一种肺炎支原体重组抗原的制备及应用
阅读说明：本技术 一种肺炎支原体重组抗原的制备及应用 (Preparation and application of mycoplasma pneumoniae recombinant antigen ) 是由 吴素丽 段晓明 窦兰芳 付旭东 于 2018-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了在Genbank中搜集肺炎支原体基因的序列,建立肺炎支原体的基因数据,并且利用计算机软件对其进行分析,获得肺炎支原体粘附蛋白P1(GenBank:AF286371.1)和粘附蛋白P30(GenBank:EF614306.1)最具有检测活性的区段,P1基因的第252位氨基酸～第355位氨基酸(P1A),第898位氨基酸～第953位氨基酸(P1B),第1274位氨基酸～第1362位氨基酸(P1C),第1589位氨基酸～第1627位氨基酸(P1D),P30片段为肺炎支原体粘附蛋白P30的第174位氨基酸～第274位氨基酸,通过连接肽GSGSGS串联起来,串联顺序从C端到N端依次为P1A片段-第一连接肽-P1B片段-第二连接肽-P1C-第三连接肽-P1C-第四连接肽-P1D-第五连接肽--P30片段,对应的核酸序列通过化学合成的方法获得。(The invention discloses a method for collecting the sequence of Mycoplasma pneumoniae gene in Genbank, establishing the gene data of Mycoplasma pneumoniae, analyzing the gene data by computer software to obtain the section with the most detecting activity of Mycoplasma pneumoniae adhesive protein P1(GenBank: AF286371.1) and adhesive protein P30(GenBank: EF614306.1), the 252 rd to 355 th amino acids (P1A), the 898 th to 953 th amino acids (P1B), the 1274 th to 1362 th amino acids (P1C), the 1589 th to 1627 th amino acids (P1D), the P30 segment is the 174 th to the 274 th amino acids of Mycoplasma pneumoniae adhesive protein P45, connecting the P A segment-the first connecting peptide-P1B segment-the second connecting peptide-P1 segment-P37-the third connecting peptide-P961 to the fifth peptide-GS 8234 segment in sequence from C end to N end, the corresponding nucleic acid sequences are obtained by chemical synthesis.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种肺炎支原体重组抗原的制备及应用。
背景技术
肺炎支原体是引起人类原发性非典型性肺炎的主要病原体之一，秋冬寒冷季节多发，青少年为易感人群，主要经由飞沫传染。临床上主要以呼吸道症状，咽痛、发烧、咳嗽、低热等为主，咳嗽是最突出的表现。支原体肺炎患者除有呼吸道症状外，伴发胃肠道系统，血液系统，神经系统和心血管系统病变，并引起广泛关注。
目前应用于临床的肺炎支原体的诊断方法主要病原体的分离培养，间接免疫荧光试验、补体结合试验，间接血凝ELISA检测，聚合酶链式反应(PCR) 等；肺炎支原体血清学检测主要检测IgG和IgM两种抗体，肺炎支原体的感染具有潜伏期，一般为2～3周，大概在感染后1周左右产生IgM抗体，3周左右产生IgG抗体。因此，IgM抗体阳性可作为早期感染的诊断指标。如果检测 IgM抗体呈现阴性，也不能判定非肺炎支原体感染，需要再进行IgG抗体的检测；目前我国肺炎支原体的发病率呈上升趋势，特别是青少年发病率，而目前的病原学和血清学检测方法操作复杂，耗时长，不利于及时对患者进行治疗，目前的血清学检测方法中，使用最多的是天然抗原，天然抗原生产工艺繁琐，价格昂贵，且增加了对实验操作人员的感染几率，需要研制出具有抗原性强，灵敏性好的重组MP抗原，也为研制快捷、准确的检测肺炎支原体IgM，IgG抗体试剂盒打下基础，为此我们提供一种肺炎支原体重组抗原的制备及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺炎支原体重组抗原的制备及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肺炎支原体重组抗原的制备及应用，所述肺炎支原体重组抗原氨基酸序列见SEQ ID NO.1。
优选的，所述肺炎支原体重组抗原核苷酸序列见SEQ ID NO.2。
优选的，本发明提出的肺炎支原体重组抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
一、构建肺炎支原体重组抗原的基因表达序列，根据序列设计上下游引物，在上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入SalI酶切位点，具体的肺炎支原体重组抗原核酸序列见NO1，
二、用上下游引物进行PCR扩增，扩增获得的PCR片段经回收之后，连接进表达载体pET28a中，得到重组表达质粒pET28a-MP。
三、将上述构建好的重组质粒pET-28a-MP转化至大肠杆菌感受态细胞 BL21(DE3)中，得到重组质粒的表达菌株，克隆菌株提取质粒，使用BamHI、SalI位酶切后经过酶切，测序验证后，对重组质粒的表达菌株进行诱导表达、纯化，得到MP重组抗原。
优选的，所述步骤三所述的纯化方法：采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式对表达后的蛋白进行纯化，获得具有一种类型的抗原优势表位的肺炎支原体重组抗原；
或采用电洗脱纯化的方式对表达后的蛋白进行纯化，获得具有另一种类型的抗原优势表位的肺炎支原体重组抗原。
优选的，所述步骤二采用的PCR扩增引物序列如下：
上游引物：5'-CGCGCGGATCCGATGAAAAACTCCAGGGCG-3'
下游引物：5'-CGCGTCGACGTC GCGTTTTGGTGGAAAAGGC-3'。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明方法方便快捷，且不需要昂贵的仪器设备；所产抗原灵敏度高，特异性强，制备相应的检测试剂盒，重组抗原稳定性好，可以大批量生产，适于推广应用；
2、研制出具有抗原性强，灵敏性好的重组MP抗原，也为研制快捷、准确的检测肺炎支原体IgM，IgG抗体试剂盒打下基础。
附图说明
图1为本发明中用于表达Mp重组抗原的重组质粒结果图；
图2为本发明中抗体使用肺炎支原体IgM，IgG抗体分别进行检测的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明提供一种技术方案：首先在Genbank中搜集肺炎支原体基因的序列，建立肺炎支原体的基因数据，并且利用计算机软件对其进行分析，获得肺炎支原体粘附蛋白P1(GenBank:AF286371.1)和粘附蛋白 P30(GenBank:EF614306.1)最具有检测活性的区段，P1基因的第252位氨基酸～第355位氨基酸(P1A)，第898位氨基酸～第953位氨基酸(P1B)，第1274 位氨基酸～第1362位氨基酸(P1C)，第1589位氨基酸～第1627位氨基酸(P1D)，P30片段为肺炎支原体粘附蛋白P30的第174位氨基酸～第274位氨基酸，通过连接肽GSGSGS串联起来，串联顺序从C端到N端依次为P1A片段-第一连接肽-P1B片段-第二连接肽-P1C-第三连接肽-P1C-第四连接肽-P1D-第五连接肽--P30片段，对应的核酸序列通过化学合成的方法获得。在序列上游引物引入BamHI位点并添加保护性碱基CGC，下游引物引入SalI位点并添加保护性碱基GTC，具体的Mp重组抗原氨基酸序列见SEQ ID NO.1，核苷酸序列见SEQ ID NO.2。化学合成目的基因片段后，用上下游引物(引物序列SEQ ID NO.3) 进行PCR扩增，扩增获得的PCR片段经回收(本发明所使用的分子生物学提取和回收试剂盒均购自TAKARA生物工程有限公司)之后，用BamHI和SalI酶切 (本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自TAKARA有限公司)，连接到用 BamHI和SalI酶切之后的表达载体pET-28a(购自Novagen公司)中，提取重组质粒pET-28a-MP，经酶切、测序验证为正确的基因序列，得到重组质粒pET- 28a-MP，即用于表达Mp重组抗原的重组质粒(图1)。将验证为阳性的重组质粒pET-28a-MP转化至表达菌E.coli BL2(DE3)感受态细胞内，得到重组质粒的表达菌株，冻存备用。
2、肺炎支原体重组抗原的原核表达
Buffer A的配制：20mM Tris-HCl，1mM EDTA，50mM NaCl，0.01％Triton X-100，pH8.0。
挑取含有重组质粒的表达菌接种于含50μg/mL卡那霉素的500mL LB培养基，置于37度170rpm摇床过夜培养至菌体浓度为OD600＝0.6～1.0，加入 IPTG(终浓度为1mM)进行诱导，170rpm，37度诱导约4h，4℃12,000g离心10 分钟收集菌体，获得菌体每100mg用5mL裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl， pH8.0，1mMEDTA，100mM NaCl)重悬，冰浴超声破碎，4℃12,000g离心20分钟，分离上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分目的蛋白为包涵体表达，保留沉淀进行后续处理。沉淀用Buffer A洗杂3次，4℃12,000rpm× 15min，去上清，沉淀用8M尿素+PBS(pH8.0)溶解，进行纯化。
3、肺炎支原体重组标记抗原的纯化、复性(制备MP-1)
平衡液的配制：20mM Tris-HCl(pH7.9)，0.5mMNaCl，10mmol/L咪唑,8M 尿素，pH8.0；
洗脱液的配制：20mM Tris-HCl(pH7.9)，0.5mMNaCl，1500mmol/L咪唑， 8M尿素，pH8.0；
配制好平衡液和洗脱液以后，利用ATKA purifier 10/UPC层析仪(购自GE 医疗集团)，先用平衡液清洗平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)， Ni-NTA柱平衡好之后，将待上柱样品上柱结合，结合完之后，再用10倍柱体积的平衡液清洗柱子，然后再用洗脱液进行逐步洗脱，收集洗脱峰，测定蛋白浓度，待复性。
将上述Ni-NTA亲和纯化得到的目的蛋白用平衡液稀释至浓度为 0.5mg/mL，再分别用含有4M，3M，2M，1M，0.5M，0M尿素的复性缓冲液(20mM PBS，2mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，5％甘油，1mM EDTA，pH 8.0)于4℃进行透析，每隔梯度12小时换液一次，最终将目的蛋白透析至缓冲液(20mM PBS，1mM EDTA，pH 8.0)中，收集透析样品，离心，用超滤浓缩管 (购自Millipore公司，截留蛋白分子量为10kD)浓缩，收集浓缩样，即为Mp 重组标记抗原MP-1，测定蛋白浓度，置于-20度备用。
4、肺炎支原体重组包被抗原的纯化、复性(制备MP-2)
电洗脱缓冲液的配制：1/万SDS，pH7.4的PB溶液；
采用浓度为9％的蛋白分离胶进行凝胶电泳，3.5mL粗抗/板胶的上样量进行上样，电泳电压为100V，4度过夜电泳，电泳后目标蛋白带距离胶的底部约 2～4cm，目标蛋白带宽约1.2cm，将目标蛋白带切下来后，6板目标蛋白带胶条/袋进行装袋，并加入6mL电泳洗脱液，扎紧袋口两端，将该透析袋置于电泳槽中，并在电泳槽中加入电泳缓冲液至缓冲液没过装胶条的透析袋即可，在 4度环境下100V电压电泳3h，停止电泳，将透析袋中的液体挤出，并用0.22 μm的滤膜进行过滤，收集滤液，即为肺炎支原体重组包被抗原MP-2，测定蛋白浓度，置于-20度备用。
肺炎支原体重组抗原的验证
取纯化后蛋白进行电泳12％的SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，进行蛋白免疫印迹试验。抗体使用肺炎支原体IgM，IgG抗体分别进行检测(见图 2)
实施例二
重组肺炎支原体抗原的应用
(1)包被蛋白为高纯度基因重组MP蛋白
包被蛋白为实施例1制备的高纯度基因重组MP-1蛋白和MP-2。
(2)抗原包被酶标板的制备
用包被缓冲液(pH值为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液)将以MP蛋白进行 1：10000稀释，加入到酶标板孔中，每孔100μL，37℃反应2小时，甩掉包被液后，拍干，每孔加入200μL的封闭液(含终浓度为2％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液)，37℃反应2小时，甩掉封闭液，拍干，干燥，用铝箔袋真空包装保存。
2、工作浓度酶溶液配制
HRP标记羊抗人IgM需经亲和层析纯化，种属特异性强，纯度大于95％，效价不低于1:2000。选择商品化酶联物稀释液，由biopanda诊断试剂公司生产。
3、血清样品的稀释
将待检样本用样本稀释液按1:100稀释，取5uL血清用500uL样本稀释液稀释并混匀。
4、检测
向包被高纯度基因重组MP蛋白的酶标板中加入稀释好的样本100μL，并在预留的校准品孔中加入MP-IgM校准品溶液各100μL，用盖板模封板，37℃恒温箱中反应30分钟，洗板5次，拍干；每孔中各加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM 100μL，用盖板模封板，37℃恒温箱中反应20分钟，甩干孔内液体，洗板5次，拍干；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μL，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10 分钟，每孔加入2mol/L硫酸终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450/630nm处，测定每孔吸光值(OD值)。
5.试剂盒临床试验评价
用制备的ELISA试剂盒对30例确诊的MP病人进行检测IgM(胶体金方法检测)，检测程序和结果判断严格按照实施例1提供的使用方法进行。检测结果如表1，表2.
6.测定OD值判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，空白对照应小于0.1，阳性的数值－阴性数值大于0.1，同时大于规定的阴性对照OD值的 2.1倍，即为阳性。
SEQ ID NO.1:
NEKLQGAEATGSSTTSGSGQSTQRGGSSGDTKVKALKIEVKKKSDSEDNGQLQLEKNDLANAPIKRSEESGQSVQLKADDFGTALSSSGSGGNSNPGSPTPWRP-GSGSGS- RNDKASSGQSDENHTKFTSATGMDQQGQSGTSAGNPDSLKQDNISKSGDSLTTQD-GSGSGS- SFGTDHSTQPQPQSLKTTTPVFGTSSGNLSSVLSGGGAGGGSSGSGQSGVDLSPVEKVSGWLVGQLPS TSDGNTSSTNNLAPNTNTGND-GSGSGS- TVPIVVIVLSVTLGLAIGIPMHKNKQALKAGFALSNQKVDVLTKAVGSVFKEIINRTGISQAPKRLKQTSAAKPGAPRPPVPPKPGAPKPPVQPPKKPA-GSGSGS- PQPGMAPRPGMPPHPGMAPRPGFPPQPGMAPRPGMPPHPGMAPRPGFPPQPGMAPRPGMPPHPGMAPR PGFPPQPGMAPRPGMQPPRPGMPPQPGFPPKR。
SEQ ID NO.2：
ATGAAAAACTCCAGGGCGCTGAGGCCACTGGTTCTTCAACCACATCTGGATCTGGCCAATCCACCCAACGTGGGGGTTCGTCAGGGGACACCAAAGTCAAGGCTTTAAAAATAGAGGTGAAAAAGAAATCGGACTC GGAGGACAATGGTCAGCTGCAGTTAGAAAAAAATGATCTCGCCAACGCTCCCATTAAGCGGAGCGAGG AGTCGGGTCAGTCCGTCCAACTCAAGGCGGACGATTTTGGTACTGCCCTTTCCAGTTCGGGATCAGGC GGCAACTCCAATCCCGGTTCCCCCACCCCCTGAAGGCCGAAGGAATGATAAGGCTTCAAGTGGACAAA GTGACGAAAACCACACCAAGTTCACGAGCGCTACGGGGATGGACCAGCAGGGACAATCAGGTACCTCC GCGGGGAATCCCGACTCGTTAAAGCAGGATAATATTAGTAAGAGTGGGGATAGTTTAACCACGCAGGA CACTTGGTGAAGCCTAAGAAAGTTACCCAATCCGACAAGTTAGACGACGATCTTAAAAACCTGTTGGA CCCCAACCAGGTTCGCACCAAGCTGCGCCAAAGCTTTGGTACAGACCATTCCACCCAGCCCCAGCCCC AATCGCTCAAAACAACGACACCGGTATTTGGGACGAGTAGTGGTAACCTCAGTAGTGTGCTTAGTGGT GGGGGTGCTGGAGGGGGTTCTTCAGGCTCAGGTCAATCTGGCGTGGATCTCTCCCCCGTTGAAAAAGT GAGTGGGTGGCTTGTGGGGCAGTTACCAAGCACGAGTGACGGAAACACCTCCTCCACCAACAACCTCG CGCCTAATACTAATACGGGGAATGATAGCGCCAAAACGCTTGAAACAAACCAGTGCGGCTAAACCAGG AGCACCCCGCCCACCAGTACCACCAAAGCCAGGGGCTCCTAAGCCACCAGTGCAACCACCTAAAAAAC CCGCTAAGCCCATGCTGAAGCGGAAGTTGAACCAGCACCACAACCAGTACCAGTACCACCTCAACCCC AAGTCCAAATTAACTTCGGTCCCCGTACTGGTTTCCCACCTCAACCCGGTATGGCGCCTCGTCCAGGT ATGCCGCCACACCCCGGTATGGCTCCAAGATCTGGTTTCCCACCTCAACCCGGTATGGCGCCTCGTCC AGGTATGCCGCCACACCCCGGTATGGCTCCAAGACCTGGTTTCCCACCTCAACCCGGTATGGCGCCTC GTCCAGGTATGCCGCCACACCCCGGTATGGCTCCAAGACCTGGTTTCCCACCTCAACCCGGTATGGCG CCTCGTCCCGGAATGCAACCACCACGTCCTGGCATGCCACCCCAACCCGGTTTTCCACCAAAACGC。
SEQ ID NO.3：
BamHI
上游引物：5'-CGCGCGGATCCGATGAAAAACTCCAGGGCG-3'
下游引物：5'-CGCGTCGACGTC GCGTTTTGGTGGAAAAGGC-3'
SalI
表1.MP-1抗原临床样本检测IgM结果
表2：MP-2抗原临床样本检测IgM结果
由表1的数据可知，相同阳性血清样本，MP-1重组抗原检测的OD值较高，MP-2抗原检测的OD值相对较高，但都比胶体金检测灵敏，表明本发明的 MP-1重组抗原的灵敏度更高，且MP-1抗原更适合包被使用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。