阅读说明：本技术 一种提高赖氨酸发酵效率的方法 (Method for improving lysine fermentation efficiency ) 是由 董力青 唐永强 白红兵 汲广习 关健 韩杨 于晶 李航 于 2019-12-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于氨基酸发酵技术领域,公开了一种提高赖氨酸发酵效率的方法,其包括如下步骤：将产赖氨酸的黄色短杆菌按照4-8%的接种量接入到发酵培养基中,发酵温度：0-18h为31℃,18h-结束为34℃,通风比1:0.6-0.8,搅拌转速200-400r/min,发酵总时间为50-60h；发酵过程中,通过流加葡萄糖溶液维持残糖含量在5-10g/L,通过流加硫酸铵溶液维持氨氮含量为1-2g/L,流加氨水控制pH7.0-7.2,流加消泡剂消泡。本发明方法提高了赖氨酸产酸效率和糖酸转化率。(The invention belongs to the technical field of amino acid fermentation, and discloses a method for improving lysine fermentation efficiency, which comprises the following steps: inoculating the lysine-producing brevibacterium flavum into a fermentation medium according to the inoculation amount of 4-8%, wherein the fermentation temperature is as follows: the temperature of 0-18h is 31 ℃, the temperature of 18 h-end is 34 ℃, the ventilation ratio is 1:0.6-0.8, the stirring speed is 200-; in the fermentation process, the residual sugar content is maintained at 5-10g/L by feeding glucose solution, the ammonia nitrogen content is maintained at 1-2g/L by feeding ammonium sulfate solution, the pH value is controlled at 7.0-7.2 by feeding ammonia water, and defoaming agent is fed for defoaming. The method improves the acid production efficiency and the sugar acid conversion rate of the lysine.)

一种提高赖氨酸发酵效率的方法

技术领域

本发明属于氨基酸发酵技术领域，具体涉及一种提高赖氨酸发酵效率的方法。

背景技术

赖氨酸又称L-赖氨酸、溶氨酸等，是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸之一，目前，全球赖氨酸产量已达240余万吨，仅次于谷氨酸，成为全球产量第二大氨基酸品种。而赖氨酸渣是以赖氨酸废液为原料通过微生物发酵生产出的菌体蛋白饲料新产品，属于生物发酵液废液处理领域，伴随赖氨酸的生产。赖氨酸废液中含有大量的：菌体蛋白、COD、BOD、还原糖、赖氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸等，此外，尚含有P、K、Ca等微量无机盐。

赖氨酸衍生产品在国外发展较早。美国、法国、德国、日本等国家对赖氨酸的合成、分离、应用等方面进行了一系列的研究。特别是日本在赖氨酸生产和废液处理方面有一定的优势，味之素公司是世界上最大的赖氨酸生产企业。该公司生产的赖氨酸占据全球市场60％以上的份额，味之素欧洲公司赖氨酸生产能力为3.5万吨。味之素Heetleand公司生产能力l万吨。该公司为扩大市场占有率，计划将其赖氨酸产能提高到5万吨。每生产10万吨赖氨酸，可回收理论菌体蛋白1万吨。同样随着市场竞争的加剧，赖氨酸行情的不好，如何降低生产成本成了各大企业研究的方向。

菌体蛋白是氨基酸生产过程中的副产品，是氨基酸生产菌发酵氨基酸经分离、干燥后制成的一种细胞蛋白，通过测定氨基酸菌体蛋白的组成发现其中含有丰富的蛋白质、核酸、糖类及维生素等多种营养物质。将菌体蛋进行提取，作为原料可以开发出具有高附加值的产品。目前大多数氨基酸生产厂家以氨基酸菌体蛋白生产菌体蛋白饲料，降低了氨基酸的生产成本，避免可用资源浪费，取得了一定的经济效益，但是工业附加值仍然较低。申请人之前的专利技术“CN201810634938.7，赖氨酸发酵培养基的制备工艺”，其包括如下步骤：

将玉米皮处理物，玉米浆，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，七水硫酸亚铁，七水硫酸镁，乙酸钙，甘露醇，生物素，维生素，依次添加到水中，搅拌均匀，调pH6.8，121℃保温20min灭菌，冷却，即得。该工艺中使用了玉米皮处理物作为碳源，有效解决了发酵企业中玉米皮的存储以及浪费问题，降低了发酵成本，提高了企业利润；但是该培养基适用于谷氨酸棒状杆菌，并不适合大肠杆菌以及黄色短杆菌等菌株发酵赖氨酸。文献“一株产L-赖氨酸菌株发酵培养基的响应面优化，现代食品科技2012年” 在研究葡萄糖、硫酸铵、豆饼水解液、KH2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O七个单因素实验的基础上，对培养基进行了优化，适合黄色短杆菌发酵使用，但是仍然存发酵培养基成本高以及发酵效率低下的缺陷。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中菌体蛋白附加值低，赖氨酸发酵培养基成本高，赖氨酸效率低下等缺陷，提供了一种提高赖氨酸发酵效率的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种提高赖氨酸发酵效率的方法，其包括如下步骤：

将产赖氨酸的黄色短杆菌按照4-8%的接种量接入到发酵培养基中，发酵温度：0-18h为31℃，18h-结束为34℃，通风比1:0. 6-0.8，搅拌转速200-400r/min，发酵总时间为50-60h；发酵过程中，通过流加葡萄糖溶液维持残糖含量在5-10g/L，通过流加硫酸铵溶液维持氨氮含量为1-2g/L，流加氨水控制 pH7.0-7.2，流加消泡剂消泡。

进一步地，所述发酵培养基包括菌体蛋白酒糟联合水解物。

进一步地，所述发酵培养基包括如下组分：菌体蛋白酒糟联合水解物，葡萄糖，糖蜜，硫酸铵，柠檬酸钠，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，四水硫酸锰，七水硫酸亚铁，维生素B₁，生物素。

进一步地，所述发酵培养基包括如下组分：菌体蛋白酒糟联合水解物200ml/L，葡萄糖40g/L，糖蜜12g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸钠5g/L，磷酸二氢钾10g/L，七水硫酸镁0.8g/L，四水硫酸锰0.02g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，维生素B₁ 0.01g/L，生物素0.5mg/L。

进一步地，所述菌体蛋白酒糟联合水解物按照如下工艺制备而得：步骤（1）制备菌体蛋白初级水解液，步骤（2）制备玉米酒糟初级水解液，步骤（3）联合酶解。

优选地，所述菌体蛋白酒糟联合水解物按照如下工艺制备而得：

步骤（1）制备菌体蛋白初级水解液：将菌体蛋白研磨粉碎，然后添加到10倍重量的浓度为0.6M的盐酸溶液中，搅拌均匀，然后置于高速剪切机中以8000-10000rpm的速度剪切60-120s，静置60min，再以超声波处理，静置3h，得到菌体蛋白初级水解液；

步骤（2）制备玉米酒糟初级水解液：将玉米酒糟添加到3倍重量的水中，升温至60℃，微波处理，然后调整溶液的pH为4.5，再添加纤维素酶和葡萄糖淀粉酶，酶解时间为12-24h，得到玉米酒糟初级水解液；

步骤（3）联合酶解：将菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液按照1:1的体积比混合，然后调整pH为3.0，温度为40℃，再添加酸性蛋白酶，酶解时间为5-10h，然后调整pH为7.0，温度为50℃，再添加沙雷肽酶，酶解时间为5-10h，灭酶，然后通过过滤网进行过滤，去除絮状物和不溶颗粒，收集滤过液，即得。

更优选地，所述超声波处理参数为：每次超声时间为6s，间歇3s，超声总时间为90-270s，超声频率为25kHz。

更优选地，所述微波处理的参数为：微波处理时间为10-20min，微波功率为500W。

更优选地，所述纤维素酶和葡萄糖淀粉酶的添加量分别为5万U/L和3万U/L。

更优选地，所述酸性蛋白酶的添加量为15万U/L，所述沙雷肽酶的添加量为10万U/L。

与现有技术相比，本发明的研究出发点和取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

菌体蛋白水解产物是较好的氮源，酒糟水解产物可以作为氮源和碳源，将二者进行联合水解，选择合适的比例，可以用来替代赖氨酸发酵培养基使用的氮源和碳源，还能够提供营养因子和无机矿物质，从而有利于黄色短杆菌发酵；但是二者的联合水解方法是难点，也是需要克服的技术难题。

菌体蛋白含有大量的微生物蛋白，但是首先需要进行破壁处理；酒糟的主要组分是淀粉、纤维素以及植物蛋白，首先需要进行的是降解纤维素，使得蛋白结构更加松散，以利于后续的蛋白水解；因此，选择初始步骤各自进行，然后合并进行蛋白水解，以获得营养成分均衡丰富的水解产物。

本发明采用微波辅助酶解的方式，能够降低纤维素、淀粉以及蛋白的结合程度，提高了各组分的浸出率，有利于后续的水解反应，降低酶的使用量，并且将纤维素和淀粉降解成微生物可以利用的还原糖，从而达到提供碳源的目的。

本发明采用高速剪切和超声波处理在稀盐酸条件下进行处理，能够加速菌体细胞壁的破碎，使得蛋白质变的疏松，内部结构发生变化，提高蛋白溶解性和亲水性，还能够增加传质速率，降低粘度，有利于后续酶解。

本发明根据酶的不同特性，采用酸性蛋白酶和沙雷肽酶先后酶解的方式，两种酶均处于最佳的酶解反应体系，水解度明显优于较单独使用酸性蛋白酶或者沙雷肽酶。

通过研究赖氨酸代谢流程分布可以发现，减少TCA循环的代谢流量有利于赖氨酸的积累，柠檬酸钠能够对TCA循环中的关键酶柠檬酸脱氢酶产生一定的抑制作用，从而通过减少TCA循环的代谢流向来促进赖氨酸的积累；由于赖氨酸的积累从发酵前期已经开始，因此选择在发酵培养基中添加一定量的柠檬酸钠。

附图说明

图1：酶组合方式对蛋白水解度的影响；

图2：柠檬酸钠添加量对赖氨酸产量的影响；

图3：柠檬酸钠添加量对糖酸转化率的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

利用菌体蛋白制备赖氨酸发酵培养基的方法，其包括如下步骤：

按照以下浓度取各原料：菌体蛋白酒糟联合水解物200ml/L，葡萄糖40g/L，糖蜜12g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸钠5g/L，磷酸二氢钾10g/L，七水硫酸镁0.8g/L，四水硫酸锰0.02g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，维生素B₁ 0.01g/L，生物素0.5mg/L；

将各原料依次添加到水中，搅拌均匀，用100g/L的NaOH水溶液调pH至7.8， 115℃灭菌10min，即得。

本发明发酵培养基相对于常规培养基的改进之处主要包括：

常规培养基：葡萄糖80g/L，玉米浆10g/L，糖蜜12g/L，硫酸铵8g/L，磷酸二氢钾10g/L，七水硫酸镁0.8g/L，四水硫酸锰0.02g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，维生素B₁ 0.01g/L，生物素0.5mg/L；

使用菌体蛋白酒糟水解液替代玉米浆和部分硫酸铵作为发酵氮源；

使用菌体蛋白酒糟水解液替代部分葡萄糖作为发酵碳源；

在发酵培养基中添加柠檬酸钠。

所述菌体蛋白酒糟联合水解产物按照如下工艺制备得到：

菌体蛋白：利用高速碟片分离机将黄色短杆菌生产赖氨酸的发酵液中的菌体蛋白分离，回收菌体蛋白，烘干。

玉米酒糟：干物质90%。

将菌体蛋白研磨粉碎，然后添加到10倍重量的浓度为0.6M的盐酸溶液中，搅拌均匀，然后置于高速剪切机中以10000rpm的速度剪切90s，静置60min，再以超声波处理，每次超声时间为6s，间歇3s，超声总时间为180s，超声频率为25kHz，再静置3h，得到菌体蛋白初级水解液；

将玉米酒糟添加到3倍重量的水中，升温至60℃，微波处理15min，微波功率为500W，然后调整溶液的pH为4.5，再添加纤维素酶和葡萄糖淀粉酶，添加量分别为5万U/L和3万U/L，水解24h，95℃灭酶3min，得到玉米酒糟初级水解液；

将菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液按照1:1的体积比混合，然后调整pH为3.0，温度为40℃，再添加酸性蛋白酶，添加量为15万U/L，酶解时间为6h，然后调整pH为7.0，温度为50℃，再添加沙雷肽酶，添加量为10万U/L，酶解时间为6h，灭酶，然后通过过滤网进行过滤，过滤网孔径为200目，去除絮状物和不溶颗粒，收集滤过液，即得。

实施例2

利用菌体蛋白制备赖氨酸发酵培养基的方法，其包括如下步骤：

按照以下浓度取各原料：菌体蛋白酒糟联合水解物200ml/L，葡萄糖40g/L，糖蜜12g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸钠5g/L，磷酸二氢钾10g/L，七水硫酸镁0.8g/L，四水硫酸锰0.02g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，维生素B₁ 0.01g/L，生物素0.5mg/L；

将各原料依次添加到水中，搅拌均匀，用100g/L的NaOH水溶液调pH至7.8， 115℃灭菌10min，即得。

菌体蛋白酒糟联合水解产物的制备方法为：

将菌体蛋白研磨粉碎，然后添加到8倍重量的浓度为0.5M的盐酸溶液中，搅拌均匀，然后置于高速剪切机中以8000rpm的速度剪切120s，静置60min，再以超声波处理，每次超声时间为6s，间歇3s，超声总时间为270s，超声频率为25kHz，再静置5h，得到菌体蛋白初级水解液；

将玉米酒糟添加到4倍重量的水中，升温至60℃，微波处理10min，微波功率为500W，然后调整溶液的pH为4.5，再添加纤维素酶和葡萄糖淀粉酶，添加量分别为5万U/L和3万U/L，水解18h，95℃灭酶3min，得到玉米酒糟初级水解液；

将菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液按照1:2的体积比混合，然后调整pH为3.0，温度为40℃，再添加酸性蛋白酶，添加量为15万U/L，酶解时间为5h，然后调整pH为7.0，温度为50℃，再添加沙雷肽酶，添加量为10万U/L，酶解时间为5h，灭酶，然后通过过滤网进行过滤，过滤网孔径为200目，去除絮状物和不溶颗粒，收集滤过液，即得。

实施例3

利用发酵培养基发酵生产赖氨酸的工艺，其包括如下步骤：

50L全自动发酵罐中装液量30L发酵培养基，菌株选用黄色短杆菌XQ90；将黄色短杆菌按照5%的接种量接入到发酵培养基中，接种浓度为2g/L，发酵温度：0-18h 为31℃，18h-结束为34℃，通风比1:0.7，搅拌转速300r/min，发酵总时间为60h；发酵过程中，通过流加500g/L的葡萄糖溶液维持残糖含量在5-10g/L，通过流加300g/L的硫酸铵溶液维持氨氮含量为1-2g/L，流加氨水控制 pH7.0-7.2，流加消泡剂消泡。

实施例4

菌体蛋白酒糟联合水解物中各指标检测方法。

凯氏定氮法测定总蛋白；蛋白水解度测定方法采用茚三酮显色法测定水解度；还原糖含量的测定：DNS法。

1、各因素对玉米酒糟初级水解液的还原糖和可溶性蛋白含量的影响。

组别1：不采用微波处理，其余同实施例1；

组别2：不添加纤维素酶，其余同实施例1；

组别3：不添加葡萄糖淀粉酶，其余同实施例1；

组别4：本发明实施例1。

具体见表1。

表1

组别	还原糖含量g/L	可溶性蛋白含量g/L
			1	103.6	48.6
2	85.1	37.1
			3	78.5	42.6
4	127.3	57.9

结论：如表1所示，采用微波辅助酶解的方式，能够降低纤维素、淀粉以及蛋白的结合程度，提高了蛋白的浸出率，有利于后续的水解反应，纤维素酶和葡萄糖淀粉酶能够有效地降解纤维素和淀粉，转化为可被微生物可以利用的还原糖，从而达到提供碳源的目的。

2、不同的酶及其组合方式对蛋白水解度的影响。

组1：仅使用酸性蛋白酶，添加量为25万U/L，酶解时间为12h；组2：仅使用沙雷肽酶，添加量为25万U/L，酶解时间为12h；组3：同时添加两种酶，其余同实施例1；组4：实施例1。如图1所示，与组1-3相比较，组4采用两种酶先后酶解的方式，水解度最高，可达到59.4%，尽管组3和组4添加酶的种类和量均相同，但是水解度仅为50.6%，主要原因是两种酶的最适温度和pH无法保持一致，导致酶活浪费严重，而使用单一的酶进行水解时，水解方式单一，水解度较低。

3、不同培养基对发酵产赖氨酸的影响。

培养基1：葡萄糖80g/L，玉米浆10g/L，糖蜜12g/L，硫酸铵8g/L，磷酸二氢钾10g/L，七水硫酸镁0.8g/L，四水硫酸锰0.02g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，维生素B₁ 0.01g/L，生物素0.5mg/L。

培养基2：菌体蛋白酒糟联合水解物（菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液按照1:1体积比混合）200ml/L，葡萄糖40g/L，糖蜜12g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸钠5g/L，磷酸二氢钾10g/L，七水硫酸镁0.8g/L，四水硫酸锰0.02g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，维生素B₁0.01g/L，生物素0.5mg/L。

培养基3：菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液按照1:2体积比混合；其余同培养基组分同培养基2。

培养基4：菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液按照1:3体积比混合；其余同培养基组分同培养基2。

培养基5：菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液按照1:4体积比混合；其余同培养基组分同培养基2。

各组别培养基发酵工艺相同，均参照实施例3。赖氨酸产量和糖酸转化率见表2。

表2

培养基类型	赖氨酸产量g/100ml	糖酸转化率%
			1	147.4	49.3
2	156.7	51.2
			3	155.9	50.8
4	150.1	49.9
			5	146.4	49.4

如表2所示，菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液在1:1时制备的水解产物，发酵产赖氨酸产量最高，糖酸转化率也最高，随着比例的增大，赖氨酸产量和糖酸转化率均有所下降；可能原因是，选择菌体蛋白初级水解液和玉米酒糟初级水解液在1:1-2时得到的水解产物中氮源和碳源最为合理，而且降低了成本，优于现有技术常用的培养基类型1。

4、柠檬酸钠添加量对发酵效果的影响。

选择柠檬酸钠的添加量为0,1,2,3,4,5,6,7,8，单位为g/L，其余组分同实施例1，验证不同添加量的柠檬酸钠对赖氨酸产量和糖酸转化率的影响，如图2-3所示，随着柠檬酸钠添加量的增加，糖酸转化率和赖氨酸产量随之提高，主要原因是，柠檬酸钠能够对TCA循环中的关键酶柠檬酸脱氢酶产生抑制作用，从而通过减少TCA循环的代谢流向来促进赖氨酸的积累，待增大到5g/L时，糖酸转化率和赖氨酸产量均达到峰值，继续增加柠檬酸钠的添加量，糖酸转化率和赖氨酸产量有所下降，可能原因是过度抑制TCA循环对菌株的正常代谢产生不利影响。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。