阅读说明：本技术 一种燕麦叶枯病菌基因CvCAO1及其应用 (Oat leaf blight bacterium gene CvCAO1 and application thereof ) 是由 张祥辉 于汇琳 王璐 孙颖 焦文莉 刘金亮 潘洪玉 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：一种燕麦叶枯病菌CvCAO1基因及其应用属微生物基因工程技术领域,本发明提供的来自燕麦叶枯病菌的控制毒素形成的CvCAO1基因,其DNA序列如SEQ ID No:1所示；提供的CvCAO1基因所编码的蛋白质,其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；CvCAO1基因可在植物抗燕麦叶枯病基因工程领域中应用；通过对燕麦叶枯病菌的控制毒素形成的蛋白质CvCAO1进行缺失、突变或修饰,而使其毒素形成受限,可作为靶标在设计和筛选抗燕麦叶枯病药剂中应用。(The invention provides a CvCAO1 gene of oat leaf blight bacteria and application thereof, belonging to the technical field of microbial genetic engineering, the DNA sequence of the CvCAO1 gene formed by control toxin of oat leaf blight bacteria is shown as SEQ ID No. 1; the amino acid sequence of the protein coded by the CvCAO1 gene is shown as SEQ ID No. 2; the CvCAO1 gene can be applied to the field of plant gene engineering for resisting bacterial leaf blight of oat; the protein CvCAO1 formed by controlling the toxin of the bacterial leaf blight of oat is deleted, mutated or modified, so that the toxin formation is limited, and the protein CvCAO1 can be used as a target to be applied to designing and screening of anti-bacterial leaf blight medicaments of oat.)

一种燕麦叶枯病菌基因CvCAO1及其应用

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌毒素形成的基因的发现及其编码蛋白质的应用。

背景技术

燕麦叶枯病是由一种平脐蠕孢菌Cochliobolus victoriae引起，燕麦叶枯病主要危害叶片、叶鞘、颖等地上部。叶片染病初期会形成边缘不明显的黄色至黄褐色病斑，后逐渐扩大，中间褐色，四周略带黄色。病斑多时，从叶尖端逐渐向下枯死。该病多从下部叶片开始发生并向上扩展。并且，燕麦叶枯病菌可以产生一种毒素-victorin，毒素victorin稀释一百万倍以后仍对特定基因型的燕麦品种有毒害作用，从此也提出了寄主专化性毒素的概念，并得到广泛研究。毒素victorin是燕麦叶枯病菌成功侵染燕麦的必要元素之一。不能产生victorin的菌株则不能对燕麦产生致病性，而离体的victorin也能侵染燕麦。燕麦对victorin的感病性主要由燕麦Vb基因决定，含有Vb基因的燕麦表现为感病，不含有Vb基因的燕麦表现为抗病。而Vb基因与燕麦抗锈病的Pc2基因是同一个基因，因此燕麦叶枯病的感病性是与一个抗性基因相关联的。并且victorin能够引起燕麦的防卫反应，包括胼胝质积累，氧爆发以及细胞程序性死亡。而victorin主要包括5种结构，分别是B、C、D、E和Victoricine，结构C为主要结构，活性占比达到85％-90％。燕麦叶枯病每年给燕麦生产造成了极大的损失，尤其毒素victorin的产生给人畜安全产生很大影响。而毒素victorin的产生机制目前还不清楚，这给燕麦叶枯病的防治造成了很大的困难。

CAO1(Copper amine oxidase 1)基因是一个在燕麦叶枯病菌中的未知功能基因，通过分析CAO1基因的功能，评价其在燕麦叶枯病菌毒素产生中的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型防控燕麦叶枯病菌的药剂。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种控制真菌毒素形成的基因及其编码的蛋白质。

本发明所提供的控制毒素形成的基因来源于燕麦叶枯病菌(Cochliobolusvictoriae)FI3，名称为CvCAO1，其DNA序列如SEQ ID No:1所示。该DNA序列为CvCAO1基因的开放阅读框，由2332个核苷酸组成，其中包含4个内含子序列。

本发明提供了CvCAO1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，该序列由709个氨基酸组成。

本发明所述燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)CvCAO1基因可在调控燕麦叶枯病菌毒素产生中应用。

本发明所述CvCAO1基因编码的蛋白质可在燕麦叶枯病菌毒素形成缺陷中应用。

对来自燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3的控制毒素形成的CvCAO1基因所编码的蛋白质进行缺失、突变或修饰，而使其毒素形成受阻，可作为靶标在设计和筛选抗燕麦叶枯病药剂中应用。

本发明证明了CvCAO1基因的缺失，导致燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3毒素不能形成，说明CvCAO1基因是燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3毒素形成所必需的基因。目前，关于CvCAO1基因影响毒素形成方面还没有报道，本研究是第一次报道。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制燕麦叶枯病的发生，从而有助于开发新型杀菌剂，即本发明所提供的CvCAO1基因的一个重要用途是：该基因的表达与其编码的蛋白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗燕麦叶枯病药剂的设计和筛选。

附图说明

图1为CvCAO1蛋白质的结构域预测示意图

其中：其中发现一个保守的Cu_amine_oxid功能结构域。

图2为燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3CvCAO1基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图

其中：Cv FI3为燕麦叶枯病菌野生型菌株，ΔCvcao1为CvCAO1基因的缺失突变体；引物F1/R1与F2/R2分别用于扩增CvCAO1基因的上下游序列，用作敲除的同源臂；引物F/R，U/NLC37，NLC38/D用于验证突变体。

图3为CvCAO1基因缺失突变体的PCR验证电泳图

其中：F/R、U/NLC37、D/NLC38为所用引物；1为燕麦叶枯病菌(Cochliobolusvictoriae)FI3野生型菌株，2和3为CvCAO1基因缺失突变体；(1)F/R为部分CvCAO1基因扩增结果，(2)U/NLC37为CvCAO1基因上游序列加部分潮霉素序列扩增结果，(3)D/NLC38为CvCAO1基因下游序列加部分潮霉素序列扩增结果。

图4为CvCAO1基因的缺失突变体、野生型菌株及阴性对照菌株(不能产生毒素菌株)的毒素产生测定对比照片

其中：所用试管中液体为各个菌株的培养液，所用叶片为燕麦幼苗叶片，如果菌株能产生毒素，经过24h培养后燕麦叶片会发生弯曲；1为燕麦叶枯病菌野生型菌株，2和3为不能产生毒素的燕麦叶枯病菌菌株(阴性对照),4和5为CvCAO1基因的缺失突变体菌株。

图5为CvCAO1基因的缺失突变体与野生型菌株产生毒素的ESI EIC谱图

其中：将各个菌株接种在液体Fries’培养基培养15天后，进行毒素测定；标准品为纯毒素标准品，WT为燕麦叶枯病菌野生型菌株，ΔCvCAO1为CvCAO1基因的缺失突变体菌株。

具体实施方式

为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步说明，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明中燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)菌株FI3提供者为美国康奈尔大学的Babara Gillian Turgeon，

提供者联系方式为：

Dept.of Plant Pathology&Plant-Microbe Biology,334Plant Science Bldg.,Cornell University,Ithaca,NY 14850,United States.E-mail:[email protected]。

实施例1CvCAO1基因的相关性分析

CvCAO1基因是通过对燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3基因组分析获得。燕麦叶枯病菌CvCAO1基因的开放阅读框由2332个核苷酸组成，包含4个内含子。编码的蛋白质产物由709个氨基酸组成，结构域分析发现，CvCAO1蛋白质包含一个保守的Cu_amine_oxid功能域(见图1)。

实施例2CvCAO1基因的敲除

1)CvCAO1基因上下游以及潮霉素基因的扩增

采用引物F1(5'-CTAGAGATGAAGGCCCTGGA-3')与R1(5'-TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTAGGGTCCGAGTTCACACAAA-3')，以燕麦叶枯病菌野生型菌株FI3的基因组DNA为模板扩增CvCAO1基因上游621bp片段，采用F2(5'-GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGGAGAAGGAGTGCAGGTTTGG-3')与R2(5'-GGTTTTCGCGGATGAAGTAA-3')扩增燕麦叶枯病菌CvCAO1基因下游816bp片段，采用引物M13F(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')和M13R(5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3')，以载体pUCATPH为模板扩增2549bp潮霉素基因。反应体系为：10mmol/L dNTP Mixture，1μL；5×PCR buffer，10μL；上下游引物各2.5μL(10μmol/mL)；模板DNA，2μL；Phusion polymerase，0.5μL(5U)；ddH₂O，31.5μL；扩增程序为：98℃预变性2分钟，然后(1)98℃，变性20秒；(2)65℃，退火30秒；(3)72℃，延伸30秒；(4)循环30次；(5)72℃延伸10分钟。将上述3个片段共同转入燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3中。

2)燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3转化

a.燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3的产孢培养

从-80℃冰箱取少量燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3菌株分生孢子，滴加于CMX培养基【每升CMX培养基包含：0.1g/mL四水合硝酸钙溶液10mL，10mL溶液B，0.5mL微量元素溶液，1g酵母提取物，0.5g酶解干酪素，0.5g酸解干酪素，10g木糖，20g琼脂粉。(每升溶液B包括：20g磷酸二氢钾，25g七水合硫酸镁，15g氯化钠)(每升微量元素溶液包括：57.2mg硼酸，393mg五水合硫酸铜，13.1mg碘化钾，60.4mg一水合硫酸锰，36.8mg四水合钼酸铵，5.49g一水合硫酸锌，948.2mg六水合氯化铁)】上，置24℃培养2周，用CM液体培养基【每升CM培养基包含：0.1g/mL四水合硝酸钙溶液10mL，10mL溶液B，0.5mL微量元素溶液，1g酵母提取物，0.5g酶解干酪素，0.5g酸解干酪素，10g葡萄糖，20g琼脂粉。(每升溶液B包括：20g磷酸二氢钾，25g七水合硫酸镁，15g氯化钠)(每升微量元素溶液包括：57.2mg硼酸，393mg五水合硫酸铜，13.1mg碘化钾，60.4mg一水合硫酸锰，36.8mg四水合钼酸铵，5.49g一水合硫酸锌，948.2mg六水合氯化铁)】刮取、收集孢子，显微镜观察，利用血球计数器调节孢子浓度为1×10⁶/mL。

b.燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3转化

吸取1mL孢子悬浮液于100mLCM液体培养基中，24℃振荡培养(150rpm)28h，离心收集菌丝于80mL酶解液(3.27g氯化钠，0.8g崩溃酶)中酶解2h，收集原生质体。将原生质体用10mLSTC溶液洗涤3次，并最终溶解于500μLSTC溶液(每100mLSTC溶液包括：21.86g山梨醇，1Mtris-HCL1mL，0.735g二水合氯化钙)中。将25mL准备好的PCR片段与100μL原生质体溶液充分混匀，加入1mLPEG溶液(每50mLPEG溶液中包括：聚乙二醇30g，1Mtris-HCL0.5mL，0.37g二水合氯化钙)。最后用1mLSTC溶液稀释，并与再生培养基混合，30℃过夜培养，每个培养皿中加入含有150μg/mL潮霉素的水琼脂10mL，30℃培养3d后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的CMX培养基上。

3)缺失突变体的验证

选用三对引物通过PCR扩增对转化子进行筛选。扩增结果符合如下结果的，确定为CvCAO1基因缺失突变体：上游同源臂之外基因组上的引物U(5'-CGCAAACTAGCAAAAGCGTA-3')与潮霉素抗性基因的引物NLC37(5'-GGATGCCTCCGCTCGAAGTA-3')配对可以扩增到预期大小(1.9kb)的重组片段；下游同源臂之外基因组上的引物D(5'-GTATAGCGAACCCCCGTGTA-3')与潮霉素抗性基因的引物NLC38(5'-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3')配对可以扩增到预期大小(2.85kb)的重组片段；而编码区引物F(5'-GCGTTCCTTCCACAGCTAAG-3')与R(5'-AAGGGCTTCTTGGAGGGATA-3')无扩增条带(野生型菌株可扩增到637kb片段)(见图3)。结果，从转化子中筛选到2株CvCAO1基因缺失突变体，用于后续功能分析。

实施例3CvCAO1基因在燕麦叶枯病菌(Cochliobolusvictoriae)FI3毒素产生中的作

用

将燕麦叶枯病菌(Cochliobolus victoriae)FI3和CvCAO1基因缺失突变体分别接种于固体CMX培养基上，生长两周后，用5mLFries’培养基【酒石酸铵5g，硝酸铵1g，磷酸二氢钾1g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，两水合氯化钙0.13g，蔗糖30g，酵母浸粉1g，铁溶液1mL，用水定容至1L。(铁溶液：七水合硫酸亚铁2g，EDTA2.41g，用水定容至100mL)】冲洗菌丝及分生孢子，收集菌丝及孢子悬浮液至20mLFries’培养基中，黑暗培养15天后用于毒素测定。

毒素生物测定：将上述培养液用纱布过滤，去除菌丝体，取2mL培养液加入试管中，取生长两周左右的燕麦幼苗叶片放入试管中培养24h。过夜培养后如果燕麦叶片保持直立，则证明菌株不能产生毒素，如燕麦叶片变弯曲，则证明菌株能产生毒素。

毒素的仪器测定：将上述培养液用纱布过滤，去除菌丝体，过反向C18柱进行纯化，除去杂质。然后用乙腈/水(50/50)对C18柱进行淋洗，将淋洗液过凝胶柱分离，后用10mMNaCL溶液淋洗，将淋洗液进行浓缩干燥，并用乙腈进行溶解，上高效液相色谱进行测定。高效液相色谱检测条件为：流动相为25％乙腈水溶液，检测器为紫外检测器，检测波长254nm，色谱柱为C18柱。

序列表

序列表

发明名称：一种燕麦叶枯病菌基因CvCAO1及其应用

SEQ ID No:1的序列

　　　（i）序列特征：（A）长度：2332 bp；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链

　　　（ii）分子类型：DNA

　　　（iii）序列描述：SEQ ID No:1

1 ATGAAGCTAT TTCTGCTCTT TACGTTAACG CTGGTAAATA TTTTTAGCGT TTCGTTACAA 61GAGCCCATTC AAAATCAACC AGCAGGAAAC AATACTATCA CTTCACCGCA TAGAAATGTG 121TGGCGTGCCC TGTCAGAAGC AGAGTTCAGT GGCGTTTCAG CGGTCTTGGT CCACCAATTG 181AACTTGACTA CAAGGTACGT TAACGAAACA TAGAAGAGCA CAATTATACT AAATATGCAT 241AGTCGGGGTG GCAATAGAAT GTAAGAGTAC TAGGGCATTA CTACACGTTG GGATTCTGAT 301CAGCCGCCAG TATCCAAATT GATTATCTAT ATCCAAACAA ATCCGATGTG CTGCTCTTCC 361TTGATCATAA TGGAGAGGAG CCTAAGCGTT ATGCGCGCGC CACAGTACAG TTCGGCTCTC 421CCGAAGTCCC GTATCTCCAA GAATACCGCA TCGGTCCACT ACCAGCAACA AACACAACGG 481CAGTAGAACC TCTTCGTTTT CCCTTCAACG GGAAAGTGCA GGGCAAAACC AAGATCACTT 541CTCTGGACGC AGACGGAATC GATGCGTTCC TTCCACAGCT AAGTTCAGTG GTTGAAGACA 601TCACACGGAA ACTATGGAAC ACAGTAAGCA GTCTTTACAC CGCACTTTCT AAACTCGTCC 661TGTTTAATTA ACAAGTAAAA GACTCTAGCA GAGGGTGGTG TATCCTTCAA TCTCGGAAAG 721GCGTCCTTCA ATTCCGACTC TACACAAACC ATCTGGTTAG GATTTCTTAA CAACGCTACC 781ACTGGTTTCG ACAGTTCCAC CCTCCTTCCC CTTGGCGTCT CCATGCAACT TGACATCACA 841AGCCGTGACT ACAATGATTG GTTCGTCTTA TATTGGTTCT ACAACAACAA ACTCTACACT 901CCCACCTCCT TCAACGAGAC AGTTTATTCA TCTGACTTCC AACCTCCACT CGCTAATATA 961GACGGTCCAT GGACATCTAC CAATAAGCAG GAACCGACCT TCTTACTAGA CGATTTACCT 1021CCACCAAAAG CTATATCCCG AGGGAAGAAT CGCTACAACC TCGACACAGA GGAAAACTAC 1081GTCCAATGGA TGGATTTCTC CTTCTACTTC TCCTCCCACA CCGACCGCGG CCTTTCCCTT 1141TTCAACGTCG TCTATAAGTC CAAACGTATA ATCTACGAGC TATCCCTCCA AGAAGCCCTT 1201GCCCACTACG CCGGCGTTGA ACCGGTTCCA TCCGAAGCCG TTTACTTTGA TACACAGACG 1261GGAATGGGTA GATCTATGAT TTCGTTGATC AAGGGATATG ATTGTCCTGA TTATGCTACA 1321TATCTCAACT CGTCATTTTC TAGCAGAACC GGAGTCACAA TCACACCCGA CGCTATCTGC 1381TTATTCGAAA GCGACTCACA GTTCCCACTA CGCAGACATA CTTCTCAAGC ATTCGGTTAT 1441GCGAGTGCAG CGCGCAATGT AGTGTTTACA GTAAGATGGA TTGCTACGGT GGGTAATTAC 1501GATTACTTAT TCGACTACGA CTTTTTCTAT GACGGCGCGA TTGAAGTCAA AGTTCGTGCG 1561TCAGGGTATA TCCAGGGAGC GTATTATGCA GGGAACGAAG AGTATGGGTT CAAGATTCAT 1621GATGCATTGT CTGGGTCAAT GCATGATCAT GTTATGACAT TTAAGGCGGA TCTCGACATA 1681TATGGAGAAA AGAATAGTGT ACAGAAGGTT GAGGTTGTCC CAGAGACTAC TATGTAAGTA 1741ATTTGCCACT AATAAGGATA TTTGCTAACG AACTCCCAGA TACCCATGGT CTCAAGGCCA 1801ACCGCACAAC ACGATGAAAC TGAACCGCGG ATTCGTCACT AGCGAGACCG ATTCTAGTAT 1861TGATTGGGCA GCTGACGATG CGATCTCCTA CACCATCGTA AACAAGGACT CCCCCAATAA 1921ATATGGAGAG TATCCCGGGT ATAGATTCAG ACGAGTCGCA CCAGCCATAC ACCTCACAGT 1981CAAAAATTCT ACGAGTGGCG GCAAAGCCCT CCACTACGCT ACCCATGACT TGTTCATCAC 2041CCAGCAAAAA GACAATGAAC CATGTGCAGC AGATCGTAAT AACGCCTATA ATATTGATGA 2101TCCACTTGTT GATTTTGAAA AGTTTCTGGA CGGAGAAAGT TTGGAGCAGG AGGATTTGGT 2161GTTGTGGATC AATATGGGTA TGCATCATAC GCCTCATACT GAAGACTTGC CGAACACGAT 2221TATGACATCT GCGTATTCGG GGATTAGGTT TGAGCCGTTC AATTATTTAG AGAGTGGGGA 2281TCCATCAGTT AAATCGGCAC AGCAAGCTAG AATTATTTTA TCGAATAGTT AG

SEQ ID No:2的序列

　　　（i）序列特征：（A）长度：709个氨基酸；（B）类型：氨基酸；（C）链性：单链

　　　（ii）分子类型：多肽

　　　（iii）序列描述：SEQ ID No:2

1 mklfllftlt lvnifsvslq epiqnqpagn ntitsphrnv wralseaefs gvsavlvhql

61 nlttsrggnr iiqidylypn ksdvllfldh ngeepkryar atvqfgspev pylqeyrigp

121 lpatnttave plrfpfngkv qgktkitsld adgidaflpq lssvveditr klwnttlaeg

181 gvsfnlgkas fnsdstqtiw lgflnnattg fdsstllplg vsmqlditsr dyndwfvlyw

241 fynnklytpt sfnetvyssd fqpplanidg pwtstnkqep tfllddlppp kaisrgknry

301 nldteenyvq wmdfsfyfss htdrglslfn vvykskriiy elslqealah yagvepvpse

361 avyfdtqtgm grsmislikg ydcpdyatyl nssfssrtgv titpdaiclf esdsqfplrr

421 htsqafgyas aarnvvftvr wiatvgnydy lfdydffydg aievkvrasg yiqgayyagn

481 eeygfkihda lsgsmhdhvm tfkadldiyg eknsvqkvev vpettiypws qgqphntmkl

541 nrgfvtsetd ssidwaadda isytivnkds pnkygeypgy rfrrvapaih ltvknstsgg

601 kalhyathdl fitqqkdnep caadrnnayn iddplvdfek fldgesleqe dlvlwinmgm

661 hhtphtedlp ntimtsaysg irfepfnyle sgdpsvksaq qariilsns

申请人：吉林大学