阅读说明：本技术 一种提高银杏外种皮银杏酸有效经济产量的方法 (Method for improving effective and economic yield of ginkgolic acid from ginkgo biloba sarcotesta ) 是由 王义强 刘伟 冯致 李萌 杨竣茹 杨果 王惠 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种提高银杏外种皮银杏酸有效经济产量的方法。包括外源激素的配制、喷施时间的确定、喷施组合的选择等技术环节。本方法能显著提高银杏种子外种皮的占比,同时外种皮中银杏酸含量也显著提高。本方法由于提高了银杏外种皮的产值,为以银杏酸为主要作用物质的生物源农药生产提供了优质原料。本方法施行简便、成本低、效果好,在银杏育种难的背景下,可作为外种皮用银杏优质高产栽培的补充手段。(The invention provides a method for improving the effective and economic yield of ginkgolic acid in ginkgo episperms. Comprises the technical links of the preparation of exogenous hormone, the determination of spraying time, the selection of spraying combination and the like. The method can obviously improve the proportion of the testa of the ginkgo seed, and the content of ginkgoic acid in the testa is also obviously improved. The method improves the output value of the ginkgo episperm, and provides a high-quality raw material for the production of biogenic pesticides taking ginkgoic acid as a main action substance. The method is simple and convenient to implement, low in cost and good in effect, and can be used as a supplementary means for high-quality and high-yield cultivation of the ginkgo biloba for the testa under the background of difficult ginkgo breeding.)

一种提高银杏外种皮银杏酸有效经济产量的方法

技术领域

本发明属于提升银杏单株经济产量技术领域，具体涉及一种提高银杏外种皮银杏酸有效经济产量的方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)，又名白果树，单科单属裸子植物，雌雄异株，落叶乔木，为世界著名孑遗物种和珍贵药用树种，从银杏叶中提取的类黄酮和萜类酯是防治心脑血管疾病的特效药。银杏外种皮是种实硬核外部的肉质部分，又称白果衣胞，占银杏种子60％以上重量。银杏外种皮含有多种有效成分，主要有酚酸、类黄酮、萜内酯和多糖等化合物，在银杏外种皮中银杏酸的含量最高。

银杏酸是一种次生代谢产物，有白果新酸(C13:0)、氢化白果酸(C15:0)、白果酸(C15:1)、十七烷一烯银杏酸(C17:1)、十七烷二烯银杏酸(C17:2)5种。白果酸、白果新酸和十七烷一烯银杏酸是银杏酸中主要具有杀菌、灭虫功效的成分，约占总银杏酸的90％，其中白果酸[2-羟基-6-(8-十五烯基)苯甲酸]是银杏外种皮中银杏酸最主要成分，约占总银杏酸的50％。它们是从银杏中分离得到的一种漆树酸的类似物。

漆树酸最早是从漆树科腰果树中发现分离，是一种酚类脂质物，为6-烷基-2-羟基苯甲酸混合物的统称，其中烷基链中有15个碳等，含饱和或不饱和键，银杏酸为漆树酸的类似物，结构式如下[文献1-2]。

根据前人利用C14标记的研究发现，银杏酸的合成以脂肪酸为前体分子经过脂肪酸去饱和酶的修饰，经过Ⅲ型聚酮合成酶合成环化形成侧链饱和度不同的银杏酸。该反应步骤利用丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A为前体从头合成(图1)[文献2-3]

银杏酸为漆树酸的类似物，它们的合成都来源于脂肪酸途径，漆树酸早于银杏酸发现，后来人们把银杏酸归于漆树酸一类。

银杏酸具有良好的抑菌杀虫作用，高效、低毒、低残留等特点是发展有机农业、促进农业可持续发展的理想生物农药。

银杏原产我国，中国拥有世界90％以上的银杏资源，现银杏规模化栽培主要集中于叶用和核用，外种皮用银杏林极少。中国作为人口大国和农业大国，在农业种植中化学农药被广泛使用，随着近些年食品安全意识的不断提高，农产品农药残留越来越被消费者重视，国家对农药残留的限制也十分严格。同时在农产品出口时，农药残留是面对国外食品绿色壁垒非常严重的问题。而为了降低农药残留，新型生物源农药底毒、易降解等优点是替代传统化学合成农药的新热点。中国专利CN106561723A公开了“一种银杏外种皮防治病虫害的方法”(专利号201610949718.4)，该专利通过对银杏外种皮进行提取制备，可以对大田多种病虫害进行防治。

目前，关于银杏外种皮的研究多集中在银杏外种皮有效物质提取分离以及药用功能研究，没有关于提高银杏外种皮产量的相关研究报道。传统果树栽培上主要通过良种选育和水肥管理等方法来提高果树产量、单果重等，银杏因为童期长、品种界定难以及物种遗产背景复杂等因素，在育种上难度大、时间周期长。利用银杏外种皮提取制备生物农药，只依靠零散的废弃银杏种子显然不易实现规模化生产，营造外种皮用银杏林，提供质量稳定的原料尤为重要。外源激素在调控植物生长发育，促进结果增产等方面有较多应用实例，关于外源激素调控银杏种子生长的应用还未见报道。本申请围绕银杏外种皮产量的提高和以银杏酸为主的有效成分的提高，通过选用植物外源激素组合来综合提高银杏单株经济产量。

水杨酸是植物体内重要的信号分子，在植物免疫和抗病反应中发挥着重要作用。植物水杨酸的合成主要通过两条途径:异分支酸合成酶(Isochorismate synthase,ICS)途径和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase,PAL)途径，两者都需要中间代谢物分支酸。分支酸在异分支酸合成酶的作用下形成异分支酸，异分支酸在丙酮酸裂解酶(Isochorismate Pyruvate Lyase,IPL)的作用下合成水杨酸；此外，由分支酸合成的苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下形成苯甲酸脂中间体(Benzoate intermediates)或对羟基肉桂酸(Coumaric acid)，后经过一系列酶促反应后形成水杨酸(图2)及水杨酸经修饰后形成的相关衍生物(图3)。

水杨酸最早从柳树提取出来被用于治疗人类疾病，如阿司匹林(乙酰水杨酸)。植物由于其固着性，一直受到周围环境的各种胁迫，因此植物建立了复杂的免疫机制，可分为组成型防卫系统和诱导型防卫系统。组成型主要包括植物的物理性屏障和体内的抗菌物质，诱导型是在植物受到病原菌侵染而激活的主动防卫系统，包括一系列生理生化反应，水杨酸正是获得性抗性的信号分子。植物受到侵染后水杨酸会积累，植物感受到水杨酸积累后启动各种防御反应，如细胞壁的增厚、抗病相关蛋白的表达等。不仅如此，水杨酸对远端组织(未接触的组织)的抗性也有重要作用。水杨酸能诱导植物对病原菌产生抗性，植物受到侵染后侵染点水杨酸水平迅速升高，非侵染点在一段时间后也升高，在下次遭遇同种病原菌侵染时植物的抗性增强。

也就是说目前水杨酸在植物中的应用主要停留在提升抗性上的研究，包括，在银杏这种植物上施用水杨酸也是为了提高抗性，还没有关于利用水杨酸联合其余外源激素进行银杏种皮增产和提升银杏酸含量的研究报道。

参考文献

[1].Khadem,S.and R.J.Marles,Monocyclic phenolic acids；hydroxy-andpolyhydroxybenzoic acids:occurrence and recent bioactivity studies.Molecules(Basel,Switzerland),2010.15(11):p.7985-8005.

[2].Gellerman,J.L.,W.H.Anderson and H.Schlenk,Biosynthesis ofanacardic acids from acetate in Ginkgo biloba.Lipids,1974.9(9):p.722-725.

[3].Schultz,D.J.,N.S.Wickramasinghe and C.M.Klinge,Chapter Six-Anacardic Acid Biosynthesis and Bioactivity,in Recent Advances inPhytochemistry,J.T.Romeo,J.T.Romeo^Editors.2006,Elsevier.p.131-156.

发明内容

本发明的目的是针对背景技术提出的问题，提供一种提高银杏外种皮银杏酸有效经济产量的方法。

本发明是采用如下技术解决方案来实现上述目的：

一种提高银杏外种皮银杏酸有效经济产量的方法，采用外源激素喷施银杏，所述的外源激素是包含浓度NAA100～500mg/L、6-BA50～300mg/L、水杨酸100～300mg/L的混合溶液。

在该浓度范围内的外源激素混合溶液与对照相比，均能够达到显著的提高银杏外种皮银杏酸有效经济产量的效果。

进一步优选NAA100mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸100mg/L；

NAA100mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸200mg/L；

NAA100mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸300mg/L；

NAA300mg/L+6-BA50mg/L+水杨酸100mg/L；

NAA300mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸300mg/L；

NAA300mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸100mg/L；

NAA500mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸200mg/L；

或NAA300mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸200mg/L；

的浓度组合激素混合溶液效果更好。

再进一步优选：NAA100mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸200mg/L；

NAA100mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸300mg/L；

NAA300mg/L+6-BA50mg/L+水杨酸100mg/L；

NAA300mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸300mg/L；

NAA300mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸100mg/L；

或NAA300mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸200mg/L；

的浓度组合激素混合溶液。

最优选NAA300mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸200mg/L的浓度组合激素混合溶液。

本发明外源激素包含浓度NAA100～500mg/L、6-BA50～300mg/L、水杨酸100～300mg/L的混合溶液用于提高银杏外种皮产量。

在该浓度范围内的外源激素混合溶液与对照相比，均能够达到显著的提高银杏外种皮产量的效果。

进一步优选：

NAA100mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸100mg/L；

NAA100mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸200mg/L；

NAA100mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸300mg/L；

NAA300mg/L+6-BA50mg/L+水杨酸100mg/L；

NAA300mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸300mg/L；

NAA300mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸100mg/L；

NAA500mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸100mg/L；

或NAA500mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸200mg/L；

的浓度组合激素混合溶液效果更好。

再进一步优选：

NAA100mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸300mg/L；

NAA300mg/L+6-BA50mg/L+水杨酸100mg/L；

NAA300mg/L+6-BA100mg/L+水杨酸300mg/L；

或NAA300mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸100mg/L；

的浓度组合激素混合溶液。

最优选NAA300mg/L+6-BA300mg/L+水杨酸100mg/L的浓度组合激素混合溶液。

本发明外源激素包含浓度NAA300mg/L、6-BA100mg/L、水杨酸200mg/L的混合溶液，或者包含浓度NAA100mg/L、6-BA100mg/L、水杨酸200mg/L的混合溶液；或者包含浓度NAA300mg/L、6-BA50mg/L、水杨酸100mg/L的混合溶液；或者包含浓度NAA300mg/L、6-BA100mg/L、水杨酸300mg/L的混合溶液用于提高银杏种子外种皮中银杏酸含量。

进一步优选：包含浓度NAA300mg/L、6-BA100mg/L、水杨酸200mg/L的混合溶液，或者包含浓度NAA100mg/L、6-BA100mg/L、水杨酸200mg/L的混合溶液；或者包含浓度NAA300mg/L、6-BA50mg/L、水杨酸100mg/L的混合溶液。

最优选包含浓度NAA300mg/L、6-BA100mg/L、水杨酸200mg/L的混合溶液。

本发明所述的一种提高银杏外种皮产量和/或银杏酸含量的方法，所述的激素喷施时间为银杏种皮分化期。

本发明所述的一种提高银杏外种皮产量和/或银杏酸含量的方法，所述的银杏种皮分化期为银杏授粉后40～60天。

本发明所述的一种提高银杏外种皮产量和/或银杏酸含量的方法，所述的喷施方法为对整个银杏果枝喷药，优选喷洒到银杏果表皮，进一步优选喷洒至银杏果枝或者果皮表面滴液为度。

上述喷施方法换算下来基本是按照每亩银杏种植密度为4*6m-5*6m，每亩株数为20-30株，每亩喷施激素120g～225g NAA、40g～75g 6-BA、80g～150g水杨酸的量进行喷施。

本发明所述的一种提高银杏外种皮产量和/或银杏酸含量的方法，所述的NAA和6-BA纯度＞98％，水杨酸纯度＞95％。

本发明所述的一种提高银杏外种皮产量和/或银杏酸含量的方法，外源激素溶液中添加表面活性剂。目的在于增强溶液稳定性和附着性。

所述的一种提高银杏外种皮产量和/或银杏酸含量的方法，优选0.1％的聚乙二醇600非离子型表面活性剂。

本发明方法中提高银杏外种皮产量和银杏酸含量，可以用银杏外种皮单株经济产量来表征，计算方法为：单株经济产量(g)＝干外种皮株产×银杏酸含量(％)×1000。

本发明采用上述技术解决方案所能达到的效果是：

目前没有人研究过银杏外种皮的生长状况和影响因素，也没有人研究过银杏酸在植物体内含量和影响因素，本发明通过研究首次发现采用外源激素NAA，6-BA以及水杨酸的组合能够促进银杏外种皮生长和银杏酸积累，进而综合调控银杏外种皮的经济产量；还可以根据需要采用不同的外源激素浓度组合对银杏外种皮生长和银杏酸积累分别进行调控。

与传统技术相比，本发明方法操作简便，使用量小,工作量少，效果明显，实用性强，具有非常好的应用前景。

本发明经过大量基础性研究获得相关数据后确定本发明技术方案，并通过实验验证。

银杏外种皮经济产量计算

经济产量是植物在整个生长周期中所累积的可供人类食用或作其它用途的产品的重量，通常用单位面积上生产的鲜重或干重表示。核用银杏的经济产量即指最终能收获的种核的重量。通过经济产量可以计算果农的收益。本发明借鉴核用银杏产量概念，单株银杏外种皮的经济产量是指每株银杏最终获得的银杏酸的产量。

株产：选择树龄、树势、栽植管理一致且结果正常的成年银杏树为实验对象，人工采集银杏种实测定。选择25年生左右生长健壮的银杏雌树，于9月中下旬银杏种实成熟时人工采收，随机测量3株，连续测定3年，取平均值。

鲜重(fresh weight,FW)和干重(dry weight,DW)测定：测定银杏种实百粒重，去核脱皮，测定外种皮鲜重，于恒温干燥箱105℃杀青20min，后60℃恒温干燥至恒重测定外种皮干重，得出银杏外种皮含水率。所有测量均3次重复取均值。

出核率(％)＝种核鲜重/种实鲜重×100％；随机测定100粒银杏种实。

出皮率(％)＝外种皮鲜重/种实鲜重×100％；随机测定100粒银杏种实。

干外种皮株产(kg)＝种实株产×出皮率×(1-外种皮含水率)；随机测定3株取均值。

单株经济产量(g)＝干外种皮株产×银杏酸含量(％)×1000。

银杏酸含量的测定

采用超声波法提取银杏酸，RP-HPLC(Reversed-Phase High Performance LiquidChromatographic)测定银杏酸。

(1)银杏酸标准溶液配置：

称取总银杏酸标准品10mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，用0.45μm滤膜过滤备用。

(2)银杏酸的提取：

采用鼓风烘箱在80℃下对银杏新鲜外种皮进行烘干，至含水量为8％，取干燥后外种皮用粉碎机粉碎，再过80目筛，精密称取2g于50mL离心管中，加入25mL石油醚，超声波提取30min，提取液6000r/min离心20min，残渣重复提取2次，合并上清液，减压浓缩得蒸膏，浓缩蒸膏用无水甲醇定容至25mL，经0.45μm微孔滤膜过滤得银杏外种皮样品银杏酸提取液，供HPLC分析。

(3)RP-HPLC测定：

InertSustain C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)；

流动相：甲醇-3％乙酸(98:2)；

检测波长：310nm；

流速：1mL/min；

进样：10μL；

柱温：35℃。

(4)样品测定：取样品滤液10μL进液相色谱分离测定，根据色谱峰保留时间定性，外标峰面积法进行定量。

(5)计算样品银杏酸含量：

根据待测样品色谱峰面积，由标准回归方程式中得样品液中银杏酸含量，再计算出样品中银杏酸的含量。

试样中银杏酸含量按下式进行计算：

式中：m₁为根据回归方程计算出的样液中的银杏酸的量(μg)；v为样品的定容体积(mL)；m₀为样品的取样量(g)。

本发明以湖南省永州市东安县银杏示范园20年生银杏中南林2号为研究对象，从4月银杏授粉至9月15日种实完全成熟，每个月1日和15日采样一次，观察银杏种实生长，测定种实干重、鲜重和内含物。

本发明通过在银杏种实发育各阶段，动态观察银杏种实和外种皮组织结构的发育，测定外种皮各时期内含物含量的变化与积累，明确了银杏外种皮生长发育的规律，划分了银杏种实生长阶段。得到了以下结论：

(1)通过观测银杏种实及外种皮发育发现：银杏种实、外种皮生长发育时期较一致，5月1日至7月1日为银杏种实、外种皮鲜重的快速增长期，5月15日至7月15日为银杏种实、外种皮干重的快速增长期，干重增长晚于鲜重。结果见图5-8。

(2)银杏种皮生长的显微观察的发现：银杏种皮于授粉后30～60d(5月1日～6月1日)快速分化形成，银杏中种皮于授粉后60～90d(6月1日～7月1日)快速木质化，且木质化由种实珠孔端向合点端逐渐加强；银杏在胚珠时期即已形成分泌腔，在种实成熟过程中分泌腔不断增大，分泌腔内含大量油脂。结果见图9-11。

(3)银杏外种皮生长发育可划分为：外种皮生长前期(授粉后0～30d)、外种皮生长旺盛期(授粉后30～90d)、外种皮生长后期(授粉后90～120d)和外种皮成熟期(授粉后120～165d)四个阶段。见图12。

(4)银杏外种皮内含物测定发现：可溶性蛋白含量在5月1日至6月1日迅速升高，6月1日至7月1日含量最高，7月1日后逐渐降低。可溶性糖含量在6月1日和8月15日分别有两次高峰，总体上呈增加趋势。淀粉含量在6月15日最高，同时期可溶性糖含量为谷值，总体变化为单峰模式。脂肪含量在银杏授粉后至种实生长旺盛期不断增加，7月1日之后含量缓慢下降又稍有回升。银杏酸在外种皮发育过程中整体呈现降低、升高、再降低的变化规律，种皮分化期银杏酸含量降低，中种皮木质化期银杏酸含量升高，种实成熟期银杏酸含量又逐渐下降。结果见图13-16。

根据前期对于银杏种实及外种皮发育动态观察和外种皮内含物的动态含量分析，我们发现在授粉后40～60d(5月10日～6月1日)处于种实种皮分化期，也是外种皮生长期前。此时种实形态分化较为明显，其重量、皮厚和外种皮中内含物的含量开始增长，此时通过喷施激素可以作为外源信号加快种皮细胞对代谢产物的合成，达到可预期的外种皮和银杏酸产量的提高。

外源激素处理对银杏外种皮增产的研究：

通过分析激素与银杏酸含量之间的相关性，发现水杨酸(SA)激素与银杏酸含量之间存在显著正相关(相关系数为0.71)。因此，以200mg/L的SA配上100mg/L的NAA、6-BA、ABA、GA₃、CTKs和IAA激素分别处理下，开展探究促进外种皮中银杏酸含量提高的预试验，结果如下表1。

表1

组合	银杏酸含量(％)
		对照(清水)	5.60±0.06
SA	5.91±0.07
		SA+NAA	6.53±0.12
SA+6-BA	6.67±0.09
		SA+ABA	5.12±0.11
SA+GA<sub>3</sub>	5.41±0.07
		SA+CTKs	6.17±0.06
SA+IAA	6.46±0.10

根据激素配比处理初步试验探究，发现NAA和6-BA与SA的搭配使得外种皮中银杏酸含量增高明显，因此采用NAA、6-BA和SA 3因素3水平的正交试验设计，研究最优处理配方。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

以湖南省永州市东安县银杏示范园20年生银杏中南林2号为研究对象，随机选择水肥管理一致且开花结果正常的银杏雌树。

1.1.2药品与试剂

水杨酸、乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)、β-巯基乙醇、交联聚乙烯吡咯烷酮(Crosslinking polyvingypyrrolidone,PVPP)、苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)、NADPNa₂、乙醇、甲醇、硼酸、硼砂、冰醋酸、甘油(均为分析纯)，国药集团试剂；p-香豆酸、Leupeptin、L-苯丙氨酸、G-6-pNa、反式肉桂酸，上海生物工程股份有限公司；NAA(Naphthylacetic acid)、6-BA(6-Benzylaminopurine)，美国Sigma公司。

1.1.3主要实验仪器

主要仪器如表2所列。

表2主要仪器设备

1.2方法

1.2.1激素处理正交设计

以中南林2号为银杏处理品种，分别以3种不同激素为试验因素、3个浓度梯度为试验水平，采用随机区组设计，6月1日喷施，每次激素喷施3株银杏雌树，3次重复。喷雾量以银杏种实均匀湿润滴水为度。正交设计如表3所示。

表3正交试验设计

1.2.2银杏酸含量测定

测定方法同前。

2结果与分析

2.1激素处理组合的优化

根据设计的正交试验，以3种激素3个水平进行的试验结果如表4。由表4可知，处理组合A₂B₃C₁的干外种皮株产最高，为13.10kg，银杏种实单果大，外种皮厚(图18)；处理组合A₃B₁C₃的干外种皮株产最低，仅为9.88kg，与对照组相差不明显。处理组合A₂B₁C₁的银杏酸含量最高，为6.86％，处理组合A₃B₂C₁的银杏酸含量最低，为5.51％，比对照组低0.13％。综合计算银杏外种皮单株有效经济产量，处理组合A₂B₃C₁有效经济产量最高，为825.26g，是对照组的1.71倍；处理组合A₃B₁C₃有效经济产量最低，为555.26g，也高于对照组。

表4正交试验结果

对正交试验进行方差分析(表5)，NAA处理下干外种皮株产、银杏酸含量及有效经济产量均有显著差异(P<0.05)；6-BA处理下干外种皮株产和银杏酸含量有显著差异，但对有效经济产量影响不显著(P>0.05)；SA处理下银杏酸含量和有效经济产量有显著差异，但对干外种皮株产影响不显著。

表5正交试验方差分析

为进一步了解不同因素水平对银杏外种皮生长及银杏酸积累的影响，对正交试验结果进行极差分析。由表6可知，不同因素对干外种皮株产的影响程度为：NAA>6-BA>SA，促进银杏外种皮生长的最佳组合为A₂B₃C₁，结合方差显著性分析，NAA和6-BA对干外种皮株产有显著影响，而SA无显著影响，且中等水平的NAA和高水平的6-BA为最优组合；不同因素对银杏酸含量的影响程度为：SA>NAA>6-BA，促进外种皮银杏酸积累的最佳组合为A₂B₂C₂，结合方差显著性分析，3因素均显著影响银杏酸的含量，且各因素中等水平组合为最优；不同因素对银杏外种皮有效经济产量的影响程度为：NAA>SA>6-BA，促进银杏外种皮生长及银杏酸积累的最佳组合为A₂B₂C₂，结合方差显著性分析，NAA和SA对外种皮有效经济产量有显著影响，而6-BA无显著影响，且各因素中等水平组合为最优。

根据以上分析结果，综合筛选出促进银杏外种皮生长及银杏酸积累的最佳激素组合为A₂B₂C₂，即300mg/L NAA+100mg/L 6-BA+200mg/L SA。

表6正交试验结果极差分析

注：ki为同一水平指标平均值，i为正交试验的水平号。

本发明通过设计不同因素水平正交试验，研究外源激素处理对银杏外种皮产量及银杏酸含量的影响，得出以下结论：

(1)不同因素对干外种皮株产的影响程度为：NAA>6-BA>SA，NAA和6-BA对干外种皮株产有显著影响，而SA无显著影响，促进银杏外种皮生长的最佳组合为A₂B₃C₁。

(2)不同因素对银杏酸含量的影响程度为：SA>NAA>6-BA，3因素均显著影响银杏酸的含量，促进外种皮银杏酸积累的最佳组合为A₂B₂C₂，

(3)不同因素对银杏外种皮有效经济产量的影响程度为：NAA>SA>6-BA，NAA和SA对外种皮有效经济产量有显著影响，而6-BA无显著影响，促进银杏外种皮生长及银杏酸积累的最佳组合为A₂B₂C₂。(图17)

综合筛选出促进银杏外种皮生长及银杏酸积累的最佳激素组合为：A₂B₂C₂，即300mg/L NAA+100mg/L 6-BA+200mg/L SA。

附图说明

图1.银杏酸的合成途径；

图2.水杨酸合成途径；

图3.水杨酸合成途径和SA衍生物；

图4.银杏种实结构；

a为银杏种实切面图；b为银杏种实示意图；

图5.银杏种实发育过程纵切图；

图6.银杏种实发育过程中单粒重的变化；

图7.银杏种实发育过程中纵横经及体积的变化；

图8.银杏种实发育过程中外种皮的变化；

图9.银杏种皮分化过程显微观察；

图10.银杏中种皮木质化过程显微观察；

图11.银杏外种皮分泌腔显微观察；

图12.银杏种实发育阶段划分；

图13.银杏外种皮发育过程中可溶性蛋白含量的变化；

图14.银杏外种皮发育过程中可溶性糖和淀粉含量的变化；

图15.银杏外种皮发育过程中粗脂肪含量的变化；

图16.银杏外种皮发育过程中银杏酸含量的变化；

图17.银杏外种皮5种银杏酸的HPLC图；

图18.本发明激素处理银杏种实和对照处理的外观图；

图19.本发明激素处理银杏种实和对照处理的宏观图。

具体实施方式

本发明在湖南省永州市东安县银杏栽培示范园进行,地理位置为北纬26°

21′38″、东经111°5′12″，该地区气候属中亚热带山区季风湿润气候，年平均气温17.8℃，年平均降水量1330毫米，土壤微酸性。下面结合实施例说明本发明的具体内容，而不会形成对本发明的限制。

实施例1：

本发明一种喷施外源激素促进银杏外种皮增产的方法，所述方法包括外源激素的配制、喷施时间的确定、喷施组合的选择等，按如下步骤进行：

(1)树体管理及人工授粉：选择15～20年生开花结果正常的银杏雌树，正常水肥管理。银杏授粉期选择晴朗天气，通过花粉水溶液喷雾法人工辅助授粉。

(2)外源激素配置：外源激素以纯化水为溶剂，添加0.1％聚乙二醇600非离子型表面活性剂以增强溶液稳定性和附着性。质量体积比浓度分别为：

①萘乙酸(NAA)喷施剂浓度为300mg/L，

②6-苄氨基嘌呤(6-BA)喷施剂浓度为50mg/L、6-BA300mg/L，

③水杨酸喷施剂浓度为100mg/L；

(3)激素喷施时间：在银杏种皮分化期即银杏授粉后40～60天，此时银杏外种皮进行快速分化，同时外种皮开始快速增长增厚；

(4)喷施方法；选择晴朗无风天气，手持喷雾器对整个银杏果枝均匀喷药，至果皮表面滴液为度。

(5)上述方法中所述，对于促进银杏种子外种皮增产的激素喷施组合为300mg/LNAA+300mg/L 6-BA+100mg/L水杨酸，对于促进银杏种子外种皮中银杏酸含量提高的激素喷施组合为300mg/L NAA+50mg/L 6-BA+100mg/L水杨酸，对于综合提高银杏外种皮银杏酸产量的激素喷施组合为300mg/L NAA+300mg/L6-BA+100mg/L水杨酸。以喷施清水为对照。

(6)上述方法中所述，于9月中下旬银杏种子自然成熟时人工采收，分别称量株产、种子百粒鲜重，人工脱籽去皮，称量外种皮百粒鲜重，自然晾干或晒干，称量外种皮百粒干重，高效液相色谱法测定外种皮中银杏酸含量。

(7)实施结果表明，激素处理组合300mg/L NAA+300mg/L 6-BA+100mg/L水杨酸的干外种皮株产最高达到13.1kg，为对照组的1.54倍，银杏种实单果大，外种皮厚(图18)；激素处理组合300mg/L NAA+50mg/L 6-BA+100mg/L水杨酸的银杏酸含量最高达到6.86％，为对照组的1.22倍。综合计算银杏外种皮单株有效经济产量，激素处理组合300mg/L NAA+300mg/L 6-BA+100mg/L水杨酸的有效经济产量最高达到825.26g，为对照组的1.71倍。

实施例2：

2019年5月25日，对东安县银杏示范基地的20亩丰产区银杏树(株行距4*6m～5*6m，每亩20～30棵)进行最优配方A₂B₂C₂——300mg/L NAA+100mg/L6-BA+200mg/L水杨酸喷施处理试验，清水为对照组。对每株树进行有效喷施需配比液20L～25L(根据树体大小等略有区别)，每亩所需配比液400L～750L，每亩需使用120g～225g NAA、40g～75g 6-BA、80g～150g水杨酸。9月15日进行种皮采收、测产，每亩银杏干外种皮产量、银杏酸含量和有效经济产量平均值分别为321.42kg、7.73％和24.85kg(见表7)，分别是对照组的1.50、1.38和2.06倍，极大提高了银杏外种皮的有效经济产量(图19)。

表7亩产实验结果