一种突变基因及其用于构建斑色鱼鳞癣小型猪模型的用途

文档序号:1485956 发布日期:2020-02-28 浏览:8次 >En<

阅读说明:本技术 一种突变基因及其用于构建斑色鱼鳞癣小型猪模型的用途 (Mutant gene and application thereof in constructing speckled ichthyosis miniature pig model ) 是由 赵建国 王霄 曹春伟 海棠 周琪 王红梅 张颖 贾启涛 郑千涛 于 2018-08-21 设计创作,主要内容包括:本发明提供一种小型猪的ABCA12突变基因,所述突变基因与野生型猪ABCA12基因相比,具有IVS49-727A&gt;G的突变。本发明提供了一种构建体,所述构建体包含所述ABCA12突变基因。本发明还提供了一种重组细胞,所述重组细胞由所述构建体转化受体细胞获得。本发明提供了一种制备人类斑色鱼鳞癣小型猪模型的方法,所述方法包括:改变小型猪的ABCA12基因,使ABCA12基因的位于第49号内含子的第727位碱基由A变为G。利用本发明提供的ABCA12突变基因制备大型人类斑色鱼鳞癣猪模型,研究人类斑色鱼鳞癣的发病机理,对于临床预防、诊断和治疗人类斑色鱼鳞癣具有重大的指导意义。(The invention provides a mini-pig ABCA12 mutant gene, which has IVS49-727A &gt; G mutation compared with a wild pig ABCA12 gene. The invention provides a construct comprising the ABCA12 mutant gene. The invention also provides a recombinant cell obtained by transforming a receptor cell with the construct. The invention provides a method for preparing a human ichthyosis small pig model, which comprises the following steps: the ABCA12 gene of miniature pig is changed to change the 727 site base of No. 49 intron of ABCA12 gene from A to G. The ABCA12 mutant gene provided by the invention is used for preparing a large human ichthyophthiriasis pig model, researching the pathogenesis of the human ichthyophthiriasis, and has great guiding significance for clinically preventing, diagnosing and treating the human ichthyophthiriasis.)

一种突变基因及其用于构建斑色鱼鳞癣小型猪模型的用途

技术领域

本发明属于基因工程领域,具体涉及一种ABCA12突变基因。本发明还涉及该突变基因用于构建斑色鱼鳞癣小型猪模型的用途以及一种斑色鱼鳞癣小型猪模型的构建方法。

背景技术

广西巴马小型猪遗传性稳定,表型特征一致性好,性情比较温和,体型不大,各个器官系统与人体极为相似,适于医学、生物学实验应用。

斑色鱼鳞癣(Harlequin ichthyosis)是一种遗传性皮肤疾病,是常染色体隐性先天性鱼鳞癣中最严重的一种。患病新生儿出生时表现为皮肤角质化层厚度增加,全身覆盖盔甲样鳞屑,还通常伴有异常的面部特征,包括睑外翻,唇外翻,变形的耳朵和鼻子。

斑色鱼鳞癣由ATP结合盒转运子A12(ATP binding cassette A12,ABCA12)基因的功能丧失突变引起。ABCA12蛋白定位于表皮角质化细胞的板层颗粒中,功能与脂质转运到细胞外间隙相关。因此,ABCA12基因在皮肤细胞中的脂质转运、细胞间隙脂质层形成以及细胞表皮脂质屏障功能的形成中发挥重要作用。

现有的斑色鱼鳞癣模型为小鼠模型。这些小鼠模型能模拟一部分疾病表型和帮助研究病理机制,但是还存在一些不足。小鼠的皮肤结构与人类不尽相同,因此,在研究疾病病理上存在一些局限。斑色鱼鳞癣小鼠出生几小时后,就会死于脱水,使其不能成为一个研究治疗方法和筛选治疗药物的理想模型。所以,亟需在与人类生理结构相近的大型动物中构建该疾病的模型,从而为针对该疾病的病理研究、药物筛选、药效评价等研究提供支持。

发明内容

针对现有技术的不足,本发明提供了一种小型猪的ABCA12突变基因,具有该突变基因的转基因家系小型猪的表型和遗传模式与人类斑色鱼鳞癣相符合,可以作为该人类遗传疾病的大动物模型,从而为针对该疾病的病理研究、药物筛选、药效评价等研究提供支持。

一方面,本发明提供了一种小型猪的ABCA12突变基因,所述突变基因与野生型猪ABCA12基因相比,具有49号内含子的第727位碱基由A变为G的突变(IVS49-727 A>G的突变)。

优选地,所述ABCA12突变基因的49号内含子的序列如SEQ ID NO:109所示:

GTAAATAGAGTGCGGGAACTTTAATCAGATGACACAATGTTAGGATGATAGACGGGGAAAGGTAATCCTGTGCAATGTACATCGATTATGAATGTCCGCAATTGAACTATTTTGTTCTCATAGTCATGGGAGCAAGTCAGAAAGGTACCGTGGTGAGACTCCTGCTCCTCTGGTGGAACAGGGCCTAAGCAATCTTTTAAAAAACAAATTTCTGGTGACTTATGGCCCTCCTAACTCAACTACGACTCCCTATTACCTATCACCCATAGTTCAGCATCCCTCAGCTTAGGATGCAAGGCCTTTTATTATGTGGCCTCATCTGAATTTCCCGTATTTTTCACTACGAAACCCTCTCTTATCAGTCAGTCTGAGCGACTCCCAGTTCTACAGACACTCACTGCCCCCTCGCATCACCCTGCCCTTTCTTCAGCTGTGCTTTCTCCTGGAGTTGGTCTTTTCACAAACTCTACAATTTCTAATCCTACTAGTCCTTTAAGAAATAGTTCCTCCATGAAGTAGGCCCTTCCAAACCATTAAGTAAAAAAGCTACCAAAGCATCTTCTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTGGCCGCCCCCAGGCGGGCCATGGACCAGATCCAAGCTGCAATTATGGCAACAAAGGATCCTTTAACCCGTTGCAGAGATGCTGCTGATCCTGTTGGAGCACAGCAGGAATTCTACTACTAATGCATTTTATCTGTGCCTTTTTAATAAGTTGACCTTGAAAGGTTCATCCTTTCAGTATAATTATCATATAATATTAAAAGGACTAGATATGTTTAGAATCAAGAGACTTGTTTACATCCTATATCCTAGCCTTACCCTAGCACTCTGTATATCCTGAAGCCAATTATTTAATTTCCATTAACTTTCATATTAAGTGGACATGGTGATACCTAAGATTGCCTTCAGTTATCATATCATAGTCCAAGAAATTAGAATTATGTAATCAATTACAGGTTAACTAGTTACAATACAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCAACCGAATATGGAGTATAAGGCATAATGAAAAAAGCCTAATAAGCCTAATATTATTTTGGAAACAAAATGTGCCAAAATGTAGTTCTTGAGTCAAAGTTTCAAAGCACTTACAAGAAATACTGTGATTGATAAAATGGGTTTTCCAGGTAAGAGAGATGGCCTCAAATTTGAGAAGAAACAGTCGTAAACTCTATGTGAAGACATTTAATTTACATTAAAAGATTTTTTTTGTTGTTCTGCAGGGGAAAAGACATTTTAGGGAGTTCAAACAGTATTTCCTAGGTGCCATAATGAAAAAGTTAAGCCTATGCTTGTGAACTTAAAACCCAGTTTTCTGTGCTCAGAATGCTGATGTGATTCTGTCTTTTCAG。

优选地,所述小型猪为巴马小型猪。

另一方面,本发明提供了一种构建体,所述构建体包含所述ABCA12突变基因。

本发明还提供了一种重组细胞,所述重组细胞由所述构建体转化受体细胞获得。优选地,所述重组细胞为猪细胞,更优选地为巴马小型猪细胞。

根据本发明的实施例,所述重组动物细胞的基因组中具有编码突变型ABCA12的核酸序列,其中,与野生型ABCA12相比,所述突变型ABCA12的蛋白质翻译提前终止。

再另一方面,本发明提供了一种制备人类斑色鱼鳞癣小型猪模型的方法,所述方法包括:

改变小型猪的ABCA12基因,使ABCA12基因的位于第49号内含子的第727位碱基由A变为G。

在本发明的一些实施例中,根据实际需要,利用基因工程技术,改变正常猪的ABCA12基因,使第727位碱基由A变为G,获得人类斑色鱼鳞癣猪模型。在另一些实施例中,也可以利用基因工程技术改变除猪以外的其它动物的ABCA12基因的相应位点,从而获得所需的大型或小型人类斑色鱼鳞癣动物模型,例如人类斑色鱼鳞癣猴模型,人类斑色鱼鳞癣小鼠模型,等等。

本发明还提供一种筛选ABCA12基因突变的人类斑色鱼鳞癣小型猪模型的方法,所述方法包括以下步骤:

1)提取待测生物样品的核酸DNA;

2)确定所述核酸DNA的序列;

3)所述核酸的序列或其互补序列,与野生型ABCA12基因相比具有IVS49-727 A>G突变,所述突变是人类斑色鱼鳞癣的指示;

所述生物样品选自血液、皮肤、毛发和肌肉中的至少一种。

优选地,在步骤2)中,确定所述核酸的序列包括如下步骤:

以DNA为模板,采用猪ABCA12基因的特异性引物,进行PCR,得到扩增产物,并对扩增产物进行测序。

优选地,所述正向引物(F)序列如SEQ ID NO:107所示,反向引物(R)序列如SEQ IDNO:108所示。

SEQ ID NO:107 CAGTCAGTCTGAGCGACTCC,

SEQ ID NO:108 ACAGAGTGCTAGGGTAAGGCTA。

本发明还提供一种筛选ABCA12基因突变人类斑色鱼鳞癣小型猪模型的试剂盒,包括液态的或粉末状的猪ABCA12基因的特异性引物。所述试剂盒可以包括PCR所需的其它试剂,如缓冲液、dNTP、聚合酶;还可以包括回收PCR产物所需的试剂和耗材,如溶胶液、收集管、洗涤液等。以待测样品的DNA为模板,利用所述试剂盒和本发明提供的筛选ABCA12基因突变人类斑色鱼鳞癣猪的方法进行检测,操作简便,能快速鉴别大量样品。

本发明还提供了本发明的突变基因、构建体、重组细胞或试剂盒在制备用于筛选治疗和/预防人类斑色鱼鳞癣的动物模型中的用途;优选地,所述动物模型为哺乳动物模型;更优选地,所述哺乳动物为小鼠、猴或小型猪。

为获得人类斑色鱼鳞癣的大型动物模型,本发明对巴马小型猪进行ENU(N-乙基-N-亚硝基脲)化学诱变,向野生型雄性小型猪注射ENU,得到G0代小型猪;然后将其与同品种的野生型雌性小型猪交配,获得G1代小型猪;将得到的G1代雄性小型猪与同品种的野生型雌性小型猪交配,获得G2代小型猪;所述的G1代雄性小型猪与G2代雌性小型猪交配,获得G3代小型猪,所述的G3代小型猪进行表型筛选,获得具有斑色鱼鳞癣表型的家系小型猪。

本发明的家系小型猪的人类斑色鱼鳞癣性状遗传模式符合常染色体单基因隐性遗传的孟德尔遗传定律。统计G3代中野生型个体和突变表型个体的数量,并进行比对,由于野生型:突变型为37:13,比例约为3:1,符合孟德尔隐性遗传3:1的分离定律;同时,在突变体中雌性与雄性的比例为22:28,接近1:1,表明该突变表型与性别无关,从而确定所述突变表型是常染色体隐性遗传的。

在根据本发明的一个实施方案中,所述ENU的注射剂量为50~100mg/kg,更优选地,所述ENU的注射剂量为60~70 mg/kg;进一步优选地,所述ENU的注射剂量为65 mg/kg。

在根据本发明的一个实施方案中,还包括:检测ENU注射后的野生型雄性小型猪的***品质,当注射后的野生型雄性小型猪的***品质回复正常水平后,再使注射后的野生型雄性小型猪与同品种野生型雌性小型猪交配。

本发明的具有斑色鱼鳞癣表型的家系小型猪的表型筛选是通过表型观测,皮肤渗透实验(Skin permeability assay)和经皮失水实验(TEWL)测定实现的。

表型分析结果显示斑色鱼鳞癣模型猪具有干燥、坚硬、开裂的皮肤,并且具有眼睑外翻的表型。

通过全基因组关联分析,确定了人类斑色鱼鳞癣小型猪模型的致病基因为ABCA12基因,对ABCA12基因的53个外显子及外显子边界全测序,结果显示,所述突变基因的突变位点位于第49号内含子,能够导致蛋白质翻译的提前终止。具体而言,所述突变基因导致mRNA的剪切改变,即在第49号和第50号外显子之间引入132个碱基的***,从而导致蛋白质翻译的提前终止。根据数据检索得知,ABCA12基因在人类、猴、猪、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠、大鼠等哺乳动物中十分保守,因此,利用本发明提供的ABCA12突变基因制备大型人类斑色鱼鳞癣猪模型,研究人类斑色鱼鳞癣的发病机理,对于临床预防、诊断和治疗人类斑色鱼鳞癣具有重大的指导意义

附图说明

以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:

图1为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型(Mu)和野生型广西巴马小型猪(WT)的全身表型;

图2A为野生型广西巴马小型猪的基因型鉴定结果;

图2B为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型的基因型鉴定结果,箭头所示为基因编码区的突变位点;

图3A为野生型广西巴马小型猪的皮肤表型;

图3B为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型的皮肤表型。

图4为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型的皮肤中ABCA12蛋白的表达量;

图5为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型基因组上突变导致mRNA剪接改变的模式图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步说明本发明,应当理解,实施例仅用于进一步说明和阐释本发明,并非用于限制本发明。

广西巴马小型猪购自第三军医大学,在中国科学院动物研究所北方大动物研究基地繁育。

ENU购自Sigma(N8509 bulk package)。

实施例1人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪遗传家系的建立

1)向15头广西巴马小型猪公猪注射ENU,注射计量为65mg/kg,注射频率为每周一次,连续三周。

2)***品质检测,诱变后公猪***进行品质检测,检测指标包括公猪***体积、***密度、***存活率和畸形率,至质量回复到正常水平后,与野生型母猪交配,产生G1代。

3)将步骤2)所述的G1代雄性小型猪共147头分别与同品种的野生型雌性小型猪交配,获得G2代小型猪;

4)将步骤2)所述的G1代小型猪与步骤3)所述的G2代母猪交配,获得G3代小型猪,

5)对步骤4)所述的G3代小型猪进行表型筛选,获得具有斑色鱼鳞癣表型的家系小型猪

6)将步骤4)所述的G3代小型猪中野生型个体和突变型个体的数目进行统计,并进行比对,确定遗传模式;

7)在该突变家系,G3代共出生37头野生个体,13头畸形个体,卡方检验(X2=0.0034,P=0.95)可以确定,该突变是符合孟德尔遗传模式的。

具体地,统计G3代中野生型个体和突变表型个体的数量,并进行比对,由于野生型:突变型为37:13,比例约为3:1,符合孟德尔隐性遗传3:1的分离定律;同时,在突变体中既有雌性与雄性的比例为22:28,接近1:1,表明该突变表型与性别无关,从而确定所述突变表型是常染色体隐性遗传的。

如图1所示,为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型和野生型广西巴马小型猪的全身表型;表型分析结果显示斑色鱼鳞癣模型猪具有干燥、坚硬、开裂的皮肤,并且具有眼睑外翻的表型。野生型的广西巴马小型猪,其表型为两头乌。

实施例2人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪遗传家系的基因突变定位

通过对G3代猪进行遗传连锁分析和基因克隆测序确定突变位置,提取G3代猪耳组织的DNA,并通过设计引物进行PCR反应,对PCR产物进行电泳分离,得到与ABCA12基因位点紧密连锁的突变位点。

1.DNA提取和质量检测

①取适量耳组织装入1.5ml离心管,用小剪刀剪碎,加入500μL的SNET溶液和10μL蛋白酶K,在摇床中55℃,200rmp震荡过夜消化;

②待组织消化完全,12000rmp离心1min使毛发沉淀,将上清转移到新的1.5ml EP管;

③加入500μL苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1,在常温下震荡30min;

④将溶液在12000rmp下离心15min,小心吸取200μL上清转移至新的离心管,避免中间蛋白层荡起;

⑤在上清中加入200μL的异丙醇,轻轻上下颠倒约1min,12000rmp离心15min;

⑥在离心管底部可见少量白色沉淀,倒掉溶液,注意不要倒掉沉淀,加入1ml 70%乙醇轻弹离心管底部使沉淀浮起;

⑦12000rmp离心5min,保留DNA沉淀,将乙醇吸出,室温晾干DNA;

⑧加入100μL TE,静置10min,用枪轻轻吹打溶液使DNA溶解;

⑨使用NANO drop对DNA溶液进行浓度和质量检测,DNA浓度应>100ng/μL,A260/280在1.8-2.0之间,A260/230>2;

⑩将DNA溶液稀释至100ng/μL,吸取2μL DNA溶液混合1μL10×loading buffer,在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳,120V,20min。质量合格的DNA样品应为主带清晰无断裂,无蛋白和RNA污染。

2.引物设计

针对NCBI数据库中目标基因ABCA12基因的外显子的序列,利用Primer5软件进行引物设计,设计好的引物序列(表1)送至Invitrogen进行引物合成。

表1引物序列

Figure BDA0001771910710000071

Figure BDA0001771910710000101

3.PCR扩增

使用天根2×Taq PCR mix进行PCR,25μL体系

Figure BDA0001771910710000102

Figure BDA0001771910710000111

使用如下PCR扩增程序:

在94℃下,预变性3min;94℃变性30s,50-65℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环;最后72℃温育10min。

得到的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中电泳检测产物,并用PCR产物纯化试剂盒去除引物二聚体,进行下步测序或酶切。

4.测序

将PCR产物用sanger法进行测序。

如图2A和图2B所示,图2A为本发明的巴马小型猪模型的基因型鉴定结果,箭头所示为基因编码区的突变位点,而图2B为野生型广西巴马小型猪的基因型鉴定结果,箭头所示为与图2A所示的突变位点对应的正常基因位点。图5为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型基因组上突变导致mRNA剪接改变的模式图。

实施例3人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪遗传家系的特征分析

本发明的具有斑色鱼鳞癣表型的家系小型猪的表型筛选是通过表型观测,皮肤渗透实验(Skin permeability assay)和经皮失水实验(TEWL)测定实现的。

表型分析结果显示斑色鱼鳞癣模型猪具有干燥、坚硬、开裂的皮肤,并且具有眼睑外翻的表型。

皮肤石蜡切片结果如图3所示,图3A为野生型广西巴马小型猪的皮肤表型;图3B为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型的皮肤表型。显示,人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型的皮肤角质层明显变厚,基底层出现紊乱。

实施例4 ABCA12的蛋白质的表达

通过对野生型巴马小型猪和突变型巴马小型猪的皮肤组织进行蛋白提取,随后利用蛋白进行Western Blot测定,检测ABCA12蛋白在小型猪皮肤中的表达。实验结果如图4所示,图4为本发明的人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪模型的皮肤中ABCA12蛋白的表达量;显示,在突变型小型猪的皮肤组织中,ABCA12蛋白不表达。

实施例5人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪遗传工程疾病动物模型制备

通过CRISPR/Cas9系统介导的高效遗传修饰,将ABCA12基因突变位点(IVS49-727A>G)靶向导入正常猪ABCA12基因相应序列,阳性猪表现为人类斑色鱼鳞癣表型并呈隐性遗传。

1.设计gRNA,以49号内含子为模板,设计可以打靶突变位点(IVS49-727 A>G)附近序列的gRNA;

2.体外切割实验鉴定步骤1中的gRNA打靶效率;

3.将Cas9质粒和步骤2中筛选到的gRNA质粒转染胎儿成纤维细胞之后,对阳性细胞进行筛选和鉴定。将筛选到的含有IVS49-727 A>G突变的细胞进行扩繁和冻存;

4.以步骤3中胎儿成纤维细胞作为核供体,进行体细胞核移植和胚胎移植,从而获得人类斑色鱼鳞癣巴马小型猪遗传工程疾病动物模型。

最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 一种突变基因及其用于构建斑色鱼鳞癣小型猪模型的用途

<130> DIC18110037

<160> 109

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agctatgccg tgaaaaggct 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgtaagac agatgcaggg a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaaaggtga tgggcaaggg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcttgagatg gctgtttgtg t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggggaccca cacagtcata 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccttgacac tgccctacag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagagagccc tggaatctgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taccgcactc atgcaaccat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccagatgt gcattggcag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggaaggtta cccccaaacc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tctgctgcta aatgccagga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccagtccatg tgggctatgg 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgctttcaca gacagccatg t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tctctgtgtg agcttgagcc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaagtgccc tgtctggttc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agtcacagcc tctttgccag 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgcatgtgct tgaccattag g 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tccagacagg acacgctaga 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

accaaggcca aacaaccaag 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctagcagcag caacaggagt a 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaactgtcca gcacctttgc 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caccagaact cttgtcaccc t 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gccaactgaa cacagaagca 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

acggtcggca ttaaccttgt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgctttctgg ggatccaagc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

attctctgct ggcttgctgt 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgcggcatta tgttggggat 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgggatgtaa ggacaaacgc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cctcactttt catgccagcg 20

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cactgcaaag cagctataac g 21

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ttctttttat tctgttcctg ttagg 25

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caatgttgtt aggaggtgcc a 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aaatggcttc cagtgcacga 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgttgttagg aggtgccact 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgacaccaga tgtttcgtgt tt 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tcactctcga gtgtcaacat gg 22

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tgaccctatg aaaactgcca c 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cctgtctcag acctgctctc 20

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

accatcaaaa ttgtgcataa cctgt 25

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

aactaggaag aaggtggatg ga 22

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gcacaactgg ctacattttc cc 22

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gcatttgaca aaggttgggt ga 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccacttgaga cgtaggaggg 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgtcggcatt tgctcaagga 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atcgattttg tgcctccaac t 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

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<212> DNA

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agatggagag gctcagtccc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caactcacct ctggaggcat 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttcaatcag gtgctgacct cc 22

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtggtgcat gatccagtta ag 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

ccatggctga aggttctact ga 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

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<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

gtgactggga gtggatggga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

cagggtcaca gccaagtcat 20

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

cctgtccttc ccccaaagac 20

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

taaagcctgg aggcaggaac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

tctgactgat tggctgcatg a 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

tgccagcacc tggctattac 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

tgcttagatt gttgacccct ct 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

gcatggaaag caaaaactgc t 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

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<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

ctcgatgtgg cctccacttt 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

tcccaccatc ctagtcacac t 21

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

accagtgctt tggccttctt 20

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

gtcttgaggg tgagtgggtg 20

<210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

aacaagccac cacagaattg c 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

gagccacagc ctcagactaa 20

<210> 97

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

gccatcagga gcaagatagc a 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

ttgcttaggc cctgttccac 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

tccaggtaag agagatggcc t 21

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

ggcgagtatg gtactgtggg 20

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

ccactttgca acatgtcccg 20

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

tctgtcatcc ctcagttccg 20

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

ttttcccttt ggttcccaca 20

<210> 104

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

acatgttcat gtaactgatg ggt 23

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

gctagtgaga gtgcgtgtgt 20

<210> 106

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

cctacccgtg acaaccttcc 20

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

cagtcagtct gagcgactcc 20

<210> 108

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

acagagtgct agggtaaggc ta 22

<210> 109

<211> 1385

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

gtaaatagag tgcgggaact ttaatcagat gacacaatgt taggatgata gacggggaaa 60

ggtaatcctg tgcaatgtac atcgattatg aatgtccgca attgaactat tttgttctca 120

tagtcatggg agcaagtcag aaaggtaccg tggtgagact cctgctcctc tggtggaaca 180

gggcctaagc aatcttttaa aaaacaaatt tctggtgact tatggccctc ctaactcaac 240

tacgactccc tattacctat cacccatagt tcagcatccc tcagcttagg atgcaaggcc 300

ttttattatg tggcctcatc tgaatttccc gtatttttca ctacgaaacc ctctcttatc 360

agtcagtctg agcgactccc agttctacag acactcactg ccccctcgca tcaccctgcc 420

ctttcttcag ctgtgctttc tcctggagtt ggtcttttca caaactctac aatttctaat 480

cctactagtc ctttaagaaa tagttcctcc atgaagtagg cccttccaaa ccattaagta 540

aaaaagctac caaagcatct tctttctttt ttttcttttt ttggccgccc ccaggcgggc 600

catggaccag atccaagctg caattatggc aacaaaggat cctttaaccc gttgcagaga 660

tgctgctgat cctgttggag cacagcagga attctactac taatgcattt tatctgtgcc 720

tttttaataa gttgaccttg aaaggttcat cctttcagta taattatcat ataatattaa 780

aaggactaga tatgtttaga atcaagagac ttgtttacat cctatatcct agccttaccc 840

tagcactctg tatatcctga agccaattat ttaatttcca ttaactttca tattaagtgg 900

acatggtgat acctaagatt gccttcagtt atcatatcat agtccaagaa attagaatta 960

tgtaatcaat tacaggttaa ctagttacaa tacaaaaaaa aaaaaaaaaa gccaaccgaa 1020

tatggagtat aaggcataat gaaaaaagcc taataagcct aatattattt tggaaacaaa 1080

atgtgccaaa atgtagttct tgagtcaaag tttcaaagca cttacaagaa atactgtgat 1140

tgataaaatg ggttttccag gtaagagaga tggcctcaaa tttgagaaga aacagtcgta 1200

aactctatgt gaagacattt aatttacatt aaaagatttt ttttgttgtt ctgcagggga 1260

aaagacattt tagggagttc aaacagtatt tcctaggtgc cataatgaaa aagttaagcc 1320

tatgcttgtg aacttaaaac ccagttttct gtgctcagaa tgctgatgtg attctgtctt 1380

ttcag 1385

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