阅读说明：本技术 一种玉米小籽粒突变体及其应用 (Corn small-grain mutant and application thereof ) 是由 关海英 汪黎明 刘铁山 董永斌 鲁守平 何春梅 刘春晓 董瑞 刘强 王娟 于 2018-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程和分子生物学技术领域,具体涉及一种玉米小籽粒突变体及其应用。本发明提供了一种玉米籽粒突变基因mn2-m1和mn2-m2,并通过图位克隆获得Zm00001d019294为籽粒突变体mn2-m1和mn2-m2的候选基因,明确Zm00001d019294调控玉米籽粒发育,并验证了该基因可以影响并调控玉米籽粒的大小,可以获得比野生型植株产量更高的转基因作物,从而为该基因在培育大籽粒转基因经济作物领域中的应用提供理论依据。本发明所获得突变体可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源,在玉米种质资源的遗传改良育种中作用重大。(The invention belongs to the technical field of genetic engineering and molecular biology, and particularly relates to a corn small grain mutant and application thereof. The invention provides a corn kernel mutant gene mn2-m1 and mn2-m2, obtains Zm00001d019294 as candidate genes of kernel mutants mn2-m1 and mn2-m2 through map location cloning, confirms that Zm00001d019294 regulates and controls corn kernel development, verifies that the gene can influence and regulate the size of corn kernels, can obtain transgenic crops with higher yield than wild plants, and provides a theoretical basis for the application of the gene in the field of cultivating large-kernel transgenic cash crops. The mutant obtained by the invention can provide theoretical basis and gene source for cultivating new crop species, and has great effect in genetic improvement and breeding of corn germplasm resources.)

一种玉米小籽粒突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种玉米小籽粒突变体及其应用。

背景技术

玉米是我国重要的粮食作物和典型的C4类模式植物，在粮食生产和单子叶植物功能基因组学研究中具有重要地位。随着全球玉米需求的快速增长，玉米在国民经济中的地位日益凸显。世界各国对玉米的需求量逐年增加，玉米消费结构发生了根本性变化，即由解决温饱的主要粮食作物，逐渐发展成为禽畜饲料、工业原料、餐桌副食、能源作物的多样化格局。特别是近年来再生能源与精深加工领域赋予了玉米新的内涵，使得玉米的工业加工比例迅速增长，多元需求使玉米成为21世纪举足轻重的战略资源。因此，玉米产量将直接影响到畜牧、轻工、能源及其相关行业的发展，关系到国家粮食安全以及人民生活水平的提高，在经济发展中具有特别重要的地位。

如何提高玉米的产量，是我国目前迫切需要解决的重大课题。除了优化种植环境和条件外，从作物自身的遗传因素入手，解析影响产量的遗传因子及其作用分子机理，也是进行农作物产量遗传改良的重要基础。高产是玉米遗传改良研究的一个永恒主题，而籽粒(种子)大小是与玉米产量指标相关的一个重要性状。因此，研究调控籽粒大小的分子机理和寻找控制籽粒大小的基因，对提高玉米产量具有非同寻常的意义。

近年来，随着分子生物学和基因组学研究技术的迅速发展，通过图位克隆、转座子标签等方法，已经鉴定并克隆了一些控制玉米籽粒发育的基因。1996年，Cheng等报道miniature 1编码一个细胞壁转化酶的同工酶，该酶在胚乳的发育中活性增加，该基因突变体的籽粒重量与野生型相比，减少了30％以上(Cheng et al.,1996)。另一个影响种子大小的基因rgf1，其突变将会影响籽粒的填充，使籽粒基部连接母体的部分发育异常，转移层细胞中基因表达减少，最终胚乳变小，产生小种子(Maitz et al.,2000)。另有ppr2263基因编码一个含有DYW结构域的PPR蛋白，此蛋白在nad5和cob转录后的RNA编辑中起作用，该基因突变也会导致小籽粒的产生(Sosso et al.,2012)。Li等也发现玉米Smk1基因编码定位于线粒体中的E类PPR蛋白，该基因的突变会阻遏胚及胚乳的发育，从而导致种子变小(Li etal.,2014)。此外，番茄的fw 2.2基因在玉米中的同源基因家族CNRs(CellNumberRegulation)也会影响种子的发育，该家族基因含有一个富含半胱氨酸的保守基序，通过影响细胞的数目从而影响种子器官的大小。过表达该家族的CNR1基因会导致籽粒变小，而抑制或者敲除该基因能够使籽粒显著增大(Guo et al.,2010)。

在模式植物拟南芥和水稻中，对控制种子大小的基因也有一些研究。拟南芥的ANT和ARGOS是两个研究的相对较为清楚的基因，它们通过改变细胞数目来影响种子器官的大小。其中，ANT是一个含有AP2结构域的转录因子，而AGROS基因则通过作用于位于其上游的ANT基因来影响种子器官的大小。过表达ANT和ARGOS都会导致种子器官的增大(Elliott etal.,1996；Krizek et al.,1999)。另外，与ARGOS不同的是ARGOS-LIKE基因主要通过改变细胞的大小来影响种子的大小(Hu et al.,2006)。近年来，在水稻中也克隆到了控制种子大小的基因，例如：GS3(Fan et al.,2006,2009；Li et al.,2004)、GW2(Song et al.,2007)、qSW5/GW5(Wan et al.,2008；Weng et al.,2008；Shomura et al.,2008)、GL3.1(Qietal.,2012)等，这些基因均可以通过不同作用机理调控水稻种子器官的大小，但其中大部分是负调控因子。GS3和GW2在玉米中的同源基因ZmGS3和ZmGW2也被证实与玉米产量决定因素有关联(Li et al.,2010a；Li et al.,2010b)。最近由张启发院士实验室克隆的GS5基因在调控水稻种子的大小和产量方面起着重要的作用，且实验证明该因子是一个正调控因子，并编码一个预测的丝氨酸羧肽酶，该基因过表达株系的种子与对照相比明显增大(Liet al.,2011)。

硝态氮是植物吸收的主要氮源，硝转运蛋白在其从土壤中吸收到根部，及其从根部转运到茎秆或其它器官的过程中发挥着重要的作用。拟南芥硝转运蛋白NRT1.5主要在根部表达，在其突变体中根部表达量显著下降，其根部往茎秆中转运的NO₃ ^-显著下降(Lin etal.,2008)。但拟南芥中并没有NRT1.5突变后会影响籽粒发育的报道。但是，玉米中NRT1.5主要在籽粒中表达，并且其突变体籽粒表现为变小皱缩，这可能由于单子叶植物和双子叶植物的差异造成的NRT1.5功能上差异。通过研究该突变基因的功能并对基因的表达规律进行分析，可以为玉米产量的遗传改良提供新的思路，为分子育种提供基因元件。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种玉米小籽粒突变体，并进一步公开其在经济作物辅助育种领域中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种编码硝转运蛋白NRT1.5的突变基因，具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明还公开了所述的编码硝转运蛋白NRT1.5的突变基因在构建玉米小籽粒突变体中的用途。

本发明还公开了一种玉米小籽粒突变体mn2-m1，包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本发明还公开了一种编码所述的玉米小籽粒突变体mn2-m1的突变基因，包含如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的突变基因。

本发明还公开了一种玉米小籽粒突变体mn2-m2，包含如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还公开了一种编码所述的玉米小籽粒突变体mn2-m2的突变基因，包含如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的突变基因。

本发明还公开了所述的玉米籽粒体积突变体在培育大籽粒转基因经济作物领域中的应用。

本发明还公开了所述的玉米籽粒体积突变基因在培育大籽粒转基因经济作物领域中的应用。

本发明还公开了所述的玉米籽粒体积突变体在经济作物辅助育种领域中的应用。

本发明还公开了所述的玉米籽粒体积突变基因在经济作物辅助育种领域中的应用。

本发明提供了一种玉米籽粒突变基因mn2-m1和mn2-m2，并通过图位克隆获得Zm00001d019294为籽粒突变体mn2-m1和mn2-m2的候选基因，明确Zm00001d019294调控玉米籽粒发育，并验证了该基因可以影响并调控玉米籽粒的大小，可以获得比野生型植株产量更高的转基因作物，从而为该基因在培育大籽粒转基因经济作物领域中的应用提供理论依据。本发明所获得突变体可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源，在玉米种质资源的遗传改良育种中作用重大。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为实施例1中突变体mn2-m1的籽粒表型；

图2为实施例1中授粉后突变体mn2-m1的胚发育情况；

图3为实施例1中四个F2分离群体中mn2-m1苗期表型；

图4为实施例4中mn2-m1基因的图位克隆；

图5为Zm00001d019294编码氨基酸的序列比对；

图6为关键重组个体Zm00001d019294测序结果；

图7为对MN2-M进行表达分析的结果

图8为特定基因型鉴定结果。

具体实施方式

实施例1玉米小粒突变体mn2-m1表型分析

玉米小籽粒突变体mn2-m1是申请人于一堆淘汰的育种材料中发现，该突变体经检测从授粉早期自发地表现小籽粒，成熟后籽粒表现小而皱缩(如图1所示)，并且其胚发育也受到影响(如图2所示)，相比于野生型明显较小。

如表1所示的实验表明，突变体mn2-m1籽粒的长度、宽度、厚度及其百粒重均比野生型降低，并且其幼苗发育也受到影响(如图3所示)。

图1-3及表1中涉及的a/A、b/B、c/C、d/D分别来自mn2-m1与玉米自交系B73、昌7-2、郑58和齐319组配的F2群体。

表1籽粒性状分析

^**显著性差异水平P≤0.01.籽粒长度,籽粒宽度和籽粒厚度分别测量30个籽粒,三个重复。百粒重测量100个籽粒，重复三次。

实施例2遗传分析

利用玉米小粒突变体mn2-m1分别与普通玉米自交系B73、昌7-2、郑58和齐319杂交得到F1S，F1S自交得到F2S，用F2分离群体进行遗传分析，结果表明mn2-m1的小粒表型由隐性单基因控制(见下表2所示)。

表2五个亲本及其F1，F2群体表型分离分析

WT,野生型；χ2_(0.05,1)＝3.84.

实施例3等位突变体

2016年从淘汰的育种材料中得到mn2-m2，其表型与mn2-m1相似。为了验证它们是否来自同一位点突变，我们用mn2-m1/B73与mn2-m2杂交，结果发现它们的F1表现1：1分离，这说明mn2-m1和mn2-m2均来自MN2-M突变(见表3所示)。

表3 mn2-m1/B73与mn2-m2杂交F₁籽粒表型分离

杂交穗	野生型	突变型	分离比	卡方值	P-value
						穗-1	154	139	1.11	0.77	0.3<P<0.5
穗-2	121	108	1.12	0.74	0.3<P<0.5
						穗-3	168	146	1.15	1.54	0.2<P<0.3
穗-4	157	133	1.18	1.99	0.1<P<0.2
						穗-5	143	127	1.13	0.95	0.3<P<0.5

卡方值_(0.05,1)＝3.84.

实施例4突变基因mn2-m1位点的定位

用合成的188对核心SSR引物借助BSA分离群体分离分析法找到了2个与目标基因连锁的多态性分子标记P1和P2，其位于7号染色体短臂上，该区域未见与玉米籽粒突变有关的已知功能基因相关报道，初步断定控制该性状的基因是一个功能尚不清楚的新基因(详见表4及图4中A所示)。

用P1和P2对BC1群体中218个隐性突变体植株进行基因型鉴定，分别鉴定到7个和3个重组个体。利用前人文献报道的位于该区域的7对具有多态性的SSR引物P3-P9对这10个重组个体进行基因型检测，分别鉴定到7，7，2，2，3，3，3个重组个体，且P3，P4和P5位于P1一侧靠近染色体端臂，P6，P7，P8和P9位于P2一侧，靠近着丝粒端(详见表4及图4中A所示)(Xuet al.，2013)。因此，mn2-m1基因被定位于P5和P6之间，它们之间的物理距离约为11.78Mb。

为了对mn2-m1基因进行精细定位，用P5和P6对BC1群体中4347个隐性个体进行基因型鉴定，同时新鉴定了9个多态性SSR标记P10，P11，P12，P13，P14，P15，P16，P17，P18(详见表4和图4中B所示)。P5和P6共鉴定到了31个重组个体，其中P5一侧8个，P6一侧23个。用P10-P18这9个多态性标记鉴定P5和P6鉴定到的35(31+2+2)个交换单株，分别鉴定到9,9,9,9,7,3,0,4和5个重组个体。P10,P11,P12,P13,P14和P15位于P5一侧，P17和P18位于P6一侧。因此，目前目标基因被定位在物理距离约为1.34Mb的两个分子标记P15和P17之间(如图4中B所示)。用P15和P17鉴定BC1群体中4611个隐性个体，分别有5和12个重组个体。

为了进一步对mn2-m1精细定位，本实施例以开发的3个SSR标记P19-P21(详见表4和图4中C所示)。用P16和P19-P21这四个SSR标记鉴定P15和P17标记间的共24个(17+3+4)重组个体，均有2个交换单株。最终将目的基因mn2-m1定位在标记P19和P20之间，它们之间的物理距离为209.9kb(详见图4中C所示)。

利用基因分析与预测软件(www.softberry.com)对这209.9kb进行基因预测，结合maizeGDB网站公布的注释基因，在该区间只有一个候选基因Zm00001d019294，预测该基因编码硝转运蛋白NRT1.5(详见图4中C)。

表4图位克隆mn2-m1基因用到的引物

F和R分别代表上下游引物.^aSSR引物来自maizeGDB数据库；^b SSR标记来自前人文献(Xu et al.,2013)；^c SSR标记为我们自己开发.)

实施例5突变基因mn2-m1的克隆

候选基因Zm00001d019294基因组DNA及其cDNA序列分别使用如下引物：G1-2F-G1-3R(F：5′-CACTACCGCCCTAGCAAA；R：5′-TGCAAAAGTCAAAAACATACAAC)和GR1-6F-GR1-6R1(F：5′-ATGGCTGAGGGTAGCTG；R：5′-GCCTTAGAATGGATTGGTAT)，从野生型B73和突变体(mn2-m1和mn2-m2)叶片基因组及籽粒cDNA中扩增获得，直接连接克隆载体，测序，然后用序列分析软件DNAStar进行序列比对。

PCR扩增程序具体为：95℃5min，95℃45s，65℃45s，72℃90s，共32个循环，最后72℃10min，4℃forever。

检测定，所述玉米小籽粒突变体mn2-m1包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

同理得到，所述玉米小籽粒突变体mn2-m2包含如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

经序列分析发现，突变体基因mn2-m1(SEQ ID No.3)在ORF1395处缺失一个G，引起编码区发生移码突变造成翻译提前终止(如图4中D和图5所示)。突变体基因mn2-m2(SEQ IDNo.4)在ORF1455-1500缺失46bp，引起编码区发生移码突变造成翻译提前终止(如图4中D和图5所示)。

通过关键重组个体候选基因测序发现，只有ORF1379(A/G)引起的错义突变及其缺失突变位于候选区域内(如图6所示)。这也说明Zm00001d019294就是引起mn2-m1和mn2-m2突变表型的基因。

实施例6表达分析

用semi-quantitative RT-PCR方法对MN2-M进行表达分析，MN2-M在籽粒中表达量最高，在叶片中有微量表达(见图7中A所示)。此外，分别对mn2-m1突变体植株和野生型授粉后15天和21天的籽粒取材进行基因表达分析，结果显示该基因在mn2-m1突变体中的表达显著降低(如图7中B所示)。此外，玉米胚乳基部转移层及其胚周围区域发育相关的基因Meg-1，BETL-2,BETL-10,TCRR-1和ESR-6在突变体籽粒中的表达量均显著降低(如图7中B所示)。

实施例7

分别设计如下PCR引物：

GR-2NINDEL2F-GR-2NINDEL2R：

F-TTCCTCATGCTCGGTAAGTCAA；

R-AAAAAATCTAAAACTGGCAGAGGAG；和，

46F-46R：

F-CGCTCCGATCAGCAGGTA；

R-TTCTGCATCGTCAGGGTCAT。

分别利用上述引物从野生型和mn2-m1及其mn2-m2突变体叶片基因组中进行扩增，结果如图8所示。

PCR扩增体系包括：ddH₂O 5.75ul；10x Easy Taq Buffer 1ul；引物F(10uM)0.4ul，引物R(10uM)0.4ul；dNTP_S(2.5mM)0.25ul；EasyTaq0.2ul；基因组DNA2ul，所用试剂都是购自全式金公司。

PCR扩增条件包括：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃10min，4℃forever。

可见，利用设计的GR-2NINDEL2F-GR-2NINDEL2R和46F-46R标记引物能够区别mn2-m1和mn2-m2突变体，可用于分子标记辅助选择。

实施例8突变基因mn2-m1及其mn2-m2在辅助育种中的应用

据测定，mn2-m1直连淀粉含量为34.75％，比普通玉米B73(27.9％)显著高出24.55％。现有技术表明，普通玉米中直连淀粉含量为25％左右，mn2-m1为培育高直链淀粉玉米提供了基因资源。

此外，拟南芥中同源基因突变后提高了抗逆性(耐盐、抗旱、耐重金属镉毒害等)。未来我们可以通过基因转化或基因编辑或分子标记辅助育种培育氮高效玉米新品种。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 山东省农业科学院玉米研究所（山东省农业科学院玉米工程技术研究中心）

<120> 一种玉米小籽粒突变体及其应用

<130> 案卷号

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 476

<212> PRT

<213> mn2-m1

<400> 1

Met Ala Glu Gly Ser Trp Thr Pro Thr Ala Glu Leu Pro Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ala Val Asp Asp Asp Leu Pro Gln Val Val Val Gln Glu Lys

20 25 30

Gln Leu Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Arg Thr Gly Thr Ala Thr Ala

35 40 45

Thr Ala Thr Arg Asp Gly Ser Val Gly Trp Ser Gly Lys Pro Cys Ser

50 55 60

Arg Asp Arg Ser Gly Gly Trp Phe Ala Gly Phe Leu Met Leu Ala Asn

65 70 75 80

Gln Ala Leu Val Thr Phe Ala Val Asn Cys Val Gly Thr Asn Leu Val

85 90 95

Thr Phe Met Ser Val Val Met Arg Leu Asp Asn Ala Asp Ala Ala Asn

100 105 110

Lys Ala Asn Asn Trp Ala Gly Thr Thr Tyr Val Phe Ser Ile Val Gly

115 120 125

Ala Leu Val Ser Asp Ser Tyr Trp Gly Arg Tyr Lys Ala Cys Thr Ile

130 135 140

Phe Gln Leu Ile Phe Leu Ala Gly Leu Val Glu Leu Ala Val Ala Cys

145 150 155 160

His Val Phe Leu Asp Lys Ser Cys His Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Arg Gln Glu His Cys Arg Pro Pro Thr Thr Ala Gln Ser Leu Val Phe

180 185 190

Tyr Val Ser Ile Tyr Gln Ile Ala Leu Gly Asn Gly Ala Tyr Gln Pro

195 200 205

Ala Val Thr Thr Phe Gly Ala Asp Gln Phe Asp Glu Thr Asp Ala Arg

210 215 220

Glu Arg Arg Ser Lys Ala Ala Phe Phe Gly Tyr Phe Phe Val Ala Asn

225 230 235 240

Asn Leu Gly Gly Val Leu Ala Val Thr Ala Leu Ala Tyr Met Glu Asp

245 250 255

Glu Gly Gln Trp Val Leu Ala Phe Trp Ile Ala Thr Ala Ala Ala Leu

260 265 270

Leu Gly Phe Leu Leu Phe Ala Val Gly Thr Leu Arg Tyr Arg His Phe

275 280 285

Leu Pro Ser Gly Asn Ala Val Val Ser Val Cys Gln Val Val Val Ala

290 295 300

Ala Val Arg Asn Arg Arg Val Arg Ala Gln Val Arg Ala Gln Asp Met

305 310 315 320

Tyr Asp Pro Asp Thr Asp Gly Asp Arg Gly Lys Lys Gly Val Arg Lys

325 330 335

Met Val His Thr Pro Glu Tyr Arg Cys Leu Asp Lys Ala Ala Val Ile

340 345 350

Lys Asp Pro Ala Ser Ala Phe Arg Pro Pro Ala Gly Gln Pro Gln Gly

355 360 365

His Ser Ser Ser Lys Pro Asn Pro Trp Arg Leu Cys Thr Leu Thr Gln

370 375 380

Val Glu Glu Leu Lys Cys Ile Leu Arg Leu Val Pro Ile Trp Leu Cys

385 390 395 400

Ser Ile Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser Gln Met Ser Ser Val Phe Ile

405 410 415

Glu Gln Ala Gln Ala Met Asp Asp Ser Leu Ser Lys Leu Thr Ile Pro

420 425 430

Pro Ala Gly Met Asp Val Phe Glu Ile Leu Gly Val Thr Ala Phe Val

435 440 445

Phe Ile Tyr Arg Phe Cys Ile Val Arg Val Met Ala Arg Ile Ser His

450 455 460

Glu Pro Arg Ser Ser Arg Gly Trp Ala Pro Gly Ser

465 470 475

<210> 2

<211> 501

<212> PRT

<213> mn2-m2

<400> 2