阅读说明：本技术 一种谷氨酸发酵提取工艺 (Glutamic acid fermentation extraction process ) 是由 杨雪 刘元涛 尤学波 罗玮 于 2019-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于氨基酸生产技术领域,公开了一种谷氨酸发酵提取工艺,其包括如下步骤：步骤1)制备发酵培养基,步骤2)发酵工艺,步骤3)离心、过滤和浓缩,步骤4)等电、离心和干燥。本发明采用菌体蛋白酶解浸膏作为发酵氮源,发酵效率高,降低了成本；提取工艺中,采用超滤浓缩和浓缩等电技术,操作简单,产品纯度和收率高。(The invention belongs to the technical field of amino acid production, and discloses a glutamic acid fermentation extraction process, which comprises the following steps: step 1) preparing a fermentation medium, step 2) fermenting, step 3) centrifuging, filtering and concentrating, and step 4) isoelectric, centrifuging and drying. The invention adopts the mycoprotein enzymolysis extract as the fermentation nitrogen source, has high fermentation efficiency and reduces the cost; in the extraction process, the ultrafiltration concentration and concentration isoelectric technologies are adopted, the operation is simple, and the product purity and yield are high.)

一种谷氨酸发酵提取工艺

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种谷氨酸发酵提取工艺。

背景技术

L-谷氨酸（L-glutamic acid）在食品、医药与工业方面均有广泛的用途，尤其是在食品方面，它是制造味精的前体。自1957年Kinoshita等人创立了微生物发酵法生产谷氨酸以来，迄今已有50多年的历史。谷氨酸的发酵法生产开创了发酵法氨基酸工业化生产的新纪元，使得发酵法生产氨基酸成为工业微生物最重要的研究领域之一。1964年，我国应用发酵法生产谷氨酸获得成功，并在上海首先采用发酵新工艺投产，之后在国内逐步推广，有力地推动了我国味精工业的崛起。2003年中国味精产量118.9万吨，占世界产量的53%；2006年产量136万吨，居世界第一。2010年，味精产量已达到210万吨，远远领先于其他国家；2018年味精的产量已经突破300万吨。

发酵制备谷氨酸工艺中发酵培养基的优化是提高发酵效率的重要因素，申请人之前的专利技术“利用谷氨酸发酵废弃菌体制备发酵培养基的方法”对现有技术培养基进行了改进和优化，其包括高粱秸秆水解液15%，菌体水解液12%，葡萄糖5%，米糠提取物1.2%，玉米浆1%，贝壳粉0.02%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，其余为水；该培养基降低了成本，但是存在色素较多，粘度大以及杂质多的发酵氮源和碳源物质，使得发酵过程难以控制，极易造成发酵的不稳定性及分离提取的困难；而且该专利文献对菌体蛋白的处理方法采用了盐酸，容易对氨基酸造成破坏，导致水解产物的营养价值较低。本研究继续对发酵培养基进行了进一步地探讨，旨在开发一种发酵效率高，成本低廉的发酵培养基。

随着味精行业的发展，谷氨酸提取工艺也不断改进。近几年来，国内一些味精生产企业、研究所，对谷氨酸发酵液除菌体提取谷氨酸进行了大量研究，除菌体工艺有高速离心分离、絮凝剂分离、膜分离等，取得了显著的成效。按除菌体的不同工艺，除菌率达到70-90%以上，且膜分离除菌率可高达95%以上，所得发酵液澄清，OD值较低，谷氨酸提取操作方便。由于除去了影响谷氨酸结晶的大量杂质，因而谷氨酸结晶颗粒大，纯度高，质量好，易于沉降分离，提取收率明显提高。高纯度谷氨酸有利于味精精制，味精中和脱色过滤可降低活性炭或树脂用量，提高味精结晶质量，大大降低味精生产成本。此外，除菌体后的发酵液及等电提取后的废液中COD、BOD大大降低，减轻了环境污染，降低了废水治理负荷与难度，得到的菌体经干燥后可以进行综合利用，如作为高蛋白饲料或用作核苷酸的生产原料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种谷氨酸发酵提取工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种谷氨酸发酵提取工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备发酵培养基，步骤2）发酵工艺，步骤3）离心、过滤和浓缩，步骤4）等电、离心和干燥。

根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤1）制备发酵培养基，包括如下步骤：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/L，浸膏20g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3 mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L，搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得发酵培养基。

根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述步骤2）发酵工艺，包括如下步骤：将黄色短杆菌GDK-9按8-10％接种量将种子液接入发酵培养基进行发酵培养，菌体的接种浓度为OD_600nm为0.8，发酵36h以上，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.6，搅拌转速500r/min，溶氧维持在20％，流加质量百分比浓度为50％的葡萄糖维持残糖为1.0％，流加消泡剂消泡。

根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述步骤3）离心、过滤和浓缩，包括如下步骤：将发酵液采用碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体，然后采用陶瓷膜（截留分子量为10000Da）过滤，收集过滤液，然后经过超滤膜超滤（截留分子量为300Da），收集滤过液，然后浓缩3倍，得到浓缩液。

根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述步骤4）等电、离心和干燥，包括如下步骤：往一级等电罐中流加上述浓缩液，同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5，温度控制在22℃，经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，二级等电点罐pH控制3.3，温度10℃；经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，三级等电点罐pH控制3.2，温度5℃；离心获得湿晶体，80℃干燥得到谷氨酸产品。

根据权利要求2或4所述的工艺，其特征在于，所述浸膏按照工艺制备而得：

步骤（1）分离菌体：将谷氨酸发酵液通过碟片分离机进行分离，收集菌体沉淀；

步骤（2）高压匀浆：往菌体沉淀中添加磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为100-300g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理；

步骤（3）离心：停止匀浆处理，1000rpm离心3-5min，收集上层液体和沉淀物；

步骤（4）超声处理：往沉淀物中添加5-10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用超声波进行处理，处理时间为20-30min；

步骤（5）酶解：调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，酶解时间为6-9h；

步骤（6）蒸发浓缩：然后升温至90-100℃，灭酶3-5min，再与步骤3）所得上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为60-70％的菌体蛋白浸膏。

根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述碟片离心机的转速为4000-5000rpm，离心时间为3-5min。

根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述匀浆处理参数为：匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次。

根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述超声波的频率为20kHz。

根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述中性蛋白酶的添加量为500u酶活力/g干物质。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明对菌体蛋白不采用酸或碱水解的方式，减少了污染，避免了对设备的腐蚀，而且仅仅通过酶解的方式，条件比较温和，不会对营养物质造成破坏，而且酶解产物成分较为稳定，质量可控，利于规模化发酵体系的质量控制。

本发明处理菌体时，首先采用高压匀浆处理，能够充分破碎细胞壁，释放胞内蛋白，采用磷酸二氢钾水溶液作为缓冲液，能够提高破碎率，并且磷酸二氢钾还可作为发酵培养基的组分，一举两得；匀浆处理的操作压力对细胞破碎及释放蛋白都至关重要，综合破碎动力学和破碎工艺效果匀浆压力，进行多次试验，选择为90MPa为宜；匀浆前2次细胞破碎率迅速上升，再次匀浆，细胞破碎率并没有明显提升，但是第3次匀浆后，大分子蛋白也会在匀浆作用下裂解成小分子短肽或游离氨基酸，氨基酸态氮的含量有一定量的增加，蛋白水解度增大，继续增加匀浆次数，蛋白水解度并没有明显增加，而且对设备有一定的损害；匀浆后进行离心，上层液体含有氨基酸态氮水平较高，无需对该部分产物进行酶解处理，从而降低了酶的使用量，降低了成本；沉淀物为细胞碎片和大分子蛋白质，而且细胞壁碎片中仍然含有一定量的蛋白，部分蛋白会黏附在细胞壁碎片上，通过对沉淀物进行超声处理，使得细胞碎片上的蛋白和多糖释放出来，多糖被菌株作为营养物质利用，超声处理后，进而采用中性蛋白酶进行酶解处理，酶的使用量和作用时间大幅降低，节约了成本。

与常规的酵母浸膏氮源进行比较，使用本发明的发酵培养基，无论在发酵菌体浓度还是谷氨酸产量方面，均有小幅的提升，说明本发明制备的菌体蛋白浸膏与常规使用的氮源酵母浸膏（干物质含量为65-70％）相比较，营养成分更加丰富和全面，有利于微生物利用和产酸。

本发明提取工艺中，采用超滤浓缩和浓缩等电技术，操作简单，通过分离纯化工艺使得谷氨酸纯度为90％以上，收率为95%以上。

附图说明

图1：高压匀浆次数对菌体细胞破碎率的影响；

图2：高压匀浆次数对水解度的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为5g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为200g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后往沉淀物中添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

实施例2

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为4000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为7g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为250g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心4min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后添加8倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为30min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为7h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为70％的浸膏。

实施例3

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为10g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为220g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后往沉淀物中添加9倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例1

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀干燥，粉碎，然后采用中性蛋白酶水解，添加量为5000u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例2

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为5g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为200g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例3

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀干燥，粉碎，添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后采用中性蛋白酶水解，添加量为1000u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

实施例4

以谷氨酸发酵液为例，菌体蛋白为谷氨酸棒杆菌。

总氮的测定：采用凯氏定氮法测定总氮，计为N1；

氨基酸态氮的测定：采用甲醛滴定法测定氨基酸态氮，计为N2。

水解度：（N2/N1）×100％。

高压匀浆次数对菌体细胞破碎率、水解度的影响，设置次数为1,2,3,4次，如图1-2所示，匀浆前2次细胞破碎率迅速上升，再次匀浆，细胞破碎率并没有明显提升，但是第3次匀浆后，氨基酸态氮的含量有一定量的增加，大分子蛋白也会在匀浆作用下裂解成小分子短肽或游离氨基酸，蛋白水解度增大，继续增加匀浆次数，蛋白水解度并没有明显增加，而且匀浆次数过多对设备有一定的损害；因此，选择3次高压匀浆最为合适。

磷酸二氢钾水溶液对菌体细胞破碎率、水解度的影响。对照组：采用纯化水替代磷酸二氢钾水溶液，实验组：实施例1，具体见表1：

表1

组别	细胞破碎率%	水解度%
			实验组	97.8	7.1
对照组	91.3	5.4

采用磷酸二氢钾水溶液作为缓冲液，能够提高破碎率，并且磷酸二氢钾还可作为发酵培养基的组分，不会对后续的产品造成影响，

实施例5

不同因素对水解度的影响。

检测实施例1和对比例1-3的水解度，具体见表2所示。

表2

组别	水解度%
		实施例1	86.7
对比例1	38.6
		对比例2	70.3
对比例3	62.5

如表2所示，与对比例1-3相比较，实施例1的水解度最高，相应的氨基酸态氮的含量也最高，其中，对比例1使用的酶活力较多，达到5000u酶活力/g干物质，是实施例1的10倍，但是水解度仅为38.6%，对比例2没有对细胞壁碎片和大分子蛋白进行超声波处理，水解度下降了16个百分点，对比例3没有采用高压均浆处理，尽管使用的酶活总量是实施例1的两倍，但是水解度下降明显；可见，合适的高压匀浆和超声波等预处理工艺，能够大幅减少酶的用量，降低成本，并且水解度较高。

实施例6

一种谷氨酸发酵培养基的制备方法，其包括如下步骤：

取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/L，浸膏（实施例1）20g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3 mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L，搅拌均匀后，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却，制得本发明的发酵培养基。

对照培养基：葡萄糖80g/L，酵母浸膏20g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 50mg/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3 mg/L，VB₁10mg/L，生物素7μg/L。

发酵工艺：将黄色短杆菌GDK-9按8％接种量将种子液接入装有30L发酵培养基的50L全自动发酵罐中进行发酵培养，菌体的接种浓度为OD_600nm为0.8，发酵36h，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.6，搅拌转速500r/min，溶氧维持在20％，流加质量百分比浓度为50％的葡萄糖维持残糖为1.0％，流加消泡剂消泡。

发酵结束后，检测发酵液中菌体浓度和谷氨酸浓度；具体见表3：

表3

组别	菌体OD<sub>600nm</sub>	谷氨酸产量g/L
			本发明培养基	51.4	121.6
对照培养基	48.7	119.8

如上表3可见，通过对照培养基组比较试验发现，与常规的酵母浸膏氮源进行比较，使用本发明的发酵培养基，无论在发酵菌体浓度还是谷氨酸产量方面，均有小幅的提升，说明本发明制备的菌体蛋白浸膏与常规使用的氮源酵母浸膏（干物质含量为65-70％）相比较，水解程度更高，营养成分更加丰富和全面，有利于微生物吸收利用和产酸；在提高生产效率的同时，降低了生产成本，达到变废为宝的目的。

实施例7

一种谷氨酸提取工艺，其包括如下步骤：

将实施例6的发酵液采用碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体，然后采用陶瓷膜（截留分子量为10000Da）过滤，收集过滤液，然后经过超滤膜超滤（截留分子量为300Da），收集滤过液，然后浓缩3倍；往一级等电罐中流加上述浓缩液，同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5，温度控制在22℃，经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，二级等电点罐pH控制3.3，温度10℃；经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，三级等电点罐pH控制3.2，温度5℃；离心获得湿晶体，80℃干燥得到谷氨酸产品。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。