同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体、载药胶束及制备方法和应用
阅读说明：本技术 同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体、载药胶束及制备方法和应用 (Polymer carrier with pH and redox dual responses, drug-loaded micelle, preparation method and application ) 是由 王娅俐 随何欢 兰杨 张仕瑾 梁婧 苏强 唐志立 陈丽娟 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体、载药胶束及制备方法和应用,该聚合物载体包括亲水外壳和疏水内核,亲水外壳为聚乙二醇嵌段,疏水内核为聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)和聚(L-赖氨酸)连接形成的嵌段。该聚合物载体可装载药物形成载药胶束,该载药胶束可在血液循环中保持较好的完整性,并靶向至肿瘤细胞,当进入肿瘤细胞后,在高浓度的GSH及低pH作用下,二硫键断裂,PDPA核打开,将药物释放到细胞核内,并且在弱酸条件下,载药胶束表面正电荷增加,可提高细胞核对药物的摄取量,进而显著提高了肿瘤治疗过程中药物的传递效果,同时还减少了药物毒性。(The invention discloses a polymer carrier with pH and redox dual responses, a drug-loaded micelle, a preparation method and application thereof. The polymer carrier can carry medicine to form a medicine carrying micelle, the medicine carrying micelle can keep better integrity in blood circulation and target to tumor cells, after entering the tumor cells, under the action of high-concentration GSH and low pH, a disulfide bond is broken, a PDPA core is opened, the medicine is released into a cell core, and under the condition of weak acid, the positive charge on the surface of the medicine carrying micelle is increased, the medicine uptake of the cell core can be improved, the medicine transfer effect in the process of treating the tumor is obviously improved, and the medicine toxicity is reduced.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体、载药胶束及制备方法和应用。
背景技术
化学治疗是临床治疗癌症的主要手段之一，传统化疗药物存在选择性差，易产生耐药性等缺点，在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也造成极大损伤。为有效提高化疗药物的选择性和靶向性，并改善其体内分布，近些年来基于分子靶向策略的药物研究，已成为肿瘤治疗的重要研究热点之一。其中靶向性的聚合物胶束，通过制剂手段将难溶性抗肿瘤药物制成纳米载药系统既增加了难溶性药物的溶解度，显著改善药物在体内的动力学特性，延长在体内血液循环中的循环时间，也提高了药物在靶组织或器官的特异性分布，从而能以最小的药量达到令人满意的治疗效果、减少毒副作用的发生。
尽管聚合物胶束在抗癌药物传输方面显示出巨大的潜力，但是这项技术也面临着巨大的挑战，特别是其通常并不能将药物理想地传送至肿瘤细胞。首先，许多抗癌药，如阿霉素、顺铂等都是靶向核DNA，从而造成DNA损伤或抑制拓扑异构酶以诱导细胞凋亡，其前提是需进入肿瘤细胞内以产生药效。其次，纳米载药系统经注射入体内后，随血液循环到达肿瘤部位，被肿瘤细胞摄取，经溶酶体逃逸后最终释放入核，在此过程中将遭遇许多生理及病理屏障，如早期溶酶体的吞噬等，导致最终进入细胞胞内的仅有小部分药物。此外，聚合物胶束装载的药物进入体内后先在几小时内发生20-30％的药物突释，然后才在较长时间内缓慢的释放，这种过早的突释导致了药物极大的损失，这些情况限制了最终进入肿瘤细胞内的药物分子的数量，影响了药效。因此开发更好的可稳定释药的药物传输系统迫在眉睫，其中，一种较优的解决方案是构建具有智能响应肿瘤微环境释药的给药载体，如氧化还原响应性，pH敏感性。
研究数据表明，人体正常组织的pH值约为7.4，肿瘤部位的pH<6.8，而肿瘤细胞胞内溶酶体的pH约4.5～5.0，已有研究采用在载体中增加pH敏感的嵌段如聚(L-组氨酸)，聚(β-氨基酸酯)等手段来实现pH控制的药物释放。在此基础上，也有报道为解决纳米胶束所载药物进入体内的突释问题，引入了共价交联自组装聚合物胶束，以稳定胶束的结构避免药物损失，这主要是利用肿瘤细胞胞内谷胱甘肽GSH含量(约2-10mM)高于胞外(约2-20μM)100-1000倍的特性，利用GSH来清除二硫键，所以在载体中增加二硫键作为可逆的交联剂成为重要的策略。近年来，对载体材料结构进行修饰，实现载体在不同环境下对负载药物的控释及靶向给药已成为研究热点，因此设计合成新的既对pH敏感同时具有氧化还原响应性的聚合物载体，对实现稳定传输并在细胞质内快速释药具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体、载药胶束及制备方法和应用，该聚合物载体可在血液循环中保持较好的完整性，并靶向至肿瘤细胞，避免药物突释，进而显著提高了药物的利用率。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体，该聚合物载体包括亲水外壳和疏水内核，亲水外壳为聚乙二醇嵌段，疏水内核为聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)和聚(L-赖氨酸)连接形成的嵌段，具体结构如下：
其中，聚乙二醇嵌段的聚合度x为100-130；聚(L-赖氨酸)的聚合度y为8-12，聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)的聚合度z为10-30。
本发明的有益效果为：本发明提供的聚合物载体以聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)亲水端作为外壳，可避免体内内皮网状系统(RES)的识别及蛋白吸附，起到“隐形”的作用，以延长在体内的循环时间；以对pH高度敏感的聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)(Poly2-(diisopropylamino)ethyl methacrylate，PDPA)作为内核，可控制药物在胞内的释放，以L-赖氨酸(L-lysine,L-Lys)为基础形成的可清除的二硫键为载体的中间部分，可避免药物突释。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，聚乙二醇嵌段的聚合度x为113；聚(L-赖氨酸)的聚合度y为10，聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)的聚合度z为20。
进一步，聚乙二醇链接L－赖氨酸嵌段的分子量为6000-7000，优选分子量为6193.25；聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)嵌段的分子量为5500-6500，优选分子量为5948.72。
上述同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备N-Cbz-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐(N-Cbz-L-Lys-NCA)
在氮气保护下，向含有N-Cbz-L-赖氨酸和三光气的容器中加入有机溶剂后搅拌反应直至溶液变澄清，然后对其进行结晶处理，制得N-Cbz-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐；
(2)制备聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)
将N-Cbz-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐分散在溶剂中，然后加入正丁胺，在氮气保护下进行开环聚合反应，制得聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)；
(3)制备聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)-Br
(4)制备PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA
将聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)-Br、CuBr、PMDETA、(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)(DPA)通过原子转移自由基聚合法制得PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA；
(5)制备PEG-PLys-PDPA
将PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA脱Cbz保护，制得PEG-PLys-PDPA。
进一步地，步骤(1)中，N-Cbz-L-赖氨酸与三光气的摩尔比为2-3：1，反应温度为40-60℃，反应时间为1.5-3h。
进一步地，步骤(1)中的有机溶剂为四氢呋喃、DMF或DMSO。
进一步地，步骤(2)中，N-Cbz-L-Lys-NCA与正丁胺的的摩尔比10-20：1，反应温度为25-35℃，反应时间为40-50h。
进一步地，步骤(2)中的溶剂为CH2Cl2、CHCl3、四氢呋喃或DMF。
进一步地，步骤(3)具体过程为：将聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)溶于溶剂中，冰浴条件下加入2-溴-2-甲基丙酰溴，室温反应4-5h，真空去除溶剂，制得聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)-Br。
进一步地，步骤(4)中，PEG-P(N-Cbz-Lys)-Br、CuBr、PMDETA、(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)(DPA)的摩尔比为5-10:1:1:1:1，反应温度为35-45℃，反应时间为7-10h。
进一步地，步骤(5)具体过程为：将PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA溶于三氟乙酸中并搅拌0.5-1h，然后添加溴化氢和乙酸混合溶液并在室温下搅拌20-25h，随后用蒸馏水稀释，并用乙醚剧烈摇动，水相用碱中和，最后透析、纯化，冻干，制得PEG-PLys-PDPA。
进一步地，步骤(5)中的碱为氢氧化钠、碳酸钾或氨水。
采用上述聚合物载体制备载药胶束的方法，包括以下步骤：将聚合物载体和药物混合，通过乳化分散法或溶剂挥发法等方法制备载药胶束。
进一步地，药物为抗肿瘤药物，如阿霉素、紫杉醇等。
上述聚合物载体载药胶束可以用于制备抗肿瘤药物或保健品。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的聚合物载体同时具有pH和氧化还原双响应性能，将抗肿瘤药物装载于聚合物载体中后，形成载药胶束，该载药胶束可在血液循环中保持较好的完整性，并靶向至肿瘤细胞，当进入肿瘤细胞后，在高浓度的GSH及低pH作用下，二硫键断裂，PDPA核打开，将药物释放到细胞核内，并且在弱酸条件下，载药胶束表面正电荷增加，可提高细胞核对药物的摄取量，进而显著提高了肿瘤治疗过程中药物的传递效果，同时还减少了药物毒性。
本发明提供的聚合物载体装载抗肿瘤药物后能在肿瘤细胞尤其是乳腺癌细胞MCF-7内大量蓄积，提高疗效，同时减少分布至正常组织和正常细胞内给药系统的药物释放，降低药物毒性，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为N-Cbz-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐的1H-NMR图谱。
图2为聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)的1H-NMR图谱。
图3为PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA的1H-NMR图谱。
图4为PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA脱Cbz保护制得最终产物PEG-PLys-PDPA的1H-NMR图谱。
图5为不同pH条件下空白胶束和载药胶束的TEM图。
图6为不同pH条件下载药胶束的药物释放曲线图。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种同时具有pH和氧化还原双响应的聚合物载体，、
该聚合物载体包括亲水外壳和疏水内核，亲水外壳为聚乙二醇嵌段，疏水内核为聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)和聚(L-赖氨酸)连接形成的嵌段，具体结构如下：
上述聚乙二醇链接L－赖氨酸嵌段的分子量为6193.25；聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)嵌段的分子量为5948.72。
上述聚合物载体的制备方法包括以下步骤：
上述反应式中，y为10，z为20。
(1)制备N-Cbz-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐(N-Cbz-L-Lys-NCA)
N-Cbz-L-赖氨酸(45.6mmol)和三光气(20.22mmol)在真空下分别在施连克烧瓶中干燥至少20min。在氮气保护下，分别从溶剂干燥系统直接向N-Cbz-L-赖氨酸和三光气中加入209mL和138mL干THF，然后将两反应容器中物质混合，在50℃下搅拌2h，直至溶液变得澄清(浅黄色)，用正己烷/四氢呋喃(v/v＝2-3:1)搅拌结晶得到化合物N-Cbz-L-Lys-NCA。
所得化合物N-Cbz-L-Lys-NCA核磁共振氢谱：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.36(s,5H),6.76(s,1H),5.10(s,2H),4.90(s,1H),4.28(s,1H),3.21(s,2H),1.98(s,1H),1.84(s,2H),1.56(s,3H),1.43(s,1H)，具体的1H-NMR图谱见图1。
(2)利用开环聚合法(ROP)制备聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)
将N-Cbz-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐(N-Cbz-L-Lys-NCA)(45mmol)分散在300ml DMF溶液中，然后将正丁胺(3mmol)添加到N-Cbz-L-Lys-NCA的溶液中，在氮气保护下，将反应混合物在30℃搅拌48h，溶液变澄清并用100ml CHCl3稀释，然后在冰浴下，将混合液倒入600ml乙醚中，以制备聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)，具体的1H-NMR图谱见图2。
(3)制备聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)-Br
将聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)(20mmol)溶于二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加(40mmol)2-溴-2-甲基丙酰溴，室温反应5h，真空去除溶剂，制得聚肽PEG-P(N-Cbz-Lys)-Br。
(4)利用原子转移自由基聚合(ATRP)法制备PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA
将(8mmol)DPA、(0.1mmol)PMDETA和(0.1mmol)PEG-P(N-Cbz-Lys)-Br加入聚合管中，然后加入2ml 2-丙醇和2ml DMF的混合物，在氮气保护下向聚合管中加入(0.1mmol)CuBr，真空密封。在40℃下，反应8h。反应完后，真空去除溶剂，残留物在蒸馏水中透析并冻干得到白色粉末PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA，具体的1H-NMR图谱见图3。
(5)PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA脱Cbz保护
将0.6g的PEG-P(N-Cbz-Lys)-PDPA溶解于6ml三氟乙酸中并搅拌0.5h，然后向溶液中添加溴化氢(HBr)/乙酸(HOAc)混合溶液(1ml，8mmol，8mmol是混合溶液中溴化氢的浓度)并在室温下搅拌24h。随后，用30ml蒸馏水稀释溶液，并用200ml乙醚剧烈摇动。水相用氢氧化钠中和pH 7-8，并使用透析膜与蒸馏水进行透析，将纯化产物的水溶液冻干得到PEG-PLys-PDPA，具体的1H-NMR图谱见图4。
实施例2：
同时具有pH和氧化还原双响应的载药胶束的制备方法包括：将聚合物载体和药物混合，用乳化分散法或溶剂挥发法等不同方法制备载药胶束，具体过程如下：
1、乳化法
先将5mg阿霉素溶于氯仿中，再逐滴加入到含20mg PEG-PLys-PDPA聚合物载体的水溶液中，形成O/W型乳剂，室温搅拌除去有机溶剂，得到载药胶束。
2、溶剂挥发法
将20mg PEG-PLys-PDPA聚合物载体和5mg阿霉素溶于四氢呋喃，逐滴缓慢加入到水中，室温搅拌除去有机溶剂，得到载药胶束。
实施例3：载药胶束的功能测定
1、pH和氧化还原响应性
用DLS测试不同pH(GSH)作用时间、不同浓度的GSH条件下敏感胶束的粒径变化，并于TEM下观察形态，结果见图5。
由于胶束存在羧基与可裂解的双硫键，在酸性还原性环境中可以裂解。如5图所示，载药胶束在pH7.4 PBS环境中性质稳定，粒子表面结构清晰，大小均一，在6.0介质中，部分质子离子间的平衡被破坏，但粒径变化不是很显著，而在pH5.0和10mM GSH的双重刺激下条件下，载体胶束粒径显著增大，胶束结构破坏，从而实现药物是释放。综上所述，在GSH的单一作用下，双硫键断裂，在酸性介质中，静电作用被破坏；只有在两者的共同作用下，载药胶束的结构才能完全破坏，充分表明该载药胶束具有显著pH和氧化还原响应性。
2、体外释放行为
采用透析袋法测定不同pH(GSH)作用时间、不同浓度的GSH条件下PLD-DOX纳米胶束的体外释放情况。以DOX的生理盐水稀释液作为对照，样品离心取上层清液用RP-HPLC测定样品中DOX的含量，每组设置三个平行样，累加法计算平均累积释放量，并绘制释放曲线，结果见图6。
如6图所示为载药胶束在不同pH环境中的药物释放行为。测定药物含量表明释放特性，进行比较，结果表明载药胶束的药物释放具有显著的pH依赖性，在pH5.0环境下的释放比pH7.4更快更多，5h条件下就能达到将近100％释放，而pH7.4条件只有约20％，显示了载药胶束的酸响应性。
3、体外抗肿瘤活性
采用MTT染色法测量本发明制得的载药胶束和游离阿霉素DOX对人乳腺癌细胞株(MCF-7)的存活率，以评估载药制剂对肿瘤细胞的抑制作用。
具体为：将本发明制得的载药胶束稀释到一系列梯度药物浓度，同时分别制备相同浓度的自由药物盐酸阿霉素作为对照。分别将载药胶束与乳腺癌细胞共培养48h，然后利用MTT法测定细胞的相对活性。
由结果可知，开始阶段如药物浓度为0.1ug/mL时，载药胶束组细胞活性为80％，而阿霉素组细胞活性为52％，与阿霉素组相比，癌细胞活性随药物浓度的增加，其活性逐渐降低，当载药胶束中药物浓度为10μg/mL时，细胞活性与自由阿霉素组的细胞活性一致大约为18％，说明本发明制得的载药胶束对癌细胞能够高效杀伤能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。