阅读说明：本技术 四氢异喹啉类衍生物及其制备方法和用途 (Tetrahydroisoquinoline derivatives, and preparation method and application thereof ) 是由 吴勇勇 王超磊 蔡家强 王利春 王晶翼 于 2018-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及四氢异喹啉类衍生物及其制备方法和用途,尤其涉及式I所示的四氢异喹啉酰胺化合物、该化合物的制备方法、以及该化合物在血栓栓塞性病症的治疗或预防中的用途。<Image he="479" wi="700" file="DDA0001744088020000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to tetrahydroisoquinoline derivatives, a preparation method and application thereof, in particular to tetrahydroisoquinoline amide compounds shown in formula I,A process for the preparation of the compound and the use of the compound in the treatment or prophylaxis of thromboembolic disorders.)

四氢异喹啉类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及四氢异喹啉类衍生物、该化合物的制备方法、以及该化合物在血栓栓塞性病症的治疗或预防中的用途。

背景技术

中风、心肌梗死和深静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病是致残、致死的重要原因。正常凝血是一个紧密调节的平衡过程，需要保持血液在正常生理条件下的流体的状态，同时具备迅速在损伤部位形成止血塞的机制，以防止血液流失危及生命。凝血过程可分成三个相互依存的途径：外在(extrinsic)、内在(intrinsic)、以及共同(common)途径。其中，凝血因子XIa位于内在凝血途径的源头附近，内在凝血途径的开始和凝血因子XIa的形成(通过凝血酶或XIIa的激活)对维持血凝块完整性非常重要。但凝血因子XIa对正常止血并不是必需的。有研究表明，增高凝血因子XI的水平与男性的静脉血栓形成和心肌梗死相关联，并增加了脑血管以及冠状动脉病的几率。因而推断抑制XIa可以有效地抑制血栓形成并且不会导致显著出血。

WO2013/055984等专利中公开了多种凝血因子XIa的抑制剂。然而，尽管存在已知的凝血因子XIa抑制剂，但是现有技术中的抑制剂在体内的代谢稳定性、安全等方面依然存在不足。此外，现有技术中的四氢异喹啉类凝血因子XIa抑制剂通常具有溶解性差的缺点，其不利于制剂的制备，并且影响药物的生物利用度和药代动力学性质。研究者发现可通过向分子内增加极性基团来增加该类抑制剂的溶解度，然而极性基团的引入又会造成该类化合物的活性、选择性和/或稳定性急剧下降，毒副作用变大。

因此，人们迫切希望开发出具有改善的溶解度并且具有强的选择性的XIa抑制效果，药物代谢稳定性等性质得到改善、毒副作用更小的新型凝血因子XIa抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种化合物、其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、同位素标记的化合物、代谢物或前药，其作为具有改善的溶解性、强效和安全的凝血因子XIa抑制剂，能够用于治疗或预防血栓栓塞性病症。

本发明提供了一种化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、同位素标记的化合物、代谢物或前药，其中所述化合物具有式(I)的结构：

其中：

表示单键或双键；

R₁在每次出现时各自独立地选自H、氰基、卤素和5-6元杂芳基，且多个R₁彼此之间可以相同或不同；

X为CH₂或C＝O；

R₃在每次出现时各自独立地选自H和羟基，多个R₃彼此之间可以相同或不同，且至少有一个R₃不为H；

Y选自

W选自CR₄、CR_4aR_4b和C(＝O)；

Q选自N、C和CR₂；

R₂、R₄、R_4a和R_4b各自独立地选自H和C_1-6烷基；

n选自1-12(例如3-12)之间的任意整数，包括端值；优选为3、4、5、6、7和8；

m为1、2、3、4或5的整数，r为0、1或2。

本发明的另一方面提供了一种所述化合物的制备方法，其中包括以下方式：

(1)中间体E的制备方法：

其中，X为硼酸或硼酸酯基团，优选为

R₁、Y、W、Q、m和r如上文所定义；

路线1：

步骤一：化合物A与化合物B通过缩合反应生成化合物C；

步骤二：化合物C与化合物D通过偶联反应生成化合物E；

路线2：

步骤三：化合物A与化合物D通过偶联反应生成化合物F；

步骤四：化合物F与化合物B通过缩合反应生成化合物E；

(2)式I的制备方法：

其中，R₁、R₃、X、Y、W、Q、n、m和r如上文所定义；

路线1：

步骤五：化合物E在酸性条件下脱去保护基生成化合物G；

步骤六：化合物G通过与羧酸的缩合反应、酯的胺解反应、卤化物的取代反应或醛的还原胺化反应等生成式I化合物；

路线2：

步骤七：化合物E在酸性条件下选择性地脱去保护基生成化合物J；

步骤八：化合物J通过与羧酸的缩合反应、酯的胺解反应、卤化物的取代反应或醛的还原胺化反应生成化合物K；

步骤九：化合物K在酸性条件下脱去保护基生成式I化合物。

本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其含有本发明所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、同位素标记的化合物、代谢物或前药，优选进一步含有药学上可以接受的辅料。

本发明的另一方面提供了一种药物制剂，其中该制剂包含本发明所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、同位素标记的化合物、代谢物或前药作为活性成分，该制剂是固体制剂、半固体制剂、液体制剂或气态制剂的形式。

本发明的另一方面提供了本发明化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、同位素标记的化合物、代谢物或前药，或者本发明所述药物组合物，或者本发明所述的药剂在制备用于治疗与凝血因子XIa的抑制相关疾病的药物中的应用，所述血栓栓塞性病症包括动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管血栓栓塞性病症和心脏腔室的血栓栓塞性病症。

发明效果

本发明的化合物通过引入含有羧基的(多)羟基烷基或(多)羟基烷酰基，显著提高了化合物的水溶性，从而提高了化合物在血液中的溶解度，降低了药物在人体的体积分布(Volume Distribution)，改善药物的药代动力学特性和生物利用度。同时，本发明化合物不仅对凝血因子XIa具有高亲和力，而且对凝血因子Xa和VIIa具有极高的选择性，并且具有良好的体内代谢稳定性以及抗血凝疗效。

定义

除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。

术语“卤代”或“卤素”是指F、Cl、Br或I。

术语“C_1-6烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如C_1-4烷基、C_1-2烷基、C₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基或C₆烷基，优选为C_1-4烷基。具体的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。

术语“5-6元杂芳基”是指含有5-6个环成员的单环芳香族基团，且所述环成员中至少1个至多4个(例如1、2、3或4个)为选自N、O和S的杂原子，例如5元杂芳基、6元杂芳基等。具体的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、咪唑基、吡唑基、1，2，3-***基、1，2，4-***基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、嘧啶基、2H-1，2-噁嗪基、4H-1，2-噁嗪基、6H-1，2-噁嗪基、4H-1，3-噁嗪基、6H-1，3-噁嗪基、4H-1，4-噁嗪基、哒嗪基、吡嗪基、1，2，3-三嗪基、1，3，5-三嗪基、1，2，4，5-四嗪基、1H-四氮唑基等。

术语“立体异构体”表示由于至少一个不对称中心形成的异构体。在具有一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)不对称中心的化合物中，其可产生外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体。特定个别分子也可以几何异构体(顺式/反式)存在。类似地，本发明的化合物可以两种或更多种处于快速平衡的结构不同的形式的混合物(通常称作互变异构体)存在。互变异构体的代表性实例包括酮-烯醇互变异构体、苯酚-酮互变异构体、亚硝基-肟互变异构体、亚胺-烯胺互变异构体等。要理解，本申请的范围涵盖所有这样的以任意比例(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的异构体或其混合物。

本文中可使用实线(——)、实楔形

虚楔形

描绘本发明的化合物的化学键。使用实线以描绘键连至不对称碳原子的键表示，包括该碳原子处的所有可能的立体异构体(例如，特定的对映异构体、外消旋混合物等)。使用实或虚楔形以描绘键连至不对称碳原子的键表示，存在所示的立体异构体。当存在于外消旋混合物中时，使用实及虚楔形以定义相对立体化学，而非绝对立体化学。除非另外指明，否则本发明的化合物可以为立体异构体(其包括顺式及反式异构体、光学异构体(例如R及S对映异构体)、非对映异构体、几何异构体、旋转异构体、构象异构体、阻转异构体及其混合物)的形式存在。本发明的化合物可表现一种以上类型的异构现象，且由其混合物(例如外消旋混合物及非对映异构体对)组成。

本发明涵盖本发明化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其可为单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。

还应当理解，本发明的化合物可以游离形式存在用于治疗，或适当时，以其药学上可接受的衍生物形式存在。在本发明中，药学上可接受的衍生物包括但不限于，药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、代谢物、同位素标记的化合物或前药，在将它们向需要其的患者给药后，能够直接或间接提供本发明的化合物或其代谢物或残余物。因此，当在本文中提及“本发明的化合物”时，也意在涵盖化合物的上述各种衍生物形式。

术语“取代”指所指定的原子上的一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)氢被所选择的基团代替，条件是未超过所指定的原子在当前情况下的正常原子价并且所述取代形成稳定的化合物。所选的替代基团数量是当这种组合形成稳定的化合物时才允许的。

如果取代基被描述为“任选地被...取代”，则取代基可(1)未被取代或(2)被取代。如果取代基的碳被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则碳上的一个或多个氢可单独和/或一起被独立地选择的任选的取代基替代。如果取代基的氮被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则氮上的一个或多个氢可各自被独立地选择的任选的取代基替代。

如果取代基被描述为“独立地选自”，则各取代基可与另一(其他)取代基相同或不同。

如本文中所使用，术语“一个或多个”意指在合理条件下的1个或超过1个，例如2个、3个、4个、5个或10个。

除非指明，否则如本文中所使用，取代基的连接点可来自取代基的任意适宜位置。

本发明还包括所有药学上可接受的同位素标记的化合物，其与本发明的化合物相同，除了一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于在自然界中占优势的原子质量或质量数的原子替代。适合包含入本发明的化合物中的同位素的实例包括(但不限于)氢的同位素(例如氘(D，²H)、氚(T，³H))；碳的同位素(例如¹¹C、¹³C及¹⁴C)；氯的同位素(例如³⁶Cl)；氟的同位素(例如¹⁸F)；碘的同位素(例如¹²³I及¹²⁵I)；氮的同位素(例如¹³N及¹⁵N)；氧的同位素(例如¹⁵O、¹⁷O及¹⁸O)；磷的同位素(例如³²P)；及硫的同位素(例如³⁵S)。某些同位素标记的本发明的化合物可用于药物和/或底物组织分布研究(例如分析)中。本发明的药学上可接受的溶剂合物包括其中结晶溶剂可被同位素取代的那些，例如，D₂O、丙酮-d₆或DMSO-d₆。

除此之外，这里未定义的基团遵照通常的定义。

本发明的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐及碱加成盐。实例包括碱金属、碱土金属、铵、烷基铵等形成的盐，与无机酸或有机酸形成的盐。适合的酸加成盐由形成无毒盐的酸来形成。无机酸例如硝酸、磷酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、碳酸或高氯酸等，有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、环戊烷丙酸、十一酸、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、粘康酸、乳酸、苹果酸、草酸、富马酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、烟酸、苯甲酸、水杨酸或抗坏血酸；磺酸如甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、2-萘磺酸、3-苯基磺酸或樟脑磺酸等。

适合的碱加成盐由形成无毒盐的碱来形成。可接受的无机碱包括氢氧化铝和氢氧化钙等。可接受的有机碱包括氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。

适合的盐的综述参见Stahl及Wermuth的“Handbook of PharmaceuticalSalts：Properties，Selection，and Use”(Wiley-VCH，2002)。用于制备本发明的化合物的药学上可接受的盐的方法为本领域技术人员已知的。

如本文中所使用，术语“酯”意指衍生自本申请中各个通式化合物的酯，其包括生理上可水解的酯(可在生理条件下水解以释放游离酸或醇形式的本发明的化合物)，例如本发明化合物与C_1-6链烷醇形成的酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、叔丁酯等。本发明的化合物本身也可以是酯。

本发明的化合物可以溶剂合物(优选水合物)的形式存在，其中本发明的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。

在本发明的范围内还包括本发明的化合物的代谢物，即在给药本发明的化合物时体内形成的物质。这样的产物可由例如被给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱脂化、酶解等产生。因此，本发明包括本发明的化合物的代谢物，包括通过使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的时间的方法制得的化合物。

本发明在其范围内进一步包括本发明的化合物的前药，其为自身可具有较小药理学活性或无药理学活性的本发明的化合物的某些衍生物当被给药至身体中或其上时可通过例如水解裂解转化成具有期望活性的本发明的化合物。通常这样的前药会是所述化合物的官能团衍生物，其易于在体内转化成期望的治疗活性化合物。关于前药的使用的其他信息可参见“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”，第14卷，ACS Symposium Series(T.Higuchi及V.Stella)及“Bioreversible Carriers in Drug Design，”PergamonPress，1987(E.B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association)。本发明的前药可例如通过用本领域技术人员已知作为“前-部分(pro-moiety)(例如“Design ofProdrugs”，H.Bundgaard(Elsevier，1985)中所述)”的某些部分替代本发明的化合物中存在的适当官能团来制备。

本发明还涵盖含有保护基的本发明的化合物。在制备本发明的化合物的任何过程中，保护在任何有关分子上的敏感基团或反应基团可能是必需的和/或期望的，由此形成本发明的化合物的化学保护的形式。这可以通过常规的保护基实现，例如，在ProtectiveGroups in Organic Chemistry，ed.J.F.W.McOmie，Plenum Press，1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，1991中所述的那些保护基，这些参考文献通过援引加入本文。使用本领域已知的方法，在适当的后续阶段可以移除保护基。

化合物

本发明的一个目的在于，提供下述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、同位素标记的化合物、代谢物或前药，其中所述化合物具有式(I)的结构：

其中：

表示单键或双键；

R₁在每次出现时各自独立地选自H、卤素、氰基和5-6元杂芳基，且多个R₁彼此之间可以相同或不同；

X为CH₂或C＝O；

R₃在每次出现时各自独立地选自H和羟基，多个R₃彼此之间可以相同或不同，且至少有一个R₃不为H；

Y选自

W选自CR₄、CR_4aR_4b和C(＝O)；

Q选自N、C和CR₂；

R₂、R₄、R_4a和R_4b各自独立地选自H和C_1-6烷基；

n选自1-12(例如3-12)之间的任意整数，包括端值，优选为3、4、5、6、7和8；

m为1、2、3、4或5的整数，r为0、1或2。

在优选的实施方案中，R₁在每次出现时各自独立地选自H、氟、氯、溴、氰基和5元杂芳基(例如5元含氮杂芳基)，且多个R₁彼此之间可以相同或不同。

在优选的实施方案中，R₁在每次出现时各自独立地选自H、氟、氯、溴和5元杂芳基(例如5元含氮杂芳基)，且多个R₁彼此之间可以相同或不同。

在优选的实施方案中，R₁在每次出现时各自独立地选自H、氟、氯和

且多个R₁彼此之间可以相同或不同。

在优选的实施方案中，R₁在每次出现时各自独立地选自H、氟、氯和

且m选自2和3。

在优选的实施方案中，W选自CH和C(＝O)。

在优选的实施方案中，Q选自C和N。

在优选的实施方案中，W选自C(＝O)，Q为N。

在优选的实施方案中，W选自CH，Q选自C且

表示双键。

在优选的实施方案中，n选自3、4、5、6、7或8；R₃在每次出现时各自独立地选自H和羟基，多个R₃彼此之间可以相同或不同，，且至少有1个R₃不为H，优选至少2个R₃不为H，更优选至少3个R₃不为H。

在优选的实施方案中，n选自3、4、5或6；R₃在每次出现时各自独立地选自H和羟基，多个R₃彼此之间可以相同或不同，，且至少有1个R₃不为H，优选至少2个R₃不为H，更优选至少3个R₃不为H。

在优选的实施方案中，n选自3和4。

在优选的实施方案中，n选自3和4，且其中2、3或4个R₃不为H。

在优选的实施方案中，r为1。

在优选的实施方案中，m选自2和3。

在优选的实施方案中，W选自CH和C(＝O)，Q选自C和N，Y选自

在优选的实施方案中，W选自CH，Q选自C且

表示双键，Y选自

在优选的实施方案中，W选自CH和C(＝O)，Q选自C和N，Y选自

R₃在每次出现时各自独立地选自H和羟基，多个R₃彼此之间可以相同或不同，且至少有一个R₃不为H，n选自3和4。

在优选的实施方案中，W选自CH，Q选自C且

表示双键，Y选自

R₃在每次出现时各自独立地选自H和羟基，多个R₃彼此之间可以相同或不同，且至少有一个R₃不为H，n选自3和4。

在优选的实施方案中，所述化合物具有式(II)的结构：

其中：

n选自3、4、5或6；

R₃在每次出现时各自独立地选自H和羟基，多个R₃彼此之间可以相同或不同，且至少有1、2或3个R₃不为H；

R₁、Y、W、Q、m和r如式I所定义。

在优选的实施方案中，所述化合物具有式(II-1)的结构：

其中，m选自2和3，R₁、R₃、Y、W、Q、n和r如式I所定义。

在优选的实施方案中，所述化合物具有式(II-2)的结构：

其中，R₁选自H和

R₃、Y和n如式I所定义。

在优选的实施方案中，所述化合物具有式(II-3)的结构：

其中，R₁选自H和

R₃、Y和n如式I所定义。

在优选的实施方案中，其中所述化合物选自，

制备方法

本发明的另一目的在于提供上述式(I)的化合物的制备方法，可以利用包含如下述方法的反应路径所记载的以下反应步骤的方法制备。

(1)中间体E的制备方法：

其中，X₁为硼酸或硼酸酯基团，优选为

R₁、Y、W、Q、m和r如上文所定义。

路线1：

步骤一：化合物A与化合物B通过缩合反应生成化合物C；

步骤二：化合物C与化合物D通过偶联反应生成化合物E。

路线2：

步骤三：化合物A与化合物D通过偶联反应生成化合物F；

步骤四：化合物F与化合物B通过缩合反应生成化合物E。

其中，所述缩合反应在缩合剂和有机碱的存在条件下进行，所使用的缩合剂可以是HATU、HBTU、HCTU、HOBt/EDCI、DMC、DCC、DIC、EDCI、BOP、PyBOP和PyAOP等，优选HATU、HOBt/EDCI、EDCI；所使用的有机碱可以是TEA、DMAP、DIEA和吡啶等，优选DIEA、TEA、吡啶：所述缩合反应可以在有机溶剂中进行，合适的有机溶剂包括DMF、卤代烃(例如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷)、醚类(例如1，4-二氧六环、四氢呋喃、二甲醚、***、甲基叔丁基醚)；反应温度可以是0至100℃，优选0℃和室温；反应时间在1-24小时的范围内，优选1-3小时。

所述偶联反应在金属催化剂和碱的存在下进行，所述金属催化剂是钯金属催化剂，例如四(三苯基膦)钯、[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、二(三苯基膦)二氯化钯、醋酸钯，优选[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物；所述碱是无机碱，例如碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠，优选碳酸铯；所述偶联反应可以在适合的有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂中进行，所述有机溶剂可选1，4-二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺或上述有机溶剂和水的混合溶剂，例如是1，4-二氧六环和水的混合溶剂；所述偶联反应在适合的保护气氛(例如氮气环境)下进行；反应温度可以是0-150℃，优选100-130℃；反应时间在2-48小时的范围内，优选8-12小时。

(2)式I的制备方法：

其中，R₁、R₃、X、Y、W、Q、n、m和r如上文所定义。

路线1：

步骤五：化合物E在酸性条件下脱去保护基生成化合物G；

步骤六：化合物G通过与羧酸的缩合反应、酯的胺解反应、卤化物的取代反应或醛的还原胺化反应等生成式I化合物。

路线2：

步骤七：化合物E在酸性条件下选择性地脱去保护基生成化合物J；

步骤八：化合物J通过与羧酸的缩合反应、酯的胺解反应、卤化物的取代反应或醛的还原胺化反应生成化合物K；

步骤九：化合物K在酸性条件下脱去保护基生成式I化合物。

所述脱保护反应在脱保护试剂存在下，在低温、室温或加热的条件下进行。所用的脱保护试剂可以是三氟乙酸、盐酸、硫酸等，优选盐酸和三氟乙酸；合适的有机溶剂包括卤代烃(例如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷)、醚类(例如1，4-二氧六环、四氢呋喃、二甲醚、***、甲基叔丁基醚)、DMF等，优选二氯甲烷、四氢呋喃、1，4-二氧六环；反应温度可以是0-100℃，优选0-50℃；反应时间在0.5-24小时的范围内，优选0.5-3小时。更为详细的操作步骤可以参见Greene′s Protective Groups in Organic Synthesis(4th Edition)等。

所述羧酸的缩合反应在缩合剂和有机碱的存在条件下进行，所使用的缩合剂可以是HATU、HBTU、HCTU、HOBt/EDCI、DMC、DCC、DIC、EDCI、BOP、PyBOP和PyAOP等，优选HATU、HOBt/EDCI、EDCI；所使用的有机碱可以是TEA、DMAP、DIEA和吡啶等，优选DIEA、TEA、吡啶：所述缩合反应可以在有机溶剂中进行，合适的有机溶剂包括DMF、卤代烃(例如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷)、醚类(例如1，4-二氧六环、四氢呋喃、二甲醚、***、甲基叔丁基醚)；反应温度可以是0至100℃，优选0℃和室温；反应时间在1-24小时的范围内，优选1-3小时。

所述酯的氨解反应可以在有机溶剂或者含有催化量碱或路易斯酸的有机溶剂中进行，合适的催化量碱有醇钠，钠，氢化钠，四氢锂铝等，优选醇钠；合适的催化量的路易斯酸有BBr₃、BF₃.EtO₂等，优选BBr₃；合适的有机溶剂包括MeOH、二甲苯等；反应温度可以是60至200℃，优选80℃和120℃；反应时间在1-96小时的范围内，优选8-24小时。

所述卤化物的取代反应在碱的存在下进行，所使用的碱可以是无机碱K₂CO₃、Na₂CO₃、Cs₂CO₃、KOtBu等，优选K₂CO₃；所使用的碱可以是有机碱DBU、DIEA、TEA、吡啶等，优选DBU；所述取代反应可以在有机溶剂中进行，适合的有机溶剂包括DMF、卤代烃(例如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷)、醚类(例如1，4-二氧六环、四氢呋喃、二甲醚、***、甲基叔丁基醚)；反应温度可以是0至100℃，优选室温和80℃；反应时间在1-96小时的范围内，优选3-8小时。

所述醛的还原胺化反应在还原试剂和催化量酸的存在下进行，所使用的还原试剂可以是NaBH₄、Na(CN)BH₃、NaBH(OAc)₃、Raney Ni等，优选Na(CN)BH₃；所使用的催化量的酸可以是盐酸、HOAc、CF₃COOH等，优选盐酸；所述还原胺化反应可以在有机溶剂和水中进行，适合的有机溶剂包括MeOH、MeOH和卤代烃(例如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷)的混合溶剂等，优选MeOH；反应温度可以是0至100℃，优选60℃和80℃；反应时间在1-24小时的范围内，优选3-8小时。

另外，本发明的化合物还可以由有机合成领域的技术人员已知的多种方式制备。本发明的化合物可使用下文描述的方法以及合成有机化学领域中已知的合成方法或本领域技术人员所了解的其变化形式来合成。优选方法包括(但不限于)上文所述那些制备方法。反应可在适于所使用的试剂和材料且适合于实现转化的溶剂或溶剂混合物中进行。有机合成领域的技术人员应了解，分子上存在的官能团应与所提出的转化一致。这有时将需要以下判断：修改合成步骤的顺序或相对于一种方法路线选择另一特定方法路线以获得本发明的所需化合物。

还应认识到，本领域中设计任何合成途径的另一主要考虑因素是正确选择用于保护本发明中所述化合物中存在的反应性官能团的保护基团。向受过训练的相关人士描述许多替代方案的权威说明为Greene等人(Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，Wiley-Interscience(2006))。

除非另外说明，上述路线中化合物的取代基如本发明所定义。本领域技术人员会明白，根据期望获得的产物结构，可省略以上路线中的一个或多个步骤。本领域技术人员也可根据需要适当地调整反应步骤的顺序。

在本申请中，当化学名称和结构式不一致时，应当以结构式所示为准，除非根据上下文可以推断化学名称而非结构式是正确的。

药物组合物和药物制剂

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，其包含预防或治疗有效量的本发明的化合物或其药学可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者它们的混合物，以及一种或多种药学上可接受的载体。

本发明中“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

在本发明的药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’s PharmaceuticalSciences(1990)中所述。

本发明的药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或者通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。

对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物。所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂等。

本发明的化合物在药物组合物中的含量或用量可以是约0.01mg至约1000mg。

根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物还可包含一种或多种其它治疗剂，例如用于预防或治疗与凝血因子XIa的抑制相关的疾病的其它治疗剂。

本发明的另一目的在于提供一种制备本发明的药物组合物的方法，所述方法包括将本发明的化合物或其药学可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、水合物、代谢物或前药、或者它们的混合物与一种或多种药学上可接受的载体组合。

本发明的另一目的在于提供一种药物制剂，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者它们的混合物，或者本发明的药物组合物。

治疗方法和用途

本发明的另一目的在于提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者它们的混合物或者本发明的药物组合物在制备用于预防或治疗与凝血因子XIa的抑制相关的药物中的用途。

本发明的另一目的在于提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者它们的混合物或者本发明的药物组合物，其用于预防或治疗与凝血因子XIa的抑制相关的疾病。

本发明的另一目的在于提供预防或治疗与凝血因子XIa的抑制相关的的方法，所述方法包括向需要其的个体给药有效量的本发明的化合物或其药学可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者它们的混合物，或者本发明的药物组合物。

根据本发明的一个实施方案，可使用本发明的化合物进行预防或治疗的与凝血因子XIa的抑制相关的包括但不限于血栓栓塞性病症，所述血栓栓塞性病症优选包括动脉心血管血栓栓塞性病症，静脉心血管血栓栓塞性病症，和心脏腔室的血栓栓塞性病症。

更优选地，所述血栓栓塞性病症包括不稳定型心绞痛，急性冠状动脉综合症，心房纤维性颤动，首次心肌梗塞，复发性心肌梗塞，缺血性猝死，短暂性脑缺血发作，中风，动脉粥样硬化，外周闭塞性动脉疾病，静脉血栓形成，深静脉血栓形成，血栓性静脉炎，动脉栓塞，冠状动脉血栓形成，脑动脉血栓形成，脑栓塞，肾栓塞，肺栓塞，和由于(a)人工瓣膜或其它植入物，(b)留置导管，(c)支架，(d)体外循环，(e)血液透析，或(f)血液暴露于易血栓形成的人造表面而引起的血栓形成。

术语语“有效量”指被给药后会在一定程度上缓解所治疗病症的一或多种症状的化合物的量。

可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可给药单次推注，可随时间给药数个分剂量，或可如治疗情况的急需所表明而按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随要减轻的病况的类型及严重性而变化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据个体需要及给药组合物或监督组合物的给药的人员的专业判断来随时间调整。

所给药的本发明的化合物的量会取决于所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率、化合物的处置及处方医师的判断。一般而言，有效剂量在每日每kg体重约0.0001至约50mg，例如约0.01至约10mg/kg/日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.007mg/日至约3500mg/日，例如约0.7mg/日至约700mg/日。在一些情况下，不高于前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分成数个较小剂量以在一整天中给药。

除非另外说明，否则如本文中所使用，术语“治疗”意指逆转、减轻、抑制这样的术语所应用的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状的进展，或预防这样的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状。

如本文所使用的“个体”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本发明中“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。

具体实施方式

为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。并且，下列实施例中未提及的具体实验方法，均按照常规实验方法进行。

以下的实施例中记载的化合物的结构通过核磁共振(¹HNMR)或质谱(MS)来确定。

¹HNMR位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。¹HNMR的测定是用JEOL Eclipse400核磁仪，测定溶剂为氘代甲醇(CD₃OD)、氘代氯仿(CDCl₃)，六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10^-6(ppm)作为单位给出。

实施例中使用的核磁共振(NMR)数据中的缩写示于以下：

s：单峰、d：二重峰、t：三重峰、q：四重峰、dd：双二重峰、qd：四二重峰、ddd：双双二重峰、ddt：双双三重峰、dddd：双双双二重峰、m：多重峰、br：宽峰(broad)、J：偶合常数、Hz：赫兹。

MS的测定用Agilent(ESI)质谱仪，生产商：Agilent，型号：Agilent 6120B；

制备高效液相使用岛津LC-8A制备液相色谱仪(YMC，ODS，250×20mml色谱柱)。

薄层色谱硅胶板(TLC)使用Merck产的铝板(20×20cm)，薄层层析分离纯化采用的规格是烟台产GF254(0.4-0.5nm)。

反应的监测采用薄层色谱法(TLC)或LCMS，使用的展开剂体系有：二氯甲烷和甲醇体系，正己烷和乙酸乙酯体系，石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节或者加入三乙胺等进行调节。

微波反应使用BiotageInitiator+(400W，RT-300℃)微波反应器。

柱层析一般使用青岛海洋200-300目硅胶为载体。洗脱剂的体系包括：二氯甲烷和甲醇体系，正己烷和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺进行调节。

实施例中无特殊说明，反应的温度为室温(20℃-30℃)

本发明所使用的试剂可以通过本领域已知的常规方法制备得到或通过商业途径购买到，例如购自Acros Organics，Aldrich Chemical Company，特伯化学等公司。

在常规的合成法以及实施例、和中间体合成例中，各缩写的意思如以下所示。

DMA：N，N-二甲基乙酰胺；DMSO：二甲基亚砜；NMP：N-甲基吡咯烷酮；DIBAL-H：二异丁基氢化铝；DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；THF：四氢呋喃；Boc：叔丁氧基羰基；NBS：N-溴琥珀酰亚胺；Cbz-Cl：氯甲酸苄酯；TFA：三氟醋酸；Et₂O：二乙基醚；EtOH：乙醇；Dioxane：1，4-二氧六环；TLC：薄层色谱；Me：甲基；MTBE：甲基叔丁基醚；HATU：O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐；DCM：二氯甲烷；EA：乙酸乙酯；XPhos：2-双环己基膦-2′，4′，6′-三异丙基联苯；PE：石油醚；Hexane：正己烷；HAc：醋酸；tBu：叔丁基；DMF：N，N-二甲基甲酰胺；DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；MeCN：乙腈；HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

实施例1：4-((S)-5-(1-((2S，3R，4S，5S)-5-羧基-2，3，4，5-四羟戊基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-2-((R)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4，5-二氢异噁唑-5-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-甲酰胺基)苯甲酸(1)的制备：

第一步：4-(1-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基甲酰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-5-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(1-3)的制备

将化合物4-(5-溴-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-甲酰胺)苯甲酸叔丁酯盐酸盐(1-1，20g，43mmol)，4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(1-2，14.6g，47.3mmol)，碳酸钠(29g，215mmol)溶于1，4-二氧六环/水(5/1)的混合溶剂(180mL)中，在N₂氛围下加入Pd(dppf)Cl₂(3.1g，4.3mmol)，之后置于120℃的油浴中反应过夜。将反应降至室温后加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，浓缩，柱层析分离得到标题化合物(1-3，20.7g，收率：90.3％)。

MS m/z(ESI)：534[M+H]⁺

第二步：(S)-4-(1-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基甲酰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-5-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(1-4)的制备

将化合物1-3(32.6g)经手性HPLC分离后(色谱柱：IF Column；流动相己烷/EtOH/HAc＝80/20/0.1(V/V/V)；流速：1.0ml/min；检测波长：214nm；保留时间：11.97min)即可得到标题化合物(1-4，11.7g，收率：35.9％)。

MS m/z(ESI)：534[M+H]⁺

比旋光度

(c＝1.94mg/ml，MeOH)

第三步：((S)-1-((4-(叔丁氧羰基)苯基)氨基甲酰)-2-((R)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4，5-二氢异噁唑-5-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-5-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(1-6)的制备

将化合物1-4(10g，19mmol)，(R)-3-(3-氯-2-氟苯)-4，5-二氢异噁唑-5-甲酸(1-5，4.6g，19mmol)溶于DMF(25mL)，加入DIPEA(7.4g，57mmol)和HATU(8.7g，23mmol)，加毕，室温搅拌反应过夜，加入水中，搅拌10分钟，过滤，滤饼干燥后过硅胶柱纯化得标题化合物(1-6，12.6g，收率：85.4％)。

¹HNMR(500MHz，DMSO)δ：10.92(s，1H)，7.87-7.86(d，2H)，7.77-7.56(m，4H)，7.57-7.56(d，1H)，7.36-7.26(m，2H)，7.15-7.13(d，1H)，5.83(s，1H)，5.79-5.75(m，1H)，5.63(brs，1H)，4.29-4.23(m，1H)，400(brs，2H)，3.91-3.86(m，1H)，3.75-3.68(m，2H)，3.58(m，2H)，3.16-3.10(m，1H)，3.00-2.95(m，1H)，2.39-2.26(m，2H)，1.55(s，9H)，1.47(s，9H).

MS m/z(ESI)：759[M+H]⁺

第四步：4-((S)-2-((R)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4，5-二氢异噁唑-5-羰基)-5-(1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-甲酰胺基)苯甲酸盐酸盐(1-7)的制备

将化合物1-6(200mg，0.26mmol)溶于THF(5mL)，冰浴冷却至0℃，滴加盐酸-1，4-二氧六环溶液(4M，3mL)，滴毕，室温搅拌2小时，LC-MS监测反应完毕，加入***(50mL)，冷却至0℃搅拌30分钟后过滤，滤饼干燥得标题化合物(1-7，103mg，收率：56.3％)。

MS m/z(ESI)：603[M+H]⁺

第五步：4-((S)-5-(1-((2S，3R，4S，5S)-5-羧基-2，3，4，5-四羟戊基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-2-((R)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4，5-二氢异噁唑-5-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-甲酰胺基)苯甲酸(1)的制备

将化合物1-7(350mg，0.58mmol)溶于pH为4的甲醇-盐酸缓冲液(40mL)，依次加入D-葡萄糖醛酸(1-8，563.39mg，2.90mmol)和氰基硼氢化钠(182mg，2.90mmol)，加毕，60℃搅拌过夜，蒸去溶剂，剩余物经制备HPLC(甲酸/甲醇/水)分离得到标题化合物(280mg，59.43％)。

¹HNMR(400MHz，DMSO)δ：10.84(s，1H)，7.88-7.86(m，2H)，7.70-7.68(m，4H)，7.55(m，1H)，7.32-7.26(m，2H)，7.13(m，1H)，5.81(s，1H)，5.76(m，1H)，5.58(s，1H)，4.24(s，1H)，4.09-3.56(m，10H)，3.31-3.01(m，7H)，2.46(m，2H).

MS m/z(ESI)：781.1[M+H]⁺

对比例1：4-((S)-2-((R)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4，5-二氢异噁唑-5-羰基)-5-(1-((2S，3R，4R，5R)-2，3，4，5，6-五羟基己基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-甲酰氨基)苯甲酸甲酸盐(D1)

按照上述实施例1第一步至第四步描述的方法制备化合物1-7。

4-((S)-2-((R)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4，5-二氢异噁唑-5-羰基)-5-(1-((2S，3R，4R，5R)-2，3，4，5，6-五羟基己基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-甲酰氨基)苯甲酸甲酸盐(D1)的制备

将化合物1-7(505mg，0.84mmol)溶于pH≈4-5的甲醇缓冲液(30mL)，依次加入D-葡萄糖(D1-8，755mg，4.2mmol)和氰基硼氢化钠(264mg，4.2mmol)，加毕，60℃搅拌过夜，蒸去溶剂，剩余物经HPLC(甲酸/甲醇/水)分离得到标题化合物(289mg，44.9％)。

¹HNMR(400MHz，DMSO)δ：10.96-10.86(s，1H)，8.23(s，1H)，7.89-7.86(d，2H)，7.73-7.68(m，5H)，7.55-7.52(d，1H)，7.34-7.23(m，2H)，7.12-7.08(s，1H)，5.80-5.73(m，3H)，5.58(s，1H)，4.24(s，1H)，3.83(m，2H)，3.69-3.60(m，5H)，3.50-2.65(m，13H)，2.37-2.34(d，2H).

MS m/z(ESI)：767[M+H]⁺

溶解度数据

实验例一、溶解度测试

将待测化合物室温条件下溶解于缓冲液(10mM磷酸二氢钾，pH7.4)直至过饱和，经震荡水浴锅振摇，采用0.45uM水系滤膜过滤后采用HPLC检测。精确称定1mg待测化合物溶解于10mL容量瓶作为对照品，采用HPCL检测。通过外标法计算待测化合物的溶解度。

表1.化合物在pH7.4缓冲溶液中的溶解度

化合物编号	溶解度(mg/ml)
		1	0.88
D1	0.02

由表1可见，在多羟基烷基的末端引入羧基使得本发明化合物溶解度有显著的提高。

药理数据

实验例二、对凝血因子XIa的抑制作用

试剂：

酶：人凝血因子XIa；厂家：Haemtech公司；

底物：Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC Acetate salt；厂家：Bachem；

检测方法：

将待测化合物按不同浓度溶解于检测缓冲液(50mM HEPES，145mMNaCl，5mMKCl，0.1％BSA，pH7.4)中。在384孔板中加入凝血因子XIa和待测化合物，混匀后室温孵育10分钟。加入底物(Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC Acetate salt)启动反应。在酶动力学模式下，选择激发光波长为380nm，发射光波长为460nm读取荧光信号值。每30秒读取1次，连续读取20个循环。在线性反应期内计算化合物不同浓度下酶活抑制率。使用作图软件GraphPadPrism 5制作化合物浓度-抑制率信号曲线，按照四参数模型拟合曲线，计算IC₅₀值。

表1.化合物对凝血因子XIa的抑制作用

化合物编号	IC<sub>50</sub>(nM)
		1	0.37±0.05

由表1可见，本发明的化合物对凝血因子XIa具有明显的抑制效果。

实验例三、对凝血因子VIIa、凝血因子Xa酶的选择性抑制

试剂：

酶：人凝血因子VIIa；厂家：Haematologic Technologies公司；

组织因子：组织因子F3；厂家：Sino Biological；

底物：Boc-VPR-AMC；厂家：R&D；

酶：人凝血因子Xa：厂家：R&D；

底物：Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2；厂家：R&D；

对人凝血因子VIIa酶的选择性抑制检测方法：

将待测化合物按反应终浓度10μM和1μM溶解于检测缓冲液(50mM Hepes，150mMNaCl，5mM CaCl₂，0.1％BSA，pH7.4)中。凝血因子VIIa和组织因子等摩尔浓度混匀，37℃孵育15分钟后，再加入待测化合物室温孵育10分钟，随后加入底物(Boc-VPR-AMC)启动反应。采用酶动力学模式，激发光波长为380nm，发射光波长为460nm读取荧光信号值。每30秒读取1次，连续读取20个循环。在线性反应期内计算化合物不同浓度下酶活抑制率。根据不同浓度下抑制率大小来判断IC₅₀的范围。

对人凝血因子Xa酶活选择性抑制检测方法：

将待测化合物按反应终浓度10μM和1μM溶解于检测缓冲液(50mM Tris，150mMNaCl，10mM CaCl₂，0.05％Brij35，pH7.5)中。在孔板中加入凝血因子Xa和待测化合物，混匀后室温孵育10分钟。加入底物(Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH₂)启动反应。采用酶动力学模式，选择激发光波长为320nm，发射光波长为400nm读取荧光信号值。每30秒读取1次，连续读取20个循环。在线性反应期内计算化合物不同浓度下酶活抑制率。根据不同浓度下抑制率大小来判断IC₅₀的范围。

表2.化合物对凝血因子Xa和VIIa的抑制作用

由表2可见，本发明的化合物对凝血因子Xa和VIIa的IC₅₀均在10μM以上，说明本发明化合物对凝血因子Xa和VIIa明显不抑制，并且出血倾向低。

根据上述实验例二和三的实验结果明显可知，相对于凝血因子Xa和VIIa，本发明的化合物对于凝血因子XIa具有优异的选择抑制作用。

实验例四、化合物对体外凝血的影响

试剂：

aPTT试剂；希森美康；

PT试剂；希森美康；

凝血途径包括外源性凝血途径和内源性凝血途径。与外源性凝血途径相关的参数为凝血酶原时间，用PT(prothrombin time)表示；与内源性凝血途径相关的参数为活化部分凝血活酶时间，用aPTT(activated partial thromboplatin time)表示。由于内源性凝血途径与病理性血栓形成密切相关而非止血功能所必需，选择性抑制内源性凝血因子可以降低出血风险。因此，抗凝药物希望延长aPTT(活化部分凝血活酶时间)，而对PT(凝血酶原时间)基本无影响，以达到合适的抗凝血效果。

aPTT(活化部分凝血活酶时间)和PT(凝血酶原时间)检测方法：

兔血液抗凝后，离心收集上层血浆，取一定量的血浆，加入待测化合物1，使其终浓度为10μM，然后把样品放入凝血分析仪进行aPTT和PT的检测。空白血浆(不加化合物)作为参照，对待测化合物1与空白血浆的aPTT和PT的比值进行分析。

表3化合物对兔aPTT和PT的影响(n＝3)

	与空白血浆的aPTT比值	与空白血浆的PT比值
			化合物1	1.84±0.31	1.04±0.02

本发明的化合物是优异的选择性XIa抑制剂，而XIa与内源性凝血途径相关，由表3可见，与未加入试验化合物的空白血浆相比，加入本发明的化合物1后aPTT明显延长，表明本发明的化合物通过选择性地抑制XIa而达到抗内源性凝血的效果。与没有加入试验化合物的空白血浆相比，加入了本发明化合物与外源性凝血途径相关的PT值无明显变化，说明本发明的化合物对外源性凝血途径无影响。