发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种生长抑素的制备方法，所述制备方法以半胱氨酸的巯基与树脂位点结合来代替常规的羧基结合，得到还原型的全保护线性肽树脂后可以一步实现闭环氧化的同时从树脂上脱落下来，避免了常规方法中需要先将线性肽从树脂上裂解，再进行液相环化才能得到氧化型的环肽产物。

一种生长抑素的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(S1)将R¹-Cys(SH)-OR^I通过其侧链巯基官能团偶联于树脂Resin上，得到氨基酸树脂R¹-Cys(S-Resin)-OR^I；

(S2)在所述氨基酸树脂R¹-Cys(S-Resin)-OR^I上依次偶联其它保护氨基酸和/或保护肽片段，得到还原型的全保护线性肽树脂R¹⁴-Ala-Gly-Cys(R^H)-Lys(R^G)-Asn(R^F)-Phe-Phe-Trp(R^E)-Lys(R^D)-Thr(R^C)-Phe-Thr(R^B)-Ser(R^A)-Cys(S-Resin)-OR^I；

(S3)将所述还原型的全保护线性肽树脂闭环氧化，得到全保护环肽；

(S4)将所述全保护环肽脱除侧链保护基团，得到所述生长抑素；

R¹、R¹⁴为氨基酸的主链氨基保护基团，选自氨基保护基团中的任一种；

R^I为Cys的主链羧基保护基团，选自羧基保护基团中的任一种；

R^A、R^B、R^C、R^D、R^E、R^F、R^G、R^H为氨基酸的侧链保护基团；

其中，R^A为Ser的侧链保护基团，选自Ser侧链保护基团中的任一种；

R^B、R^C为Thr的侧链保护基团，独立地选自Thr侧链保护基团中的任一种；

R^D、R^G为Lys的侧链保护基团，独立地选自Lys侧链保护基团中的任一种；

R^E为Trp的侧链保护基团，选自Trp侧链保护基团中的任一种；

R^F为Asn的侧链保护基团，选自Asn侧链保护基团中的任一种；

R^H为Cys的侧链保护基团，选自Cys侧链保护基团中的任一种；

所述树脂含有与巯基反应的活性位点。

可选地，所述氨基保护基团选自H、Fmoc、Boc、Dde、ivDde、Mtt、MMt、Alloc中的任一种；

所述羧基保护基团选自^tBu、OAll、OBzl中的任一种；

所述Ser侧链保护基团选自^tBu、Bzl、Z中的任一种；

所述Thr侧链保护基团选自^tBu、Bzl、Z中的任一种；

所述Lys侧链保护基团选自Boc、Dde、ivDde、Mtt、MMt、Alloc中的任一种；

所述Trp侧链保护基团选自Boc、For、Z中的任一种；

所述Asn侧链保护基团选自Trt、Xan、Dmb中的任一种；

所述Cys侧链保护基团选自Meb、Mob、Trt、Acm、Tacm、^tBu、H、Mtt、MMt中的任一种；

所述与巯基反应的活性位点选自卤素基团中的任一种；

可选地，所述卤素基团选自-Cl、-Br、-I中的任一种；

可选地，所述树脂选自Trt氯树脂中的任一种；

可选地，所述Trt氯树脂选自三苯甲基氯树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、甲基三苯甲基氯树脂、甲氧基三苯甲基氯树脂中的任一种；

可选地，所述树脂的取代度为0.3～1.5mmol/g。

可选地，所述(S1)包括以下步骤：

在含有树脂、R¹-Cys(SH)-OR^I、溶剂I的原料I中加入碱性试剂，反应I，加入封端试剂反应II；得到所述氨基酸树脂；

可选地，所述碱性试剂包括NMM、(Et)₃N、DIEA、吡啶、醋酸钠、三甲基吡啶中的至少一种；

所述溶剂I包括DCM、NMP、DCE、TCM、DMF中的至少一种；

所述封端试剂包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇中的至少一种；

可选地，所述树脂、R¹-Cys(SH)-OR^I、溶剂I、碱性试剂、封端试剂的比例为1mmol：1～3mmol：10～30ml：2～6mmol：0.5～3.5ml；

可选地，所述反应I的条件包括：非活性气体条件下，时间为4～5h，温度为20～30℃；

可选地，所述反应II的时间为20～40min，温度为20～30℃；

可选地，所述原料I中还含活化剂，所述原料I经过活化处理；

可选地，所述活化剂包括碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种；

可选地，所述活化剂与R¹-Cys(SH)-OR^I的摩尔比为0.5～1：1；

可选地，所述活化处理的条件包括：时间为40～60min。

可选地，(S2)中所述依次偶联其它保护氨基酸和/或保护肽片段具体为从所述氨基酸树脂R¹-Cys(S-Resin)-OR^I依次偶联以下保护氨基酸和/或保护肽片段：

R²-Ser(R^A)-OH、R³-Thr(R^B)-OH、R⁴-Phe-OH、R⁵-Thr(R^C)-OH、R⁶-Lys(R^D)-OH、R⁷-Trp(R^E)-OH、R⁸-Phe-OH、R⁹-Phe-OH、R¹⁰-Asn(R^F)-OH、R¹¹-Lys(R^G)-OH、R¹²-Cys(R^H)-OH、R¹³-Gly-OH、R¹⁴-Ala-OH；

或

R²-Ser(R^A)-OH、R³-Thr(R^B)-OH、R⁴-Phe-OH、R⁵-Thr(R^C)-OH、R⁶-Lys(R^D)-OH、R⁷-Trp(R^E)-OH、R⁸-Phe-OH、R⁹-Phe-OH、R¹⁰-Asn(R^F)-OH、R¹¹-Lys(R^G)-OH、R¹²-Cys(R^H)-OH、R¹⁴-Ala-Gly-OH；

其中，R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵为主链氨基保护基团，选自氨基保护基团中的任一种；

可选地，所述氨基保护基团选自H、Fmoc、Boc、Dde、ivDde、Mtt、MMt、Alloc中的任一种。

可选地，(S2)中所述的偶联包括以下步骤：

将前一次偶联得到的氨基酸树脂或肽树脂脱去主链氨基保护得到中间体；

将含有将要偶联的保护氨基酸或保护肽片段、缩合剂、溶剂II的溶液预活化，加入所述中间体进行偶联反应，完成所有保护氨基酸和/或保护肽片段的偶联后，得到所述还原型的全保护线性肽树脂。

可选地，所述脱去主链氨基保护具体为：

将含有前一次偶联得到的氨基酸树脂或肽树脂和脱保护剂溶液的原料进行脱保护反应；

可选地，所述脱保护剂溶液中的脱保护剂选自Pip、DBU、NH₂NH₂中的任一种；

所述脱保护剂溶液中的溶剂选自DMF、NMP、DCM、TCE、DCE中的一种或其组合；

可选地，所述脱保护剂溶液选自5～30％Pip、0.5～2％DBU、1～3％NH₂NH₂中的任一种。

可选地，前一次偶联得到的氨基酸树脂或肽树脂和脱保护剂溶液的体积比为1：2～3；

可选地，所述脱保护反应的条件包括：非活性气体条件下，时间为5～40min；

可选地，所述缩合剂选自以下缩合剂组合中的任一种：DIC/HOBt、DIC/HOOBt、DIC/HOAt、HBTU/NMM、PyBOP/DIEA；

所述溶剂II包括DCM和/或DMF；

可选地，所述前一次偶联得到的氨基酸树脂或肽树脂、将要偶联的保护氨基酸和/或保护肽片段、缩合剂、溶剂II的比例为1mmol：1.5～3mmol：3～6mmol：10～50ml；

可选地，所述预活化的条件包括：预活化时间为5～15min，预活化温度为0～10℃；

可选地，所述偶联反应的条件为：非活性气体条件下，偶联反应时间为1～2h，偶联反应温度为25～35℃。

可选地，(S3)中所述的闭环氧化包括以下步骤：

将含有还原型的全保护线性肽树脂和氧化剂溶液的原料进行闭环氧化反应，得到所述全保护环肽；

可选地，所述氧化剂溶液中的氧化剂选自I₂、TI(TFA)₃、(SCN)₂中的至少一种；

所述氧化剂溶液中的溶剂选自甲醇、乙醇、DMF、DCM、DCE、NMP、TCE、H₂O中的至少一种；

所述氧化剂溶液的浓度为0.01～2mol/L；

所述还原型的全保护线性肽树脂和所述氧化剂溶液的比例为1.88g：30～40ml；

可选地，所述闭环氧化反应的条件包括：非活性气体条件下，反应时间为0.5～2h。

可选地，所述闭环氧化反应结束后，还包括除去树脂的步骤：将闭环氧化反应后的溶液抽滤得到滤液和树脂，树脂用溶剂III洗涤并抽滤得到滤液，合并滤液，得到全保护环肽溶液；

可选地，所述溶剂III选自甲醇、乙醇、DMF、DCM、DCE、NMP、TCE、H₂O中的至少一种；

可选地，所述洗涤次数为2次。

可选地，得到全保护环肽溶液后，还包括除去多余氧化剂的步骤：

在所述全保护环肽溶液中加入还原剂溶液至无色；

可选地，所述还原剂溶液中的还原剂选自维生素C、硫代硫酸钠中的至少一种；

所述还原剂溶液中的溶剂选自甲醇、乙醇、DMF、DCM、DCE、NMP、TCE、H₂O中的至少一种；

所述还原剂溶液的浓度为0.01～2mol/L。

可选地，(S3)中所述的脱除侧链保护基包括以下步骤：

将含有全保护环肽和裂解液的原料进行裂解反应；

可选地，所述裂解液含有TFA和清除剂；

可选地，所述清除剂选自Tis、H₂O、EDT、苯酚、苯甲醚中的至少一种；

可选地，所述裂解液为TFA:Tis:H₂O＝85～95ml：5～10ml：5～10ml；

可选地，所述全保护环肽和所述裂解液的比例为1g：0.5～2ml；

可选地，所述裂解反应的条件包括：裂解时间为1.0～3.0h。

作为一种实施方案，本申请提供了一种生长抑素的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，将树脂载体加入反应器中溶胀后抽去溶剂；

步骤2，将Fmoc-Cys(SH)-O^tBu活化后加入到反应器中，搅拌下加入一定当量的碱，通氮气反应4～5h后加入甲醇反应30min，抽滤，树脂经洗涤、干燥最终得到Fmoc-Cys(S-Resin)-O^tBu，其中以半胱氨酸的巯基与树脂位点结合来代替常规的羧基结合；

步骤3，采用多肽固相合成通用的Fmoc策略依次偶联生长抑素肽序中各个保护氨基酸，得到全保护的线性肽肽树脂；

步骤4，将得到的线性肽树脂使用溶剂溶胀，搅拌下加入氧化剂进行树脂上的二硫键环化，环化反应进行的同时，产物从树脂上转移到溶液中，过滤树脂，收集滤液得到氧化型的全保护环肽粗肽溶液；

步骤5，加入还原剂除去多余的氧化剂；

步骤6，萃取、洗涤、旋蒸得到全保护的环肽粗肽固体；

步骤7，全保护的环肽粗肽固体用裂解液脱除侧链保护基，加入沉降溶剂醚进行沉降、离心得到生长抑素环肽粗肽；

步骤8，环肽粗肽经C18键合硅胶柱反相制备纯化、转盐、冷冻干燥得到最终产品。

上述所述的制备方法，其中所述步骤1是将树脂载体进行溶胀，树脂载体选自：三苯甲基氯树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、甲基三苯甲基氯树脂、甲氧基三苯甲基氯树脂等Trt系列树脂，一些实施例中，树脂载体更优选为：2-氯三苯甲基氯树脂，替代度为0.3～1.5mmol/g，更优选的替代度为0.5～1.0mmol/g。

上述所述的制备方法，其中所述步骤2是将原料Fmoc-Cys(SH)-O^tBu活化后与树脂载体在反应溶剂中进行组装。其中，所述的活化试剂选自：碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾，一些实施例中，优选为碳酸钾；反应溶剂选自：DCM、NMP、DCE、TCM、DMF等一种或多种组成，一些实施例中，所述反应溶剂更优选为：DCM，DMF或DMF/DCM混合溶剂；加入的碱选自：NMM、(Et)₃N、DIEA、吡啶、醋酸钠、三甲基吡啶等一种或多种组成，一些实施例中，所述反应试剂更优选为：DIEA、吡啶、NMM、(Et)₃N；反应温度为20～30℃。

上述所述的制备方法，其中所述步骤3是依次偶联肽序中各保护氨基酸Fmoc-Ser(^tBu)-OH、Fmoc-Thr(^tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(^tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(R^H)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc/Boc-Ala-OH；其中R^H选自Meb、Mob、Trt、Acm、Tacm、^tBu、H、Mtt、MMt等，在一些实施例中，R^H优选为Trt、Acm、Mtt、MMt；缩合试剂选自：DIC/HOBt，DIC/HOAt，HBTU/NMM，PyBOP/DIEA等，优选为DIC/HOBt。

上述偶联肽序中各保护氨基酸可以是不同保护方式下逐个偶连或片段连接(如Fmoc/Boc-Ala-OH、Fmoc/Boc-Ala-Gly-OH等)。

上述所述的制备方法，其中所述步骤4将线性肽树脂进行树脂上的环化。环化反应溶剂选自：DMF、NMP、DCM、四氢呋喃、DCE、TCM、ACN、乙醇、甲醇、H₂O等单一或混合溶剂，在一些实施例中，优选为DCM；所述氧化剂选自：I₂、TI(TFA)₃、(SCN)₂，在一些实施例中，优选为I₂。

上述所述的制备方法，其中所述步骤5是向全保护的环肽粗肽溶液中加入还原剂除去多余的氧化剂，还原剂选自：维生素C、硫代硫酸钠等。

上述所述的制备方法，其中所述步骤6是萃取、洗涤、旋蒸得到全保护的环肽粗肽固体，在一些实施例中，亦可通过调节pH，过滤干燥得到。

上述所述的制备方法，其中所述步骤7是使用裂解液脱除侧链保护基，加入醚沉降、离心得到生长抑素环肽粗肽。裂解液中含有TFA及清除剂，清除剂选自TIS、H₂O、EDT、苯酚、苯甲醚等一种或几种组合，优选裂解液组合为TFA/TIS/H₂O，在一些实施例中裂解液的体积比为：TFA:TIS:H₂O＝90:5:5。

已有的专利路线均是以肽序末端的半胱氨酸的羧基端与树脂位点结合，再逐个偶联氨基酸得到还原型的全保护肽树脂，之后需要使用大量的裂解液对树脂进行裂解，得到的裂解合并液也需使用大量的醚进行沉降、洗涤、离心，得到的还原型产物还需使用大量的溶剂溶解后进行液相环化才能得到氧化型的环肽产物。

本发明优势：本工艺是以半胱氨酸的巯基与树脂位点结合来代替常规的羧基结合，之后逐个偶联氨基酸得到还原型的全保护肽树脂，先使用少量的溶剂在树脂上完成环化，氧化型的环肽自动从树脂上脱落，收集滤液旋蒸得到全保护环肽粗肽，再使用少量裂解液裂解脱除侧链保护基，加入少量的醚进行沉降、洗涤、离心即可得到环肽粗肽。

本工艺获得的环肽可以自动从树脂上脱落，不需要进行肽树脂裂解，操作简便，溶剂/试剂及废液产生量大大减少，还可以避免肽树脂裂解时产生的副产物，粗肽纯度得到提高。同时，不需要进行液相环化操作，直接在固相树脂上一步环化得到氧化型的全保护环肽，得益于固相树脂上活性位点具有的假稀释效应，可以避免分子间二聚、多聚等错搭的杂质产生，因此树脂上进行环化的氧化反应可以在较高的浓度下进行，减少了溶剂的使用，有利于工业化扩大生产。

本申请的英文/缩写说明如下：

本申请能产生的有益效果包括：

(1)本申请所提供的生长抑素的制备方法，以半胱氨酸的巯基与树脂位点结合来代替常规的羧基结合，这样的第一个氨基酸的固定策略可以使后续线性肽的氧化和环化过程在树脂上同时进行，环化反应完成后即可从树脂上脱落，避免了常规方法中需要先将线性肽从树脂上裂解下来，之后再进行液相环化才能得到氧化型的环肽产物。

(2)本申请所提供的生长抑素的制备方法，得到的线性肽树脂在氧化剂作用下进行树脂上的二硫键环化，溶剂使用量少，步骤简单，相较于传统工艺中需要先使用大量的裂解液对树脂进行裂解，得到的裂解合并液也需使用大量的醚进行沉降、洗涤、离心，得到的还原型产物还需使用大量的溶剂溶解后进行液相环化才能得到氧化型的环肽产物的方案，更加环保、节能。