一种鸡ezh2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法
阅读说明：本技术 一种鸡ezh2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法 (Research method for influence of chicken EZH2 gene on neoplastic diseases ) 是由 郁川 朱文文 张贺伟 程相朝 田文静 宋敏杰 王聪慧 于 2021-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法,包括S1.纯化鸡EZH2原核蛋白,得到EZH2蛋白样品；S2.将纯化后的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养,测定EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响；S3.于不同时间提取细胞总RNA,检测MDV相关基因的表达水平并进行分析,测定EZH2原核表达蛋白对MDV相关基因的表达水平的影响；实验证明,鸡EZH2蛋白可影响MSB1细胞的增殖,且影响该细胞中MDV Meq和gB基因的表达,为进一步探究鸡EZH2在MDV感染致肿瘤中的作用机制研究奠定了基础。(The invention discloses a method for researching influence of chicken EZH2 gene on neoplastic diseases, comprising S1, purifying chicken EZH2 prokaryotic protein to obtain an EZH2 protein sample; s2, co-culturing the purified chicken EZH2 prokaryotic expression protein and an MSB1 cell, and determining the influence of the EZH2 prokaryotic expression protein on the MSB1 cell proliferation; s3, extracting total RNA of cells at different time, detecting and analyzing the expression level of the MDV related gene, and determining the influence of the EZH2 prokaryotic expression protein on the expression level of the MDV related gene; experiments prove that the chicken EZH2 protein can influence the proliferation of MSB1 cells and the expression of MDV Meq and gB genes in the cells, and lays a foundation for further researching the action mechanism of the chicken EZH2 in MDV infection-induced tumors.)
技术领域
本发明涉及基因治疗技术领域，具体涉及一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法。
背景技术
EZH2(enhancer of zeste homolog 2)即Zeste增强子同源物2，是PRC2(多梳蛋白抑制复合体2)的主要组成部分，又可以称之为组蛋白赖氨酸甲基转移酶，表观遗传学领域的研究和实验已经证明靶向EZH2抑制剂可抑制PRC2的致癌活性，能够对癌细胞的发生、入侵与扩散形成一定的阻碍作用；由此可见EZH2在靶向治疗恶性疾病领域中的重要意义；
马立克氏病(MD)是由马立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的高度传染性肿瘤性疾病，以引起T细胞瘤为特点，Meq(MDV Eco Q片段编码蛋白)是MDV基因组中重要的致癌基因，在潜伏肿瘤细胞中始终表达。Meq编码bZIP蛋白，其在N末端具有亮氨酸拉链结构域，在C末端具有富含脯氨酸的反式激活结构域；
而对于鸡EZH2基因与MDV基因组之间的靶向性关系，在现有技术中并没有相关记载。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，本方法通过对鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究，证明鸡EZH2蛋白可抑制MSB1的增殖，且影响该细胞中MDV Meq和gB基因的表达，为进一步探究鸡EZH2在MDV感染致肿瘤中的作用机制研究奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，所述的研究方法包括步骤
S1.纯化鸡EZH2原核蛋白，得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品；
S2.将纯化后的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养，测定EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响；
S3.在步骤S2的基础上，于不同时间点提取细胞总RNA，检测MDV相关基因Meq、gB的表达水平并进行分析，测定EZH2原核表达蛋白对MDV相关基因Meq、gB的表达水平的影响。
优选的，步骤S1所述的鸡EZH2原核蛋白纯化的过程包括：
S101.将含有鸡EZH2原核表达载体的大肠杆菌Rosetta(PET-32a-EZH2)用1mmol诱导剂IPTG、29℃、诱导培养8h，收集细菌沉淀并称重，按每克细菌沉淀的湿重加入4ml非变性裂解液的比例加入非变性裂解液；
S102.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，然后充分混匀，冰水浴30min；
S103.冰上超声裂解细菌，4℃、10000g下离心30min，将离心后的上清收于EP管中置于冰水浴或冰上；
S104.取1ml混合均匀的50％BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin，4℃离心(1000g×10s)后弃去储存液，向纯化柱中的凝胶中加入0.5ml非变性裂解液，4℃离心弃平衡液，重复平衡2-3次之后加入细菌裂解液上清；
S105.将穿流液收集并重复上柱3-5次；
S106.然后取下纯化柱底部的盖子，使柱内液体由于重力的影响自然流出；
S107.每次加入非变性洗涤液0.5ml，之后连续洗柱5-6次，每次收集洗涤液20ul；
S108.最后把目的蛋白洗脱6-10次，每次都用非变性洗脱液0.5ml进行洗脱，得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品。
优选的，步骤S2所述的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养的具体应用过程包括：
S201.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至5.0×105个/mL，并取100μL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度分别为10、20、40、50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复，并设不含抗体的正常细胞培养对照，轻轻摇晃混匀；
S202.在37℃细胞培养箱中培养24h、48h后每孔加入CCK-8试剂10μl，继续培养4h后，空白对照调零，酶标仪上测OD450。
优选的，步骤S3所述的鸡EZH2原核表达蛋白应用在MDV相关基因中的具体过程包括：
S301.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至1.0×106个/mL，并取1mL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度为50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复；
S302.继续培养24h和48h后，收集细胞，提取MSB1细胞总RNA；
S303.利用实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达。
优选的，步骤S303所述的MSB1细胞总RNA的提取过程包括
(1)收集2×106-1×107的MSB1细胞。2000×g离心5分钟，弃上清液；
(2)加入400μl缓冲液R-I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管中；
(3)加入150μl缓冲液R-II并涡旋1分钟，在4℃下以12000×g离心5分钟；
(4)将上清液转移到1.5ml微量离心管中，加入250μl异丙醇并充分混合；
(5)将制备管柱置于2ml微量离心管中，将来自步骤(4)的结合混合物转移到制备管中，6000×g离心1分钟；
(6)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，并向制备管中加入700μlBufferW1A，12000×g离心1分钟；
(7)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，加入700μl Buffer W2，12000×g离心1分钟，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次；
(8)弃滤液，将制备管置回2ml微量离心管中，12000×g离心1分钟；
(9)将制备管放入一干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加70-100μl BufferTE或RNase-free水，室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱得RNA。
优选的，步骤S304所述的实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达过程包括
(1)去除基因组DNA反应；
(2)进行MSB1细胞总RNA的反转录反应；
(3)利用TB Green Premix Ex Taq II方法进行Real Time PCR反应的操作方法配制Real Time反应反应液；
(4)进行Real Time PCR反应；
(5)计算MDV相关基因的表达量，进行数据分析。
优选的，步骤(3)所述的Real Time PCR反应过程中，Real Time反应反应液种需加入特异性引物和鸡内部参照基因，所述特异性引物和鸡内部参照基因包括
MDV Meq：F 5'-GTCCCCCCTCGATCTTTCTC-3′
R 5'-CGTCTGCTTCCTGCGTCTTC-3′；
gB：F 5'-ACCCCATTCGGTGGCTTTTC-3′
R 5'-GCGTCCAGTTGTCTGAGG-3′；
GAPDH：F 5'-TCTATCTCTTTGCTGGGACT-3′
R 5'-CTACAGCCAACTTTCATCAG-3′。
优选的，所述的鸡EZH2蛋白可抑制MSB1细胞的增殖，且影响该MSB1细胞中MDV Meq和gB基因的表达。
优选的，所述鸡EZH2蛋白具有活性，能够应用于其在鸡肿瘤性疾病中的作用机制研究。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
本发明通过以MDV感染的MSB1细胞为模型，纯化鸡EZH2蛋白并以不同浓度与MSB1共培养，于培养后24h和48h，采用CCK-8法测定鸡EZH2对MSB1细胞增殖的影响；同时以50ug/mL鸡EZH2蛋白作用MSB1细胞后，于不同时间点提取细胞总RNA，利用Real-time PCR检测MDV相关基因Meq、gB的表达水平并进行分析；
结果显示：以10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、50ug/mL不同浓度鸡EZH2作用于MSB1，CCK-8法检测MSB1细胞增殖，结果显示，低浓度(10ug/mL和20ug/mL)时，EZH2蛋白组抑制率与空载体蛋白对照组无明显差异(P＞0.05)，而高浓度(40ug/mL和50ug/mL)时EZH2蛋白组的抑制率显著高于空载体蛋白对照组(P<0.05)；以50ug/mLEZH2蛋白与MSB1细胞共培养后24h，MSB1细胞抑制率与对照组无明显差异，而48h后显著高于对照组(P<0.05)；在研究鸡EZH2对MDV相关基因的影响时发现，Meq和gB基因的相对表达量在24h和48h较对照组显著上调(P<0.05)，这说明鸡EZH2原核表达蛋白对Meq和gB基因表达起到了促进作用；以上结果证实，鸡EZH2蛋白可抑制MSB1的增殖，且上调该细胞中MDV Meq和gB基因的表达，为进一步探究鸡EZH2在MDV感染致肿瘤中的作用机制研究奠定了基础，也为将EZH2基因能够应用于制备抑制肿瘤性疾病治疗的药物提供了理论依据。
附图说明
图1为本发明鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法的流程图。
图2为本发明实施例1培养48h加入不同浓度EZH2蛋白MSB1细胞增殖能力检测柱状图。
图3为本发明实施例124h，48h后MSB1细胞的OD450比较图。
图4为本发明实施例1gB基因特异性检测曲线图。
图5为本发明实施例1Meq基因特异性检测曲线图。
图6为本发明实施例1gB基因的表达水平检测柱状图。
图7为本发明实施例1Meq基因的表达水平检测柱状图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：
参照附图1-7所示的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，具体包括材料准备过程、具体操作过程和实验结果分析过程，其中：
(一)材料准备过程过程包括：
1.载体与蛋白纯化
原核表达载体PET-32a原核表达载体及其宿主表达菌菌株Rosetta，含有EZH2目标基因重组的原核表达载体PET-32a-EZH2已构建得到，在河南科技大学动物疫病与公共安全实验室(动科楼404)保存，鸡EZH2原核表达蛋白纯化已完成；
2.本实验所用培养基
研究所用主要试剂及培养基如下表1：
表1：实验用培养基
3.主要仪器
本实验主要仪器如下表2：
表2：主要仪器
4.引物设计与合成
根据GenBank上已登录的EZH2(GenBank:Z48921.1)、gB(GenBank:NC_002229.3)、MDV Meq(GenBank:AB638843.1)以及鸡内部参照基因(GAPDH)(GenBank登录号：NM_204305.1)的mRNA序列；依照引物5.0来设计特异性引物，以避免形成稳定二聚体或引物和引物之间的发夹结构最终造成失配，Service bio有限公司合成用于扩增的引物序列示于表3所示：
表3：扩增引物
(二)具体研究过程，包括步骤
S1.纯化鸡EZH2原核蛋白
本实验采用BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin进行蛋白纯化：
S101.为了达到充分重悬菌体这一操作目的，针对于EZH2蛋白这一目标蛋白，将含有鸡EZH2原核表达载体的大肠杆菌Rosetta(PET-32a-EZH2)用1mmol诱导剂IPTG、29℃、诱导培养8h，按每克细菌沉淀的湿重和加入4ml(2-5ml均可)非变性裂解液的比例，以此为根据加入非变裂解液；
S102.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，然后充分混匀，准备一个烧杯，放入冰水混合物，将样品放置其中水浴30min；
其中：加入的溶菌酶：非变性裂解液＝1:10的体积比；
S103.将上述水浴后的鸡EZH2未纯化蛋白在进行冰上超声裂解细菌，具体为：4℃离心机10000×g/min离心30min，将离心后的上清收于EP管中置于冰水浴或冰上；
S104.用移液枪来吸取混合均匀的50％BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(1ml)溶液，将溶液放于4℃离心机1000×g/min离心10s后弃去储存液，之后向纯化柱中的凝胶中加入0.5ml非变性裂解液，在4℃离心机1000×g/min离心10s后弃去储存液，然后缓慢重复平衡2-3次后，弃去上清，加入4ml细菌裂解液上清；
S105.将穿流液收集并重复上柱3-5次；
S106.然后取下纯化柱底部的盖子，使柱内液体由于重力的影响自然流出；可预留下穿流液20ul以作备用；
S107.每次加入非变性洗涤液0.5ml，之后连续洗柱5-6次，每次收集洗涤液20ul，以便用于接下来的分析检测用；
S108.最后把目的蛋白洗脱6-10次，每次都用非变性洗脱液0.5ml进行洗脱，将每次的洗脱液分别收集到10个标记好的EP管中，收集得到的洗脱液中含有纯化的His标签EZH2蛋白样品，即得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品；
注意：上述鸡EZH2原核蛋白的纯化过程是在EZH2原核蛋白最优表达条件下进行的纯化，所述最优表达条件为：
(1)温度为29°；
(2)诱导剂浓度为1.0mM IPTG；
(3)诱导时间为8h。
S2.将纯化后的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养，观察EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响：
S201.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至5.0×105个/mL，并取100μL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度分别为10、20、40、50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复，并设不含抗体的正常细胞培养对照，轻轻摇晃混匀；
S202.在37℃细胞培养箱中培养24h、48h后每孔加入CCK-8试剂10μl，继续培养4h后，空白对照调零，酶标仪上测OD450。
S3.在步骤S2的基础上，于不同时间点提取细胞总RNA，检测MDV相关基因Meq、gB的表达水平并进行分析，测定EZH2原核表达蛋白对MDV相关基因Meq、gB的表达水平的影响，具体包括步骤：
S301.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至1.0×106个/mL，并取1mL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度为50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复；
S302.然后将其接种至6孔内，每孔2mL，大约含有106个细胞，分别加入EZH2和空载体蛋白，使其总浓度均为50ug/mL,37℃孵育细胞48h；
S303.分别于6孔板中收集培养24h和48h的细胞，最后提取MSB1细胞总RNA，提取不同培养条件下的MSB1细胞总RNA的详细步骤如下：
(1)收集2×106-1×107的MSB1细胞，2000×g离心5分钟，弃上清液；
(2)加入400μl缓冲液R-I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管(试剂盒内提供)中。
(3)加入150μl缓冲液R-II并涡旋1分钟，在4℃下以12000×g离心5分钟；
(4)将上清液转移到1.5ml微量离心管中，加入250μl异丙醇并充分混合；
(5)将制备管柱置于2ml微量离心管中，将来自步骤(4)的结合混合物转移到制备管中，6000×g离心1分钟；
(7)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，并向制备管中加入700μlBufferW1A，12000×g离心1分钟；
(8)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，加入700μl Buffer W2，12000×g离心1分钟，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。
(9)弃滤液，将制备管置回2ml微量离心管中，12000×g离心1分钟；
(10)将制备管放入一干净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加70-100μl Buffer TE或RNase-free水。室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱得RNA；
S304.利用实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达，其具体包括：
(1)去除基因组DNA反应
分别提取不同蛋白共培养MSB1细胞总RNA后，去除提取总RNA中的基因组；按如下表4成分于冰上配制反应混合液，在此过程中为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，可先按多于2个反应数量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品，反应液如表4：
表4:去除基因组DNA反应液
反应条件：42℃2min，4℃保存；
(2)进行MSB1细胞总RNA的反转录反应；
为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，可先按多于2个反应数量配制Master Mix，然后再分装10μl到每个反应管中，轻柔混匀后立即进行反转录反应，反应液配置在冰水混合物上进行，反应液如下表5所示：
表5：反转录反应反应液
反应条件：37℃15min，85℃5sec，4℃保存；
(3)Real time PCR
按照TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(Code No。RR820A/B)进行Real Time PCR反应的操作方法；按下列组份配制PCR反应液(反应液配制在冰水混合物进行)，如表6所示：
表6：Real Time反应反应液
(4)进行Real Time PCR反应；
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性：95℃，30秒，一个循环
Stage 2：PCR反应：95℃，5秒；60℃，60秒；40个循环
(5)计算MDV相关基因的表达量，进行数据分析
采用2-△△Ct法计算各组MSB1细胞中MDV Meq和gB基因的相对表达量。
(三)实验结果分析过程
1.鸡EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响
1.1不同浓度鸡EZH2原核表达蛋白进入MSB1细胞48h后用CCK-8法检测MSB1细胞的增殖率，如图2所示；
从图2可以观察到不同浓度的EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞后，低浓度(10ug/mL和20ug/mL)时，EZH2蛋白组抑制率与空载体蛋白对照组无明显差异(P＞0.05)，而高浓度(40ug/mL和50ug/mL)时EZH2蛋白组的抑制率显著高于空载体蛋白对照组(P<0.05)，由此证明EZH2原核表达蛋白可抑制MSB1细胞的增殖，且其具有浓度依赖性；
1.2不同时间鸡EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增值的影响
不同时间鸡EZH2原核表达蛋白进入MSB1细胞24h，48h后用CCK-8法检测MSB1细胞的增殖，如图3所示；
通过图3可以看出，不同浓度鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞后，24h时(P>0.05)EZH2蛋白组抑制率与空载体蛋白对照组差异不显著，而在48h时，与空载体蛋白相比，EZH2蛋白组显著抑制MSB1细胞增殖(P<0.01)；
2.利用Real-time PCR检测MDV Meq、gB的表达水平
2.1溶解曲线的鉴定
(1)鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞24h后，利用Real-timePCR检测MDV相关基因gB的基因表达水平，并做溶解曲线鉴定，如图4所示；
(2)鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞24h后，利用Real-timePCR检测MDV相关基因Meq的基因表达水平，并做溶解曲线鉴定，并做图5表示；
通过对gB，Meq扩增产物的溶解曲线(见图4，图5)分析表明，各目标基因溶解曲线仅为单峰，无杂峰，表明Real-time PCR过程中只有一个扩增，说明建立的Real-time PCR方法特异性良好。
2.2 MDV gB基因相对表达水平变化
(1)鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞24h，48h后，利用Real-timePCR检测MDV相关基因gB基因表达量，并做图6表示；结果显示，加入EZH2重组蛋白的MSB1细胞的MDV相关基因gB的相对表达量在24h和48h较对照组显著上调(P<0.01)，表明与对照组相比较，gB的基因在鸡EZH2共培养的MSB1细胞中表达受到促进；
2.3MDV Meq基因相对表达水平变化
鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞24h，48h后，利用Real-timePCR检测MDV相关基因Meq基因表达量，并图7表示；结果显示，加入EZH2蛋白的MSB1细胞的MDV相关基因Meq相对表达量在24h和48h较对照组显著上调(P<0.01)，表明与对照组相比较，Meq的基因在鸡EZH2共培养的MSB1细胞中表达受到促进。
通过本研究中我们发现：
(1)鸡EZH2原核表达蛋白影响了MSB1细胞的增殖能力，该蛋白可抑制MSB1细胞的增殖，且这种抑制具有一定的浓度依赖性；
(2)利用荧光定量PCR技术检测鸡EZH2蛋白对MSB1细胞中MDV相关基因表达影响证实，相对空载体蛋白组，鸡EZH2蛋白对MDV相关gB基因和Meq基因表达水平表现为上调。
(3)鸡EZH2原核表达蛋白能够应用于其在鸡肿瘤性疾病的作用机制研究。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。