阅读说明：本技术 一种苏氨酸生产和分离精制工艺 (Threonine production and separation refining process ) 是由 李德衡 赵兰坤 刘元涛 王小平 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于氨基酸生产技术领域,公开了一种苏氨酸生产和分离精制工艺,其包括如下步骤：步骤1)配置发酵培养基,步骤2)发酵制备苏氨酸,步骤3)分离精制苏氨酸。本发明工艺发酵效率高,通过分离精制得到高纯度的苏氨酸产品。(The invention belongs to the technical field of amino acid production, and discloses a threonine production and separation refining process, which comprises the following steps: step 1) preparing a fermentation culture medium, step 2) preparing threonine through fermentation, and step 3) separating and refining threonine. The process has high fermentation efficiency, and the high-purity threonine product is obtained by separation and refining.)

一种苏氨酸生产和分离精制工艺

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种提高苏氨酸发酵效率的工艺。

背景技术

苏氨酸作为人体所必需的氨基酸之一，在人们的生活中起着越来越重要的作用。随着养殖业的发展，畜禽饲料需求量的迅速增加，苏氨酸扮演着必须从外界摄取的营养成分的角色越来越受到重视。在医药、食品和饲料等方面都有广泛的应用。苏氨酸属于工业化发酵的产品之一，据资料统计，2017 年全球苏氨酸供应量达到 68.5 万吨，同比增长15.5%，或增长 9.2 万吨，增量的 80%来自中国。2017 年中国苏氨酸的供应量达到 53.5万吨，同比增长 15.6%，占全球市场的 78%。2017 年中国苏氨酸生产企业以梅花、阜丰、伊品、成福为主，大成、希杰补充；国际生产企业主要以味之素和 ADM。2017 年中国苏氨酸出口 37.4 万吨，占产量的 69.9%，国内供应 16.1 万吨，国内需求 13 万吨。

L-苏氨酸的生产方法有蛋白质水解法、化学合成法和微生物发酵法。因为蛋白质水解法和化学合成法具有工艺复杂、收率低、环境污染大、成本高等缺点，难以应用于工业化生产，基本上不再使用。微生物发酵的方法具有生产成本低、环境污染小的特点，现已成为工业化生产 L-苏氨酸的主要方法。微生物发酵是指利用微生物在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为目的产物的过程。微生物发酵的生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。利用现代基因工程技术进行菌种的改造，减少副产物的生物合成，提高产物的基因表达，从而提高 L-苏氨酸的产量。伴随着基因工程技术的发展和工业微生物信息量的增加，尤其是工业上生物载体系统的成功构建，上世纪70 年代末前苏联的研究人员就开始利用基因工程技术构建苏氨酸工程菌，为筛选优良的 L-苏氨酸产生菌和提高菌株的产酸水平提供了可靠的技术支持。

用于 L-苏氨酸发酵的微生物主要是埃希氏菌属、短杆菌属、棒杆菌属、变形杆菌属，不同微生物物种中的生物合成途径大致相同。大肠杆菌是微生物发酵生产苏氨酸的主要菌种。据文献资料报道，在大肠杆菌中，有糖酵解途径（EMP）、三羧酸循环（TCA）、戊糖磷酸途径（HMP），补救途径和磷酸转移酶系统（PTS）。HMP 途径可以为氨基酸合成提供大量的NADPH，具有重要意义。在 L-苏氨酸的发酵过程中，葡萄糖通过糖酵解，三羧酸循环合成草酰乙酸，草酰乙酸是一种重要的中间产物，为 L-苏氨酸合成的重要前体物质之—。研究表明，在大肠杆菌中以葡萄糖为底物的发酵培养中，乙醛酸循环不出现，这意味着 TCA 循环是大肠杆菌发酵过程中的主要氧化方式；同时，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）催化的反应是 TCA 循环的主要回补反应。

对于苏氨酸发酵培养基、合成途径等方面的研究，申请人之前的专利技术进行了大量的阐述，针对苏氨酸的合成机理进行进一步的研究，对培养基、培养条件等进行了优化，以进一步提升苏氨酸的发酵效率，减少代谢副产物的合成。

申请人之前的专利技术“一种提高苏氨酸发酵效率的工艺”，通过优化培养基和培养参数步骤，提高了发酵效率，在该技术上的基础上，申请人继续对发酵液中的苏氨酸进行了分离和精制。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷，本发明提出了一种苏氨酸生产和分离精制工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种苏氨酸生产和分离精制工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：步骤1）配置发酵培养基，步骤2）发酵制备苏氨酸，步骤3）分离精制苏氨酸。

进一步地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖40-60g/L，玉米浆20-25g/L，磷酸二氢钾0.5-0.7g/L，磷酸氢二钾0.5-0.7g/L，硫酸镁0.10-0.15g/L，N-甲基天冬氨酸50-100mg/L，甲硫氨酸20-30mg/L，七水硫酸亚铁10-15mg/L、一水硫酸锰10-15mg/L，pH值6.5-7.0。

进一步地，所述步骤2）发酵制备苏氨酸，包括如下步骤：将产苏氨酸的黄色短杆菌种子液按照8-10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵时间为48-60h，停止发酵，收集发酵液。

进一步地，所述步骤3）分离精制苏氨酸，包括如下步骤：利用碟片离心机以4500-5000rpm的速度离心发酵液3-5min，收集上层液体；微滤膜过滤，收集过滤液；再经过超滤膜进行超滤，收集超滤液，泵入脱色罐进行脱色处理，脱色罐中添加占超滤液质量0.3-0.5%的粉状活性炭，控制脱色罐内的温度为45-50℃，pH在6.5-7.0，脱色时间为20-30min，板框过滤去除活性炭，收集清液，浓缩成原体积的四分之一，然后进入等电罐，缓慢降温至18℃，调节成pH为6.1-6.2的等电溶液，沉降8-18小时；离心收集苏氨酸湿晶体，将湿晶体烘干，即得。

优选地，所述微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，微滤温度为40℃。

优选地，所述超滤膜为聚偏氟乙烯超滤膜，截留分子量为300Da，超滤温度为40℃。

优选地，整个发酵过程中，通过流加葡萄糖浓度为200-300g/L的营养液控制发酵液中的含糖量为0.5%，通过流加氨水控制发酵液的pH为6.5。

优选地，所述发酵条件为：温度30-32℃，罐压为0.03-0.04MPa，通气量为0.5-0.6vvm，转速为50-100rpm。

优选地，所述营养液中含有N-甲基天冬氨酸3-5g/L，甲硫氨酸1-2g/L。

更优选地，所述营养液中含有N-甲基天冬氨酸5g/L，甲硫氨酸1g/L。

本发明研究的出发点以及取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

苏氨酸合成机制中，通过增大甲硫氨酸的胞内浓度，以提高高丝氨酸的量，它是L-天冬氨往苏氨酸合成途径中的中间产物，甲硫氨酸代谢产物 S-腺苷甲硫氨酸的积累会使琥珀酰高丝氨酸合成酶被抑制，从而促进 L-苏氨酸的合成；

N-甲基天冬氨酸能够为苏氨酸合成提高甲基，而且还可以作为合成苏氨酸的中间产物，从而提高L-苏氨酸的合成；

N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸对苏氨酸合成途径进行了双重调控，协同性能好，提高了产酸效率，发酵时间缩短，节约了成本。

实验数据表明，N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸均能够提升苏氨酸的产量，二者协同作用，较不添加N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸相比，能够提升20个百分点以上。

本发明工艺简单可行，苏氨酸收率和纯度高，可达到医药或食品级别标准。

附图说明

图1：N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸对菌体生长的影响；

图2：N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸对苏氨酸产量的影响；

图3：发酵培养基中N-甲基天冬氨酸的添加量对苏氨酸产量的影响；

图4：发酵培养基中甲硫氨酸的添加量对苏氨酸产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种苏氨酸生产和分离精制工艺，其包括如下步骤：

步骤1）配置发酵培养基：葡萄糖60g/L，玉米浆20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.10g/L，N-甲基天冬氨酸100mg/L，甲硫氨酸30mg/L，七水硫酸亚铁10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，pH值6.5-7.0；

步骤2）发酵制备苏氨酸：将黄色短杆菌ATCC14067种子液（种子液的OD600为16）按照8%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度32℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.5vvm，转速为100rpm，发酵时间为60h，停止发酵，收集发酵液；整个发酵过程中；整个发酵过程中，通过流加葡萄糖浓度为300g/L的营养液控制发酵液中的含糖量为0.5%，通过流加氨水控制发酵液的pH为6.5。

所述营养液中含有N-甲基天冬氨酸5g/L，甲硫氨酸1g/L；

步骤3）分离精制苏氨酸：利用碟片离心机以5000rpm离心发酵液3min，收集上层液体；微滤膜过滤，收集过滤液；再经过超滤膜进行超滤，收集超滤液，泵入脱色罐进行脱色处理，脱色罐中添加占超滤液质量0.5%的粉状活性炭，控制脱色罐内的温度为45℃，pH在6.5，脱色时间为30min，板框过滤去除活性炭，收集清液，浓缩成原体积的四分之一，然后进入等电罐，缓慢降温至18℃，调节成pH为6.1的等电溶液，沉降12小时；离心收集苏氨酸湿晶体，将湿晶体烘干，即得；

所述微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，微滤温度为40℃；所述超滤膜为聚偏氟乙烯超滤膜，截留分子量为300Da，超滤温度为40℃。

上述苏氨酸产品经HPLC检测，产品纯度99.2%，产品纯度较高，可作为医药或食品用苏氨酸。

实施例2

一种苏氨酸生产和分离精制工艺，其包括如下步骤：

步骤1）配置发酵培养基：葡萄糖50g/L，玉米浆20g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，磷酸氢二钾0.7g/L，硫酸镁0.10g/L，N-甲基天冬氨酸75mg/L，甲硫氨酸25mg/L，七水硫酸亚铁10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，pH值6.5-7.0；

步骤2）发酵制备苏氨酸：将黄色短杆菌ATCC14067种子液（种子液的OD600为12）按照10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度30-32℃，罐压为0.03MPa，通气量为0.6vvm，转速为50rpm，发酵时间为50h，停止发酵，收集发酵液；整个发酵过程中；整个发酵过程中，通过流加葡萄糖浓度为200g/L的营养液控制发酵液中的含糖量为0.5%，通过流加氨水控制发酵液的pH为6.5。

所述营养液中含有N-甲基天冬氨酸3g/L，甲硫氨酸2g/L；

步骤3）分离精制苏氨酸：利用碟片离心机以4500rpm离心发酵液5min，收集上层液体；微滤膜过滤，收集过滤液；再经过超滤膜进行超滤，收集超滤液，泵入脱色罐进行脱色处理，脱色罐中添加占超滤液质量0.4%的粉状活性炭，控制脱色罐内的温度为45℃，pH在6.5，脱色时间为20min，板框过滤去除活性炭，收集清液，浓缩成原体积的四分之一，然后进入等电罐，缓慢降温至18℃，调节成pH为6.2的等电溶液，沉降8小时；离心收集苏氨酸湿晶体，将湿晶体烘干，即得；

所述微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，微滤温度为40℃；所述超滤膜为聚偏氟乙烯超滤膜，截留分子量为300Da，超滤温度为40℃。

上述苏氨酸产品经HPLC检测，产品纯度99.1%，产品纯度较高，可作为医药或食品用苏氨酸。

实施例3

一种苏氨酸生产和分离精制工艺，其包括如下步骤：

步骤1）配置发酵培养基：葡萄糖50g/L，玉米浆25g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.10g/L，N-甲基天冬氨酸50mg/L，甲硫氨酸20mg/L，七水硫酸亚铁10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，pH值6.5-7.0；

步骤2）发酵制备苏氨酸：将黄色短杆菌ATCC14067种子液（种子液的OD600为12）按照9%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度30℃，罐压为0.03MPa，通气量为0.6vvm，转速为70rpm，发酵时间为54h，停止发酵，收集发酵液；整个发酵过程中；整个发酵过程中，通过流加葡萄糖浓度为300g/L的营养液控制发酵液中的含糖量为0.5%，通过流加氨水控制发酵液的pH为6.5。

所述营养液中含有N-甲基天冬氨酸4g/L，甲硫氨酸2g/L；

步骤3）分离精制苏氨酸：利用碟片离心机以5000rpm离心发酵液4min，收集上层液体；微滤膜过滤，收集过滤液；再经过超滤膜进行超滤，收集超滤液，泵入脱色罐进行脱色处理，脱色罐中添加占超滤液质量0.3%的粉状活性炭，控制脱色罐内的温度为45℃，pH在6.5，脱色时间为30min，板框过滤去除活性炭，收集清液，浓缩成原体积的四分之一，然后进入等电罐，缓慢降温至18℃，调节成pH为6.2的等电溶液，沉降18小时；离心收集苏氨酸湿晶体，将湿晶体烘干，即得；

所述微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，微滤温度为40℃；所述超滤膜为聚偏氟乙烯超滤膜，截留分子量为300Da，超滤温度为40℃。

实施例4

分析测定方法。

菌体浓度的测定：采用紫外可见分光光度计在波长 600 nm 条件下测定菌体 OD值。

发酵液中苏氨酸的测定：不同时间点抽取发酵液，离心，上清液用于测定苏氨酸的产量，采用纸层析法测定苏氨酸的产量。

一、N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸对菌体生长的影响。

对比1：发酵培养基和营养液中均不添加N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸，其余同实施例1；

对比2：发酵培养基和营养液中均不添加N-甲基天冬氨酸，其余同实施例1；

对比3：发酵培养基和营养液中均不添加甲硫氨酸，其余同实施例1；

实验组：实施例1。

设置不同的时间点检测菌体的OD₆₀₀值，时间点分别选择0,12,24,36,48,60,72。

如图1所示，横向数据分析，随着发酵时间的增加，菌体的浓度迅速提升，36h达到最大值，峰值为57.9（OD₆₀₀值），随后菌体的浓度没有明显增加，维持在一个稳定的状态，发酵至72h时，菌体浓度下降明显，可能是培养环境恶化的原因；纵向观察，各组别在发酵前期（24h之内），菌体的浓度没有明显差异，随着发酵时间的增加，实验组的菌体浓度高于对比1和对比3，与对比2比较接近，通过研究各组别的菌体浓度峰值，对比1最低，其次是对比3，对比2和实验组没有明显差异；结论，N-甲基天冬氨酸对菌体的生长没有明显的改变，而甲硫氨酸在一定程度上能够提高菌体的生长速率。

二、N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸对苏氨酸产量的影响。

对比1：发酵培养基和营养液中均不添加N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸，其余同实施例1；

对比2：发酵培养基和营养液中均不添加N-甲基天冬氨酸，其余同实施例1；

对比3：发酵培养基和营养液中均不添加甲硫氨酸，其余同实施例1；

实验组：实施例1。

设置不同的时间点检测苏氨酸产量（g/L），时间点分别选择0,12,24,36,48,60,72。

如图2所示，横向数据分析，发酵初期，随着发酵时间的增加，苏氨酸含量增幅缓慢，发酵中期，菌体浓度较大，处于比较稳定的阶段，此时，苏氨酸产量增幅明显，60h左右达到峰值；纵向数据分析，发酵初期，由于各组别的苏氨酸产量均处于低位，各组别的产量差异不大，发酵中后期，各组别均有明显的提升，通过对比各组别的峰值产量发现，对比1最低，其次是对比2，再次是对比3，最高的是实验组，说明，N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸均能够提升苏氨酸的产量，二者协同作用，较不添加N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸的对比1相比，提升了23个百分点。

三、发酵培养基中N-甲基天冬氨酸和甲硫氨酸的添加量对苏氨酸产量的影响。

N-甲基天冬氨酸的浓度梯度设置为：0,25,50,75,100,125,150（mg/L），检测各浓度梯度下的苏氨酸最大产量，绘制曲线，如图3所示，N-甲基天冬氨酸对苏氨酸的产量存在一定的正向调控作用，考虑到成本等因素，选择50-100mg/L的添加量最为合适。

甲硫氨酸的浓度梯度设置为：0,10,20,30,40,50,60（mg/L），检测各浓度梯度下的苏氨酸最大产量，绘制曲线，如图4所示，甲硫氨酸能够调升黄色短杆菌发酵苏氨酸的产量，选择20-30mg/L的添加量最为合适。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。