阅读说明：本技术 一种生长抑素的二硫替代物及其制备方法 (Disulfide substitute of somatostatin and preparation method thereof ) 是由 孟祥明 朱良静 方葛敏 朱满洲 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种生长抑素的二硫替代物及其制备方法,通过使用硫醚键替换生长抑素二硫键后得到一种生长抑素二硫替代物,目标多肽是通过Fmoc固相合成方法实现,粗品经纯化,冻干得到生长抑素二硫替代物。本发明的生长抑素二硫替代物相比于生长抑素在二硫苏糖醇还原条件下具有良好的还原稳定性。(The invention discloses a dithio substitute of somatostatin and a preparation method thereof. Compared with somatostatin, the somatostatin disulfide substitute has good reduction stability under the condition of dithiothreitol reduction.)

一种生长抑素的二硫替代物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生长抑素的二硫替代物及其制备方法。

背景技术

生长抑素目前作为一种二硫键环肽药物，半衰期在2到3分钟之间，在治疗食道静脉曲张出血方面有一定的临床价值。研究表明，二硫键与多肽的空间结构和生物活性密切相关，然而，二硫键在体内容易被硫醇和二硫异构酶还原，导致多肽药物结构重排和生物活性的丧失。因此，寻找一种稳定的共价键替换二硫键去约束多肽的空间结构具有重要的意义。

针对生长抑素的二硫键在还原条件下易被断裂的缺陷，本发明旨在提供一种生长抑素的二硫替代物及其制备方法。本发明利用Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH的硫醚键替换生长抑素一对二硫键，以便形成一种结构更加稳定的二硫替代物。本发明的生长抑素二硫替代物在二硫苏糖醇还原条件下相比于现有的生长抑素具有良好的还原稳定性。

本发明生长抑素的二硫替代物，是通过使用二氨基二酸Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH硫醚键替换生长抑素二硫键后获得的。

所述特殊氨基酸Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH的结构式为：

本发明生长抑素的二硫替代物，其结构如下：

本发明生长抑素的二硫替代物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：合成Fmoc-A₂(Ally/Alloy)树脂

将2-CI-Trt树脂用DMF溶胀，加入Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH、DIPEA和DCM的混合液反应，接着加入DCM、MeOH和DIPEA的混合液进行反应，得到Fmoc-A₂(Ally/Alloy)树脂；

步骤2：Fmoc法固相合成生长抑素二硫替代物

将步骤1获得的Fmoc-A₂(Ally/Alloy)树脂转移到固相合成管中，DMF溶胀后采用Fmoc 固相合成法依肽序进行氨基酸的缩合连接，当生长抑素二硫替代物C端第11个氨基酸Fmoc -Lys(Boc)-OH缩合完成之后，脱除树脂肽Alloc和Ally保护基团，Fmoc保护基团后分子内环化，依肽序采用Fmoc固相合成法继续缩合氨基酸；当固相合成结束后，外加切割试剂反应2 小时，冰***沉淀纯化后得到生长抑素二硫替代物H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys- Thr-Phe-Thr-Ser-Ala-OH(Cys3-Ala14，硫醚键)。

具体制备过程如下：

步骤1：合成Fmoc-A₂(Ally/Alloy)树脂

称量12.5mg 2-CI-Trt树脂(载量0.40mmol/g,5umol)于固相合成管中，加入DMF溶胀15 分钟，加入5.68mg Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH，7uL DIPEA，150uL DCM，常温反应2小时，加入100uL DCM/MeOH/DIPEA(17:2:1)，常温封端反应20分钟；树脂依次用DCM、DMF洗涤3次。

步骤2：Fmoc法固相合成生长抑素二硫替代物

2a、将20％哌啶的DMF溶液加入到步骤1所得的Fmoc-A₂(Ally/Alloy)树脂分别浸泡8 分钟和6分钟，DMF洗涤；加入现配制的DIC、Oxyma、生长抑素二硫替代物C端第2个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma：4.5倍当量Fmoc-Ser(tBu)-OH，200 uLDMF)，于55℃反应40分钟，DMF洗涤，接下来氨基酸缩合重复上面的操作，依肽序缩合氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmo c-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH；当生长抑素二硫替代物C端第11个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH缩合完成之后，加入6mg Pd(P Ph₃)₄(5.2umol)、15ul N-甲基苯胺(138.6umol)和250uL THF的混合液，常温避光反应2h；反应结束后，依次用DMF(1mL×3)、DMF配制的0.5％NaS₂CN(C₂H₅)₂溶液(1mL×6)、DCM (1mL×2)、DMF(1mL×2)洗涤树脂；加入20％哌啶的DMF溶液分别浸泡树脂8分钟和6分钟，DMF洗涤；加入13.0mg PyAOP(25umol)、3.5mg HOAT(25umol)、5.7uL NMM(50umol)和250uL DMF的混合液，常温反应4小时，重复缩合一次，DMF洗涤；依肽序继续固相缩合氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH。

2b、当生长抑素二硫替代物固相合成结束后，将树脂用大量DMF、DCM洗涤，自然干燥后，外加切割试剂(TFA：苯酚：水：TIPS＝88:5:5:2,V％)0.3mL-0.5mL处理2小时。收集切割试剂，加入15倍以上体积当量的冰***沉淀，离心粉末状粗肽，半制备HPLC纯化多肽；真空冷冻干燥得到纯化的生长抑素二硫替代物H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ala-OH(Cys3-Ala14，硫醚键)，其HPLC谱如图3，质谱如图4所示，[M+H]+:1619.72、[M+Na]+:1642.65,生长抑素二硫替代物的理论分子量：1618.76，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。

本发明的生长抑素二硫替代物与现有的生长抑素相比，具有还原稳定性，并且在结构上只有一个原子的差别，避免了结构上的较大改变。

附图说明

图1是生长抑素和本发明生长抑素二硫替代物的结构对比示意图。

图2是本发明的合成路线示意图。

图3是生长抑素二硫替代物的HPLC谱图。

图4是生长抑素二硫替代物的质谱图。

图5是生长抑素还原稳定性测试HPLC跟踪图(a)和生长抑素硫类似物还原稳定性测试 HPLC跟踪图(b)。

具体实施方法

以下结合实施例做进一步的说明：

本发明所使用的缩写的含义列于下表：

实施例1：合成Fmoc-A₂(Ally/Alloy)树脂

称量12.5mg 2-CI-Trt树脂(载量0.40mmol/g,5umol)于固相合成管中，加入DMF溶胀15 分钟，加入5.68mg Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH，7uL DIPEA，150uL DCM，常温反应2小时，加入100uL DCM/MeOH/DIPEA(17:2:1)，常温封端反应20分钟；树脂依次用DCM、DMF洗涤3次。

实施例2：Fmoc法固相合成生长抑素二硫替代物

2a、将20％哌啶的DMF溶液加入到实施例1所得的Fmoc-A₂(Ally/Alloy)树脂分别浸泡8 分钟和6分钟，DMF洗涤；加入现配制的DIC、Oxyma、生长抑素二硫替代物C端第2个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma：4.5倍当量Fmoc-Ser(tBu)-OH，200 uLDMF)，于55℃反应40分钟，DMF洗涤，接下来氨基酸缩合重复上面的操作，依肽序缩合氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmo c-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH；当生长抑素二硫替代物C端第11个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH缩合完成之后，加入6mg Pd(P Ph₃)₄(5.2umol)、15ul N-甲基苯胺(138.6umol)和250uL THF的混合液，常温避光反应2h；反应结束后，依次用DMF(1mL×3)、DMF配制的0.5％NaS₂CN(C₂H₅)₂溶液(1mL×6)、DCM (1mL×2)、DMF(1mL×2)洗涤树脂；加入20％哌啶的DMF溶液分别浸泡树脂8分钟和6分钟，DMF洗涤；加入13.0mg PyAOP(25umol)、3.5mg HOAT(25umol)、5.7uL NMM(50umol)和250uL DMF的混合液，常温反应4小时，重复缩合一次，DMF洗涤；依肽序继续Fmoc固相法缩合氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH。

2b、当生长抑素二硫替代物固相合成结束后，将树脂用大量DMF、DCM洗涤，自然干燥后，外加切割试剂(TFA：苯酚：水：TIPS＝88:5:5:2,V％)0.3mL-0.5mL处理2小时。收集切割试剂，加入15倍以上体积当量的冰***沉淀，离心粉末状粗肽，半制备HPLC纯化多肽。真空冷冻干燥得到纯化的生长抑素二硫替代物H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ala-OH(Cys3-Ala14，硫醚键)，其HPLC谱如图3，质谱如图4所示，[M+H]+:1619.72、[M+Na]+:1642.65,生长抑素二硫替代物的理论分子量：1618.76，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。

实施例3：生长抑素和生长抑素二硫替代物还原稳定性比较测试

生长抑素和生长抑素二硫替代物各称取100ug，溶于100uL缓冲溶液(20mM Tris-HCl, PH＝7.4,150mM NaCl,1mM CaCl₂,1mM MgCl₂,0.1％Triton X-100,3mM DTT)。加入DTT使其在缓冲溶液中浓度为3mM。在25℃条件下，利用HPLC在0，0.5，1，2，4，8，16,32分钟分别监测生长抑素和生长抑素二硫替代物的含量变化(图5a，5b)。反应液与等体积的2％ TFA水溶液混合淬灭反应进样。从图5中我们可以看出，在DTT的缓冲溶液中，生长抑素 16分钟后大部分已被还原，而生长抑素二硫替代物基本保持稳定。说明本发明生长抑素二硫替代物在还原环境下比生长抑素稳定。