碎率迅速上升，再次匀浆，细胞破碎率并没有明显提升，但是第3次匀浆后，氨基酸态氮的含量有一定量的增加，大分子蛋白也会在匀浆作用下裂解成小分子短肽或游离氨基酸，蛋白水解度增大，继续增加匀浆次数，蛋白水解度并没有明显增加，而且匀浆次数过多对设备有一定的损害；因此，选择3次高压匀浆最为合适。

磷酸二氢钾水溶液对菌体细胞破碎率、水解度的影响。对照组：采用纯化水替代磷酸二氢钾水溶液，实验组：实施例1，具体见表1：

表1

组别	细胞破碎率%	水解度%
			实验组	97.8	7.1
对照组	91.3	5.4

采用磷酸二氢钾水溶液作为缓冲液，能够提高破碎率，并且磷酸二氢钾还可作为发酵培养基的组分，不会对后续的产品造成影响，

实施例5

不同因素对水解度的影响。

检测实施例1和对比例1-3的水解度，具体见表2所示。

表2

组别	水解度%
		实施例1	86.7
对比例1	38.6
		对比例2	70.3
对比例3	62.5

如表2所示，与对比例1-3相比较，实施例1的水解度最高，相应的氨基酸态氮的含量也最高，其中，对比例1使用的酶活力较多，达到5000u酶活力/g干物质，是实施例1的10倍，水解度仅为38.6%，对比例2没有对细胞壁碎片和大分子蛋白进行超声波处理，水解度下降了16个百分点，对比例3没有采用高压均浆处理，尽管使用的酶活总量是实施例1的两倍，但是水解度下降明显；可见，合适的高压匀浆和超声波等预处理工艺，能够大幅减少酶的用量，降低成本，并且水解度较高。

实施例6

一种谷氨酸发酵培养基的制备方法，其包括如下步骤：

取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/L，浸膏（实施例1）20g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L，搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得本发明的发酵培养基。

对照培养基：葡萄糖80g/L，酵母浸膏20g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3 mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L。

发酵工艺：将黄色短杆菌GDK-9按8％接种量将种子液接入装有30L发酵培养基的50L全自动发酵罐中进行发酵培养，菌体的接种浓度为OD_600nm为0.8，发酵36h，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.6，搅拌转速500r/min，溶氧维持在20％，流加质量百分比浓度为50％的葡萄糖维持残糖为1.0％，流加消泡剂消泡。

发酵结束后，检测发酵液中菌体浓度和谷氨酸浓度；具体见表3：

表3

组别	菌体OD<sub>600nm</sub>	谷氨酸产量g/L
			本发明培养基	51.4	121.6
对照培养基	48.7	119.8

如上表3可见，通过对照培养基组比较试验发现，与常规的酵母浸膏氮源进行比较，使用本发明的酶解菌体浸膏作为发酵培养基氮源，无论在发酵菌体浓度还是谷氨酸产量方面，均有小幅的提升，说明本发明制备的菌体蛋白浸膏与常规使用的氮源酵母浸膏（干物质含量为65-70％）相比较，水解程度更高，营养成分更加丰富和全面，有利于微生物吸收利用和产酸；在提高生产效率的同时，降低了生产成本，达到变废为宝的目的。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。