具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中涉及的材料或试剂如下：

(1)菌株、血清

鸡滑液支原体(MS)WVU1853株(ATCC25204)、鸡毒支原体(MG)R_low株(CVCC 1651)以及衣阿华支原体(MI)695株(CVCC364)购自中国兽医药品监察所；

MS临床分离株JS1、SD1、SH1和HB1以及大肠杆菌(EC)O1(APEC O1)、O2(DE719)、O78(APEC94)血清型菌株由本实验室分离鉴定和保存，菌种保存于含25％甘油的各自培养基中，-80℃冻存。

鸡滑液支原体标准阳性血清(MS标准阳性血清)、MG阳性血清、鸡白痢鸡伤寒沙门菌(SPG)阳性血清、鸡新城疫病毒(NDV)阳性血清、传染性支气管炎病毒(IBV)阳性血清、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)阳性血清以及SPF鸡血清(MS阴性血清)均购自中国兽医药品监察所；

MS临床分离株JS1、SD1、SH1和HB1阳性血清、MG R_low株阳性血清、MI 695株阳性血清、ECO1、O2、O78三价阳性血清由本实验室制备，平板凝集试验检验均为阳性；

临床鸡血清样本150份采集自上海某种禽场，所有血清均经滑液支原体抗体检测试剂盒(IDEXX)检验判定为MS阳性或阴性。

(2)培养基、主要试剂及试剂配置

支原体液体培养基：称取33g支原体基础培养基(青岛海博)，加入适当双蒸水溶解，定容至900ml，121℃灭菌15min，冷却后加入100ml灭活猪血清(Gibco)和10ml 1％NAD(Roche，过滤除菌)，混匀后4℃保存。LB培养基购自英国OXOID公司。

BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司；蛋白纯化柱His TrapTM FFcrude购自GE Healthcare Life Sciences公司；脱脂乳购自BBI Life Science公司；山羊抗鸡IgG-HRP购自Abcam公司；TMB底物显色液购自北京天根生物有限公司。96孔酶标板为美国Corning公司产品；滑液支原体抗体检测试剂盒为美国IDEXX公司产品。其他常规试剂均为进口或国产分析纯。

溶液配制：

碳酸盐包被缓冲液(CBS,PH9.6)：Na₂CO₃ 1.6g，NaHCO₃ 2.92g，蒸馏水定容至1000ml，用0.1M HCl或NaOH调pH值至9.6；

磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)：KH₂PO4 0.24g，KCl 0.2g，Na₂HPO41.44g，NaCl 8g，加去离子水定容至1000ml，用0.1M HCl或NaOH调pH值至7.2；

洗涤缓冲液：PBST，0.5ml Tween-20溶于1000ml PBS；

封闭液：5％脱脂乳-PBS，5g脱脂乳溶于100ml PBS；

抗体稀释液：5％脱脂乳-PBST，5g脱脂乳溶于100ml PBST；

血清样品稀释液：5％脱脂乳-PBST中加入30％BL21全菌蛋白；

底物溶液：可溶型单组分TMB底物溶液；

终止液：2M H₂SO₄。

实施例1

鸡滑液支原体抗原蛋白LP85(MS LP85)的鉴定、克隆和表达。

1.1MS免疫原性蛋白的筛选

1.1.1MS膜蛋白提取

将对数生长期MS WVU1853培养物按照5％的比例转接至支原体液体培养基中，37℃静置培养30h，12000g离心收集菌体。PBS洗涤2次后用1％菌液体积的PBS重悬，超声破碎20min(功率40％，工作5s，间歇5s)，获得MS全菌蛋白。用支原体膜蛋白提取试剂盒(上海贝博)，参照说明书方法从MS全菌蛋白中提取膜蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度，分装后保存于-80℃。

1.1.2Western blot分析MS免疫原性蛋白和质谱分析

将MS全菌蛋白、膜蛋白分别进行SDS-PAGE电泳，各制备两块电泳胶，其中一块胶进行考马斯亮蓝R250染色，另外一块胶转印硝酸纤维素膜(NC膜)，进行Western blot检测。转印后的NC膜用5％脱脂乳-PBS封闭2h，加入MS标准阳性血清(1:500)，37℃孵育1.5h，PBST洗涤3次，加入羊抗鸡IgG-HRP(1:50000，英国Abcam)，37℃孵育1h，最后加入ECL底物显色液进行显色反应。

图1为实施例1所涉及的Western blot筛选MS免疫原性蛋白的结果示意图。

Western blot筛选MS免疫原性蛋白的结果如图1所示。其中：

A：SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色图；

B：与MS感染血清的Western blot反应结果；

M：蛋白分子标准品；1:MS WVU1853膜蛋白；2:MS WVU1853全菌蛋白。

对照Western blot阳性条带结果，在胶上相应位置处切取条带(见图1中黑色方框标记的位置)，送上海中科新生命科技有限公司进行LCMSMS(nanoLC-QE)质谱分析。

1.1.4生物信息学分析

对获得的质谱结果进行生物信息学分析，从中挑选分子量约为85kD的滑液支原体脂蛋白(MS LP85蛋白)作为候选免疫原性蛋白进行生物信息学分析。

其中，使用PSORTb(http://www.psort.org/psortb/)对蛋白的亚细胞定位进行在线预测；

使用TMHMM server 2(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白的跨膜区；

使用在线软件SignalP 4.1Seve(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白信号肽；

利用在线Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)检索Non-redundant protein sequences(nr)数据库，分析蛋白序列的保守性及特异性。

生物信息分析结果：

TMHMM和SignalP预测该蛋白无跨膜区，无信号肽；

利用PSORTb进行亚定位预测，结果显示其为外膜蛋白

通过Blastp将MS LP85氨基酸序列比对nr数据库，结果显示MS LP85在MS种内高度保守，不同MS分离株之间的同源性高达96％-100％；与MG LP85蛋白的同源性为35％-36％，与其他支原体的同源性仅为28％-36％，表明MS LP85蛋白在MS种间的保守性好，可用作鸡滑液支原体诊断靶标。

另外，通过上述分析显示，MS LP85蛋白的编码基因全长为2319bp；是一种脂蛋白，分子量约为85kD；其靶标蛋白质序列为：MSCGAPQEEKKPTNPKDGNKDGGIIDLPPTIGGPGEGGDSPRTYGSIDPVQSKLVGSWADYTKLSIAKRYEVDNKAYLNGLKSQYDIDPKQEFVPSDIKNGFGTVQAYDDKATKLGLPDFVTSYLKGFTTYSGSGLEISPNVSGPALGFWNSEQSGFDGRSRFLPNDLYKNTALQTYSISYVNEVKGDYVNEVKGDIEGTGKNTLKSNKGTAWILDYVKPTDSSYPTKWYIATNIHVIGDLTFTKSQTDSFGSDFTSIYDEEREKPLIKEARKVKAQIDELQNEYNEVYRKLQTKEHENDQALKARADQLNFELAPPLQKKLKDLNAQISGLTKNVTLAILDSDVPLQTSLNTVSADSRMKFVTLPASAVNIVYTANDFLKTSPKDYLDTTSTHNKDYLNNQEMADFAVLEIDFSKVTGEFKYTKNSVGDKPAKEMTVNSAQELARVMTNAYASTEKQDKQIKFAKNSLFYQYKDLTNEKVTVTNDANKQKLQVSRIVANFVSLGYPIAKDDLVNLRAEFPAKYAGREGILLAENDNSLWTNKPQKGRNFYQEFGNRLNRSMILRNFVQYPGIYDLFITNPVINKGVGFNIKQIKDKTSSYQQGNYLNYGLAYSLESWRPAPGASGSSLRDLNNEVLGINFAIRAGAGSGTSLIQAFRSEGANYGGVYGSYNLPQYDLIYGGGKDQRTSYREALAKILKNGETTNLFTSGVNVIPEEYKFRTNALINFTNSSNPEEAGLITNTGGGVQALTDQNKKYGSTITNPVVLPEGTS。

1.2鸡滑液支原体抗原蛋白LP85(MS LP85)的表达纯化

1.2.1.重组表达载体构建及鉴定

选取候选筛选出的MS LP85，根据GenBank中公布的基因序列，将终止密码子TGA优化成TGG，两端分别添加酶切位点Sac I(GAGCTC)和Xho I(CTCGAG)，送上海睿勉生物科技有限公司合成DNA序列。

将合成的MS LP85基因序列用Sac I和Xho I双酶切后连接表达载体pCold I(TaKaRa)构建重组表达质粒pCold I-LP85，转化E.coli DH5α感受态细胞后在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养12-15h，挑取单菌落，用MS lp85基因引物P1和P2进行PCR鉴定。

其中，

引物P1为：5’-GAGCTCATGAGCTGTG-3’；

引物P2为：5’-CTCGAGTTAGCTTGTACC-3’；

PCR体系(20μl)为：Easy Taq PCR mix(2×)10μl，上、下游引物各0.2μmol/l，菌落模板，dd H₂O补足至20μl体系。PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。将鉴定为阳性的菌株(2331bp)扩大培养，抽提质粒，对质粒进行双酶切鉴定，鉴定正确的即为重组表达载体pCold I-LP85。

图2为实施例1的重组表达载体pCold I-MS LP85的PCR及双酶切鉴定结果。

图2中，(A)M：DNA分子质量标准DL5000；1：MS LP85合成基因(阳性对照)；2：E.coliDH5α(pCold I-MS LP85)菌液样品；3：阴性对照；

(B)M：DNA分子标准DL5000；4：重组质粒pCold I-MS LP85双酶切产物

如图2中A所示，重组菌株单菌落经PCR鉴定为阳性，进一步用Sac I和Xho I进行双酶切鉴定重组表达质粒pCold I-MS LP85，结果见图2中B，图2中B显示获得与预期大小相符的片段。

1.2.2鸡滑液支原体重组表达蛋白LP85表达与纯化

将鉴定正确的重组载体pCold I-MS LP85转化E.coli BL21(DE3)，获得重组表达菌株E.coli BL21：将鉴定正确的重组表达载体pCold I-LP85及空载pCold I分别转入E.coli BL21，在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min培养至菌液的OD₆₀₀为0.4～0.6；

在重组表达菌株E.coli BL21中加入0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)，16℃,110rpm/min继续培养24h诱导得到菌体；

离心收集诱导后的菌体，PBS洗涤2次后重悬于PBS，用超声破碎仪裂解，离心收集上清和沉淀，分别用SDS-PAGE检测鸡滑液支原体重组表达蛋白LP85的表达，将检测为可溶性表达的His-MS LP85用His标签蛋白纯化柱进行纯化得到鸡滑液支原体重组表达蛋白LP85(用rMS LP85蛋白表示)。

图3为实施例1所涉及的鸡滑液支原体重组表达蛋白LP85(rMS LP85)的表达和纯化结果。

图3中，M：蛋白分子标准品；1：IPTG诱导的空载体菌；2：IPTG诱导的重组表达菌株裂解后上清；3：纯化的重组蛋白rMS LP85

纯化后用BCA试剂盒测定rMS LP85蛋白的浓度，进行SDS-PAGE电泳分析，分析结果如图3所示，图3结果显示重组蛋白的条带大小约为90kD，与目的蛋白的预期分子量基本一致，纯化后的rMS LP85蛋白条带较纯，无杂带。

1.2.3 Western blot分析重组鸡滑液支原体重组表达蛋白LP85(rMS LP85蛋白)的特异性

纯化rMS LP85蛋白用Western blot检测其对MS阳性血清、非MS阳性血清和SPF鸡血清的反应性：将rMS LP85蛋白(1μg/孔)进行SDS-PAGE电泳后，转印到NC膜上，5％脱脂乳-PBS封闭2h；然后分别与MS标准阳性血清、MS临床分离株JS1、SD1、SH1及HB1阳性血清、MGR_low株阳性血清、MI 695株阳性血清、EC O1、O2及O78三价阳性血清、SPG阳性血清、NDV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清或SPF鸡阴性血清(1:500)分别室温孵育2h，洗涤后加入羊抗鸡IgG-HRP(1:50000，Abcam)室温孵育1.5h，最后加入ECL底物显色液进行显色反应。

图4为实施例1所涉及的鸡滑液支原体重组表达蛋白LP85(rMS LP85蛋白)与不同MS临床分离株阳性血清的Western blot反应。

图4中，M：蛋白分子标准品；1：MS WVU1853标准阳性鸡血清对照；2：MS JS1阳性鸡血清；3：MS SD1阳性鸡血清；4：MS SH1阳性鸡血清；5：MS HB1阳性鸡血清；6：SPF鸡阴性血清对照；

纯化后的rMS LP85蛋白分别与MS WVU1853标准阳性血清、MS临床分离株JS1、SD1、SH1及HB1阳性血清进行Western blot反应，SPF鸡血清作为阴性对照。结果如图4显示，rMSLP85蛋白(90kD位置)与MS不同分离株的阳性血清均能在相应位置发生明显的反应条带，与SPF鸡血清无反应条带，显示MS LP85具有较好的免疫反应性，且种内保守性较好。

图5为实施例1所涉及的鸡滑液支原体重组表达蛋白(rMS LP85蛋白)与不同病原的阳性鸡血清的Western blot反应。

图5中，M：蛋白分子标准品；1：MS WVU1853阳性血清；2：MG阳性鸡血清；3：MI695株阳性鸡血清；4：EC(O1、O2及O78)三价阳性血清；5：SPG阳性血清；6：IBV阳性血清；7：IBDV阳性血清；8：NDV阳性血清

用纯化后的rMS LP85蛋白与MG R_low株鸡阳性血清、MI 695株阳性血清、EC O1、O2及O78三价阳性血清、SPG阳性血清、NDV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清分别进行Western blot反应，SPF鸡血清用作阴性对照，MS WVU1853标准阳性血清用作阳性对照，结果见图5所示，图5中，纯化蛋白rMS LP85与MS WVU1853标准阳性血清有较强反应条带，与其他非MS阳性血清均不出现反应条带。

实施例1的免疫反应性和特异性检测结果表明鸡滑液支原体抗原蛋白LP85能用作相应鸡滑液支原体抗体ELISA检测的靶标。

实施例2

本实施例说明采用实施例1筛选鉴定的鸡滑液支原体抗原蛋白LP85建立鸡滑液支原体抗体的ELISA检测方法，并说明相应的ELISA试剂盒和使用方法。

根据实施例1，可以如下建立鸡滑液支原体抗体的ELISA检测方法：

2.1最适反应条件确定

2.2.1最适抗原包被浓度和最适血清稀释倍数的确定

将rMS LP85蛋白抗原用前述的碳酸盐包被缓冲液稀释至10μg/ml、7.5μg/ml、5.0μg/ml、2.5μg/ml和1.25μg/ml，按100μl/孔的量分别包被酶标板；MS标准阳性血清、SPF鸡阴性血清分别用前述的抗体稀释液作1:200、1:500倍稀释，以分别作为阳性血清对照和阴性血清对照；酶标抗体选用羊抗鸡IgG-HRP，该酶标抗体用厂家Abcam公司推荐的稀释度稀释；按常规ELISA程序测定OD₄₅₀值。选择阳性血清OD₄₅₀值(P)大于1.0，阴性血清OD₄₅₀值(N)小于0.12，且P/N最大比值的包被浓度和血清稀释倍数用作最适抗原包被浓度和最适血清稀释倍数。

方阵滴定法检测结果显示(表1)，MS LP85重组蛋白以5μg/ml的浓度包被，血清以1:200稀释时，阳性血清OD₄₅₀值大于1.0，阴性血清OD₄₅₀值小于0.12，且P/N值最大。因此确定5μg/ml为最适抗原包被浓度，1:200为最适血清稀释倍数。

2.2.2酶标抗体稀释倍数的优化

用上述选定的抗原包被浓度5μg/ml包被酶标板，加入MS标准阳性血清、SPF鸡阴性血清(上述选定的最适稀释倍数1:200进行稀释)，以及1:10000、1:20000和1:40000倍比稀释的羊抗鸡IgG-HRP，测定OD₄₅₀值。计算P/N值，选择阳性血清OD₄₅₀值大于1.0，阴性血清OD₄₅₀值小于0.12，且P/N最大比值的组合为酶标抗体的稀释度。

结果显示，当酶标二抗稀释倍数为1:20000时，阳性血清OD₄₅₀值大于1.0，阴性血清OD₄₅₀值小于0.12，且P/N值最大。因此确定酶标二抗稀释度为1:20000。

2.2.3封闭液的优化

在上述的洗涤缓冲液PBST中分别添加5％的脱脂乳或BSA作为封闭液进行ELISA检测，比较P/N值，选择P/N最大值的组，确定为最适封闭液。具体为，分别用5％脱脂乳-PBS和5％BSA-PBS对酶标板进行封闭，37℃作用2h，检测结果显示(表3)，5％脱脂乳-PBS比5％BSA-PBS封闭组的P/N值较大，封闭效果较好。

2.2.4抗原包被条件优化

用上述选定的抗原包被浓度包被酶标板，孵育条件分别为4℃过夜，37℃温育30min、1h和2h。按上述确定好的血清和羊抗鸡IgG-HRP稀释度进行常规ELISA操作，测定OD₄₅₀值，选择P/N最大比值的组作最佳抗原包被条件。

在不同的条件下包被抗原，结果如表4显示，当包被条件为37℃2h时，P/N值最大，为16.685，阳性血清OD₄₅₀值为1.485，阴性血清OD₄₅₀值为0.089，因此确定包被条件为37℃温育2h最佳。

2.2.5底物的最佳反应时间

在上述优化条件下，即以5μg/ml rMS LP85，100μg/孔加入酶标板包被30min，洗涤后用5％脱脂乳封闭2h；加入1:200稀释的MS阳性血清和SPF鸡血清作用1.5h，洗涤后加入1:20000倍稀释的羊抗鸡IgG-HRP，洗涤后加入TMB底物于37℃分别反应5min、10min、15min及20min，加入终止液，比较P/N值，确定最佳反应时间。

检测结果(表5)显示显色时间为15min时，P/N值最大，所以确定显色时间为15min。

2.2.6血清样品稀释液的优化

在5％脱脂乳-PBST(也即上述的抗体稀释液)中分别加入5％、10％、20％、30％、40％、50％的E.coli BL21(DE3)全菌蛋白作为血清样品稀释液，按上述确定好的抗原包被量和血清、羊抗鸡IgG-HRP稀释度进行常规ELISA操作，测定OD₄₅₀值，选择P/N最大比值的组作为血清样品稀释液。

检测结果(表6)显示在5％脱脂乳-PBST中加入30％的E.coli BL21(DE3)全菌蛋白作为血清样品稀释液时，P/N值最大，所以确定血清样品稀释液中加入30％的E.coli BL21(DE3)全菌蛋白。

*BL21全菌蛋白制备：pcold I空载(BL21)按1％转接至含氨苄抗性的LB培养基中，37℃、220rmp培养8h；收集pcold I空载(BL21)菌液，PBS洗涤2次后，将菌液浓度调至OD₆₅₀＝1.0；超声破碎后按照比例加入5％脱脂乳-PBST。

2.2.7阳性临界值的确定

使用本试剂盒检测42份鸡滑液囊支原体抗体阴性血清，根据OD₄₅₀值计算出S/N值(表7)，求得其S/N值平均值X＝2.163；标准偏差SD＝0.0761，由此确定阴阳性临界值点C＝X+3SD＝2.16+3x0.0761＝2.388，即待检血清S/N值等于或者高于2.388判断为阳性，低于2.388判为阴性。

计算公式：S/N＝样品OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值平均值

2.2.8优化后的ELISA方法

具体如下：

酶标板抗原包被：用碳酸盐包被缓冲液稀释抗原至5μg/ml，100μl/孔加入96孔酶标板(Corning,USA)中，37℃温育2h，然后用PBST洗涤3次，拍干；

酶标板封闭：包被好的酶标板，每孔加入200μl的5％脱脂乳-PBS封闭，37℃封闭2h，继续PBST洗涤3次，拍干；

加入经血清样品稀释液稀释的血清：加入经血清样品稀释液按1:200倍稀释的待检血清100μl/孔，并加入经血清样品稀释液按1:200倍稀释的MS标准阳性、阴性血清分别用作阳性、阴性对照，37℃作用1.5h，再PBST洗涤4次，拍干；

加入经抗体稀释液稀释的酶标抗体：每孔继续加入经抗体稀释液1:20000倍稀释的山羊抗鸡IgG-HRP二抗，37℃作用1h，再洗涤4次，拍干；

加入底物显色：每孔继续加入100μl TMB底物显色液，37℃避光显色15min；

加入终止液完成检测：每孔继续加入50μl终止液，10分钟内在酶标仪上测OD₄₅₀值。

根据本实施例建立的鸡滑液支原体抗体的ELISA检测方法，可以制备相应的ELISA检测试剂盒，该试剂盒理所当然要包括实施例1的能用于作为诊断靶标鸡滑液支原体抗原蛋白LP85，最好是实施例1重组表达和优化的鸡滑液支原体重组表达蛋白LP85，当然，该试剂盒还可以包括酶标板、酶标抗体、鸡滑液支原体标准阳性血清和鸡滑液支原体标准阴性血清(SPF鸡血清)，其中，酶标板可以是以一定包被浓度包被好了用于作为诊断靶标的鸡滑液支原体抗原蛋白LP85，也可以是使用时通过ELISA试剂盒提供的包被缓冲稀释液和鸡滑液支原体抗原蛋白LP85，按照提供的包被浓度进行包被，为了对酶标抗体和血清进行稀释，并完整检测，还可以包括包被缓冲稀释液、洗涤缓冲液、封闭液、抗体稀释液、血清样品稀释液、底物溶液以及终止液体等溶剂。

总之，与上述ELISA检测方法相应的ELISA试剂盒，可以是只提供用于作为诊断靶标的鸡滑液支原体抗原蛋白LP85，也可以是包被好抗原的酶标板，这里不一一列举，具体可以根据实际需要进行试剂盒的设置，当然，为了更方便使用，试剂盒也可以是包括完整检测所需试剂的整套装置，使用者根据ELISA检测方法使用试剂盒即可操作完成，例如，可以根据上述优化后的ELISA检测方法，从对抗原进行包被开始完成整套操作。

实施例3

本实施例为对实施例2提供的ELISA检测方法以及相应试剂盒进行特异性试验、敏感性试验和重复性试验。

3.1特异性试验

用上述优化条件建立的间接ELISA检测方法分别对MS临床分离株JS1、SD1、SH1和HB1阳性血清、鸡毒支原体MG R_low株阳性血清、衣阿华支原体MI 695株阳性血清、大肠杆菌EC O1、O2及O78三价阳性血清、鸡白痢鸡伤寒沙门菌SPG阳性血清、鸡新城疫病毒NDV阳性血清、传染性支气管炎病毒IBV阳性血清、鸡传染性法氏囊病毒IBDV阳性血清进行检测，同时设定MS标准阳性血清和SPF鸡血清(MS阴性血清)对照，测定OD₄₅₀值，商品化滑液支原体抗体检测试剂盒(IDEXX)用作方法对照，参照说明书进行操作。

本ELISA检测方法检测结果显示如表8，滑液支原体阳性血清结果为阳性，而鸡毒支原体、衣阿华支原体、大肠杆菌O1、O2、O78三价血清、鸡白痢鸡伤寒沙门菌二价阳性鸡血清、鸡传支阳性血清、鸡新城疫阳性血清及SPF鸡阴性血清均为阴性结果，该结果同IDEXX试剂盒检测结果一致，故本实验室建立的ELISA法与IDEXX试剂盒检测均具有较好的特异性。

3.2敏感性试验

待检血清从起始稀释度开始倍比稀释，以OD₄₅₀值的S/N值大于临界值的血清最大稀释倍数判为血清的抗体效价。取MS标准阳性血清，分别用血清样品稀释液作1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240、1:20480倍稀释后，用本发明建立的ELISA方法进行血清效价测定。同时，用商品化滑液支原体抗体检测试剂盒(IDEXX)测定抗体效价作为对照，并比较两种测定方法的敏感性。

从免疫后检测为阳性的血清中随机取5份样品，用根据实施例2建立的ELISA方法制备的3批试剂盒进行检测，并与IDEXX试剂盒进行抗体滴度比较，3批检测结果以及IDEXX试剂盒检测结果分别如表9、10、11和12所示，将表9-12的结果中两种试剂盒检测的血清效价结果做对比，结果见表13。

注：(+)表示检测结果为阳性；(-)表示检测结果为阴性；S/N＝样品OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值；阴性对照均值OD₄₅₀＝0.121；S/N≥2.388，判定滑液囊支原体抗体阳性；S/N<2.388，判定滑液囊支原体抗体阴性。

注：(+)表示检测结果为阳性；(-)表示检测结果为阴性；S/N＝样品OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值；阴性对照均值OD₄₅₀＝0.129；S/N≥2.388，判定滑液囊支原体抗体阳性；S/N<2.388，判定滑液囊支原体抗体阴性。

注：(+)表示检测结果为阳性；(-)表示检测结果为阴性；S/N＝样品OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值；阴性对照均值OD₄₅₀＝0.132；S/N≥2.388，判定滑液囊支原体抗体阳性；S/N<2.388，判定滑液囊支原体抗体阴性。

注：(+)表示检测结果为阳性；(-)表示检测结果为阴性；S/P＝(样品OD₆₅₀值-阴性对照均值)/(阳性对照均值-阴性对照均值)；根据IDEXX试剂盒判断说明S/P≥0.5为阳性。

上述结果显示，使用实验室制备的试剂盒和IDEXX公司试剂盒同时检测滑液囊支原体抗体，分别检测了免疫前、免疫后21日和免疫后48日血清各30份，免疫前血清试制试剂盒与IDEXX检测均为阴性；免疫后21日血清，试制试剂盒检测出阳性30份，IDEXX试剂盒检测出阳性28份；免疫后42日血清，试制试剂盒检测阳性30份，IDEXX试剂盒检测出阳性29份。两种试剂盒的符合率90％。实验室制备的3批试剂盒和IDEXX同时检测5份已知阳性血清，试制试剂盒对5份阳性血清的敏感性优于IDEXX试剂盒，实验室试制试剂盒敏感性较好。

3.3批内重复性试验

根据实施例2的ELISA检测方法制备的同一批试剂盒，同时检测24份血清，每份样品做5次批内重复实验并计算变异系数。结果如表14所示，结果表明：批内变异系数在0.88％～5.19％之间，说明ELISA试剂盒批内重复性较好。

注：(+)表示检测结果为阳性；(-)表示检测结果为阴性；S/N＝样品OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值；阴性对照均值OD₄₅₀＝0.088；S/N≥2.388，判定滑液囊支原体抗体阳性；S/N<2.388，判定滑液囊支原体抗体阴性。

3.4批间重复性试验

采用根据实施例2的ELISA检测方法制备的5个批次的试剂盒，检测24份血清，做批间重复实验并计算变异系数。结果见表15，结果表明：批间变异系数在2.06％-5.9％之间，说明根据ELISA检测方法制备的ELISA试剂盒批间重复性较好。

注：(+)表示检测结果为阳性；(-)表示检测结果为阴性；S/N＝样品OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值；阴性对照均值OD₄₅₀＝0.108；S/N≥2.388，判定滑液囊支原体抗体阳性；S/N<2.388，判定滑液囊支原体抗体阴性。

3.5临床样品的检测

使用根据实施例2的ELISA检测方法制备的试剂盒和IDEXX试剂盒同时检测150份临床血清样品。

注：(+)表示检测结果为阳性；(-)表示检测结果为阴性；S/N＝样品OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值；阴性对照均值OD₄₅₀＝0.159；S/N≥2.388，判定滑液囊支原体抗体阳性；S/N<2.388，判定滑液囊支原体抗体阴性；S/P＝(样品OD₆₅₀值-阴性对照均值)/(阳性对照均值-阴性对照均值)；根据IDEXX试剂盒判断说明S/P≥0.5为阳性。

150份临床血清样品用本实施例涉及的试剂盒检出阳性104份，IDEXX试剂盒检出阳性65份，两种试剂盒检出结果一致的有111份血清，不相符的有39份血清，符合率达到74％。

3.6Western blot验证与IDEXX检测结果不相符的临床血清样品

对3.5中检测出的，8份与IDEXX检测结果不相符的临床阴性血清，用Western blot进行验证。

图6为实施例3所涉及的Western blot验证与IDEXX检测结果不相符的临床血清样品检测结果。

结果如图6所示，8份血清样品均与原核表达的rLP85呈阳性反应，与根据实施例2的ELISA方法制备的鸡滑液支原体抗体ELISA检测试剂盒的检测结果一致，表明该ELISA检测试剂盒较IDEXX检测试剂盒更敏感、更准确。

实施例作用与效果

家禽呼吸道疾病是目前我国养鸡业面临最为主要的问题，而鸡毒支原体和滑液支原体常引起鸡群持续性感染，长期处于临床或亚临床状态，造成免疫抑制，引发其他重要传染病如新城疫、禽流感、传染性支气管炎等病并发和继发，造成严重经济损失。从近几年鸡毒支原体和滑液支原体的流行态势比较来看，滑液支原体对养禽业的危害日益增大，甚至其危害有可能会超过鸡毒支原体(6,9)。因此，在防控其他疾病的同时，加强对滑液支原体防控的研究，对于我国养禽业的发展有着重要的意义。

本发明基于鸡滑液支原体抗原蛋白LP85，特别是其鸡滑液支原体重组表达蛋白LP85的相应抗体的ELISA检测方法和据此制备的试剂盒，具有特异性、敏感性更好的特点，且检测的重复性好。与鸡毒支原体、衣阿华支原体、大肠杆菌(O1、O2、O78混合)、鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌阳性鸡血清均为阴性反应，相比中国兽药监察所生产的MS平板凝集抗原与鸡毒支原体及衣阿华支原体阳性血清均易发生交叉反应，本发明提供的能更特异性检测出MS抗体；另外，本发明的敏感性为美国IDEXX试剂盒的32倍；重复性试验表明该方法的批次内变异系数小于6％，批次间变异系数小于10％，具有较好的重复性。

而将该方法及根据其制备的检测鸡滑液支原体抗体的ELISA试剂盒，用于检测临床血清，与美国IDEXX试剂盒的相符率达74％，Western blot验证结果表明本发明中的检测鸡滑液支原体抗体的ELISA试剂盒更敏感和准确，具有较好的临床应用潜力。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所

<120> 鸡滑液支原体抗原蛋白LP85及相应抗体的ELISA检测方法及试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 772

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Cys Gly Ala Pro Gln Glu Glu Lys Lys Pro Thr Asn Pro Lys

1 5 10 15

Asp Gly Asn Lys Asp Gly Gly Ile Ile Asp Leu Pro Pro Thr Ile Gly

20 25 30

Gly Pro Gly Glu Gly Gly Asp Ser Pro Arg Thr Tyr Gly Ser Ile Asp

35 40 45

Pro Val Gln Ser Lys Leu Val Gly Ser Trp Ala Asp Tyr Thr Lys Leu

50 55 60

Ser Ile Ala Lys Arg Tyr Glu Val Asp Asn Lys Ala Tyr Leu Asn Gly

65 70 75 80

Leu Lys Ser Gln Tyr Asp Ile Asp Pro Lys Gln Glu Phe Val Pro Ser

85 90 95

Asp Ile Lys Asn Gly Phe Gly Thr Val Gln Ala Tyr Asp Asp Lys Ala

100 105 110

Thr Lys Leu Gly Leu Pro Asp Phe Val Thr Ser Tyr Leu Lys Gly Phe

115 120 125

Thr Thr Tyr Ser Gly Ser Gly Leu Glu Ile Ser Pro Asn Val Ser Gly

130 135 140

Pro Ala Leu Gly Phe Trp Asn Ser Glu Gln Ser Gly Phe Asp Gly Arg

145 150 155 160

Ser Arg Phe Leu Pro Asn Asp Leu Tyr Lys Asn Thr Ala Leu Gln Thr

165 170 175

Tyr Ser Ile Ser Tyr Val Asn Glu Val Lys Gly Asp Tyr Val Asn Glu

180 185 190

Val Lys Gly Asp Ile Glu Gly Thr Gly Lys Asn Thr Leu Lys Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Thr Ala Trp Ile Leu Asp Tyr Val Lys Pro Thr Asp Ser Ser

210 215 220

Tyr Pro Thr Lys Trp Tyr Ile Ala Thr Asn Ile His Val Ile Gly Asp

225 230 235 240

Leu Thr Phe Thr Lys Ser Gln Thr Asp Ser Phe Gly Ser Asp Phe Thr

245 250 255

Ser Ile Tyr Asp Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Ile Lys Glu Ala Arg

260 265 270

Lys Val Lys Ala Gln Ile Asp Glu Leu Gln Asn Glu Tyr Asn Glu Val

275 280 285

Tyr Arg Lys Leu Gln Thr Lys Glu His Glu Asn Asp Gln Ala Leu Lys

290 295 300

Ala Arg Ala Asp Gln Leu Asn Phe Glu Leu Ala Pro Pro Leu Gln Lys

305 310 315 320

Lys Leu Lys Asp Leu Asn Ala Gln Ile Ser Gly Leu Thr Lys Asn Val

325 330 335

Thr Leu Ala Ile Leu Asp Ser Asp Val Pro Leu Gln Thr Ser Leu Asn

340 345 350

Thr Val Ser Ala Asp Ser Arg Met Lys Phe Val Thr Leu Pro Ala Ser

355 360 365

Ala Val Asn Ile Val Tyr Thr Ala Asn Asp Phe Leu Lys Thr Ser Pro

370 375 380

Lys Asp Tyr Leu Asp Thr Thr Ser Thr His Asn Lys Asp Tyr Leu Asn

385 390 395 400

Asn Gln Glu Met Ala Asp Phe Ala Val Leu Glu Ile Asp Phe Ser Lys

405 410 415

Val Thr Gly Glu Phe Lys Tyr Thr Lys Asn Ser Val Gly Asp Lys Pro

420 425 430

Ala Lys Glu Met Thr Val Asn Ser Ala Gln Glu Leu Ala Arg Val Met

435 440 445

Thr Asn Ala Tyr Ala Ser Thr Glu Lys Gln Asp Lys Gln Ile Lys Phe

450 455 460

Ala Lys Asn Ser Leu Phe Tyr Gln Tyr Lys Asp Leu Thr Asn Glu Lys

465 470 475 480

Val Thr Val Thr Asn Asp Ala Asn Lys Gln Lys Leu Gln Val Ser Arg

485 490 495

Ile Val Ala Asn Phe Val Ser Leu Gly Tyr Pro Ile Ala Lys Asp Asp

500 505 510

Leu Val Asn Leu Arg Ala Glu Phe Pro Ala Lys Tyr Ala Gly Arg Glu

515 520 525

Gly Ile Leu Leu Ala Glu Asn Asp Asn Ser Leu Trp Thr Asn Lys Pro

530 535 540

Gln Lys Gly Arg Asn Phe Tyr Gln Glu Phe Gly Asn Arg Leu Asn Arg

545 550 555 560

Ser Met Ile Leu Arg Asn Phe Val Gln Tyr Pro Gly Ile Tyr Asp Leu

565 570 575

Phe Ile Thr Asn Pro Val Ile Asn Lys Gly Val Gly Phe Asn Ile Lys

580 585 590

Gln Ile Lys Asp Lys Thr Ser Ser Tyr Gln Gln Gly Asn Tyr Leu Asn

595 600 605

Tyr Gly Leu Ala Tyr Ser Leu Glu Ser Trp Arg Pro Ala Pro Gly Ala

610 615 620

Ser Gly Ser Ser Leu Arg Asp Leu Asn Asn Glu Val Leu Gly Ile Asn

625 630 635 640

Phe Ala Ile Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly Thr Ser Leu Ile Gln Ala

645 650 655

Phe Arg Ser Glu Gly Ala Asn Tyr Gly Gly Val Tyr Gly Ser Tyr Asn

660 665 670

Leu Pro Gln Tyr Asp Leu Ile Tyr Gly Gly Gly Lys Asp Gln Arg Thr

675 680 685

Ser Tyr Arg Glu Ala Leu Ala Lys Ile Leu Lys Asn Gly Glu Thr Thr

690 695 700

Asn Leu Phe Thr Ser Gly Val Asn Val Ile Pro Glu Glu Tyr Lys Phe

705 710 715 720

Arg Thr Asn Ala Leu Ile Asn Phe Thr Asn Ser Ser Asn Pro Glu Glu

725 730 735

Ala Gly Leu Ile Thr Asn Thr Gly Gly Gly Val Gln Ala Leu Thr Asp

740 745 750

Gln Asn Lys Lys Tyr Gly Ser Thr Ile Thr Asn Pro Val Val Leu Pro

755 760 765

Glu Gly Thr Ser

770

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagctcatga gctgtg 16

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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