阅读说明：本技术 对柑橘大实蝇成虫具有行为反应的柑橘幼果挥发物的测试方法 ([db:专利名称-en]) 是由 樊永亮 刘同先 李可 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种对柑橘大实蝇成虫具有作用的柑橘幼果挥发物的测试方法,通过该测试方法得到柑橘幼果挥发物柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛对柑橘大实蝇成虫具有行为反应作用,其中柠檬烯、4-萜烯醇和柠檬醛对柑橘大实蝇雄虫均有作用,柠檬烯和壬醛对柑橘大实蝇雌虫均有作用。本发明首次确认了对雄雌柑橘大实蝇成虫具有作用的柑橘幼果挥发物为柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛,可将其进一步应用于研发引诱剂和趋避剂的工作中,对柑橘产区的无公害防治将起到积极的作用。([db:摘要-en])

对柑橘大实蝇成虫具有行为反应的柑橘幼果挥发物的测试 方法

技术领域

本发明属于农业害虫防治技术领域，具体涉及一种对柑橘大实蝇成虫具有行为反应的柑橘幼果挥发物的测试方法。

背景技术

柑橘大实蝇是柑橘产业的大害虫，主要危害东南亚包括我国柑橘产区，是世界性的入侵和检疫害虫，其防治主要依靠化学农药，多年农药使用的结果造成严重的农药残留问题，使中国柑橘出口欧美日等发达国家受到限制，寻找新的绿色无公害害虫防治方法是当务之急。利用柑橘植物挥发物来诱杀柑橘大实蝇是一种理想的生物防治方法，但是我们对柑橘大实蝇能够感知的柑橘挥发物了解很少，我们在研究柑橘挥发物中，发现了几种柑橘大实蝇成虫可以识别的化合物，我们相信这几种化合物对设计新的柑橘大实蝇防治方法具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种柑橘幼果挥发物的应用和对柑橘大实蝇成虫具有触角电位反应的柑橘幼果挥发物的测定方法，本发明首次确认了对柑橘大实蝇成虫具有作用的柑橘幼果挥发物为柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛，并且雄柑橘大实蝇成虫对柠檬烯、4-萜烯醇和柠檬醛均有作用，雌柑橘大实蝇成虫对柠檬烯和壬醛均有作用，可将其进一步应用于研发引诱剂的工作中，对柑橘产区的无公害防治将起到积极的作用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种对柑橘大实蝇成虫具有作用的柑橘幼果挥发物的测试方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、测试前准备：味源瓶先后用蒸馏水、无水酒精、正己烷淋洗，随后放入200℃烘箱烘烤2h进行预处理，再用Parafilm封口膜密封味源瓶瓶口后，200mL/min气流持续通入空气；

步骤二、挥发物收集：将500克新鲜柑橘幼青果放置于步骤一中预处理后的味源瓶中，味源瓶的顶部与吸附管连接，吸附管中放置有Porapak-Q吸附剂，吸附管通过连接管与大气采样器连接，味源瓶的底部还通过连接管依次连接有流量计、活性炭过滤管和空气泵，打开空气泵的气泵和大气采样器，控制空气流速为500mL/min，大气采样器以流量为500mL/min的速率进行连续抽气，此时吸附管中的Porapak-Q吸附剂持续吸附柑橘幼青果的挥发物，抽气时间持续12小时，然后将吸附有挥发物的Porapak-Q吸附剂采用1mL二氯甲烷洗脱，并在-20℃的条件下冻存保存；

或者，将500克新鲜柑橘幼青果放置于步骤一中预处理后的味源瓶中，味源瓶的顶部与SPME萃取头连接，味源瓶的底部还通过连接管依次连接有流量计、活性炭过滤管和空气泵，打开空气泵的气泵，控制空气流速为200mL/min，此时SPME萃取头持续吸附柑橘幼青果的挥发物，吸附时间持续30分钟，SPME萃取头可直接用于气相色谱-质谱联用仪的进样。

步骤三、挥发物成分检测和确定对柑橘大实蝇成虫具有行为反应的成分：将柑橘大实蝇成虫的触角剪切下，并连接到玻璃电极上，采用气相色谱-触角电位测试系统鉴定出柑橘幼青果的挥发物的各个成分和鉴定出对柑橘大实蝇成虫具有行为反应的挥发物中的柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛；其中雄柑橘大实蝇成虫对柠檬烯、4-萜烯醇和柠檬醛均有作用，雌柑橘大实蝇成虫对柠檬烯和壬醛均有作用，因此，有助于进一步研发柑橘大实蝇成虫的引诱剂

优选地，采用气相色谱-质谱联用仪对步骤三中鉴定的柑橘挥发物进行验证鉴定，设置后进样口温度250℃，前进样口温度260℃，采用不分流模式；载气为高纯氦气，高纯氦气的质量纯度为99.999％，载气流速为每分钟1毫升，柱头压为1.45psi；起始色谱柱温度40℃保持2分钟，再以8℃/min升至260℃保持1分钟；

质谱条件：接口温度和离子源温度均为280℃，质量扫描范围45m/z～500m/z，扫描速率为5scans/s，离子化方式为EI，电子能量为70eV，发射电流为25μA。

优选地，采用触角电位仪验证柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛对柑橘大实蝇成虫的行为反应。具体过程为：选择柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛的标准样品在同一根触角上重复测试3次，连续测试5跟触角，测试的室内温度为23～27℃，湿度为60％RH～80％RH。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明首次在柑橘青果的挥发成分中获得对柑橘大实蝇成虫具有作用的四种挥发物柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛，并且雄柑橘大实蝇成虫对柠檬烯、4-萜烯醇和柠檬醛均有作用，雌柑橘大实蝇成虫对柠檬烯和壬醛均有作用；本发明第一次提出了对于雄虫和雌虫的挥发物引诱剂或趋避剂是存在差别的，这为下一步开发以植物食诱剂为主的植物诱杀剂奠定了基础；填补了柑橘大实蝇研究在GC-EAD操作技术方面的空白，为进一步研究柑橘大实蝇触角电位反应提供了技术支持。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明挥发物收集的结构示意图。

图2是本发明柑橘幼果挥发物的雄柑橘大实蝇成虫触角反应曲线。

图3是本发明柑橘幼果挥发物的雌柑橘大实蝇成虫触角反应曲线。

图4是雄柑橘大实蝇成虫触角电位-剂量反应曲线。

图5是雌柑橘大实蝇成虫触角电位-剂量反应曲线。

附图标记说明：

1—空气泵；2—活性炭过滤管；3—流量计；4—味源瓶；5—吸附管；6—大气采样器。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，本实施例采用含有Porapak-Q吸附剂的吸附管5或SPME萃取头萃取的方法对柑橘幼青果(红江橙幼果)的挥发物进行提取，并采用GC-EAD及GC-MS对挥发物的成分进行测试和鉴定，挥发物收集装置包括将红江橙幼果放置在味源瓶4中，味源瓶4的顶部与吸附管5连接，吸附管5中放置有Porapak-Q吸附剂，吸附管5通过连接管与大气采样器6连接，味源瓶4的底部还通过连接管依次连接有流量计3、活性炭过滤管2和空气泵1，空气泵1为G-103色谱用空气泵，由北京东西分析仪器有限公司生产。所述Porapak-Q吸附剂的用量为200毫克,吸附剂的孔径为80/100目,生产公司为美国Waters Associates；吸附管5在挥发物吸附之前用3mL二氯甲烷淋洗，以流量为70mL/min的N₂作为保护气体，然后在150℃条件下加热2h进行预处理。

或者，采用SPME萃取头替代上述挥发物收集装置中的吸附管5和大气采样器6，采用SPME萃取头收集柑橘幼青果的挥发物，采用SPME萃取头能够收集到比Porapak-Q吸附剂量更多的柑橘幼青果的挥发物，则SPME萃取头直接与气相色谱-质谱仪(GC-MS)的进样口连接实现用GC-MS进样和分析，SPME萃取头采用美国Sigma公司生产的SPME 50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，使用前根据说明书要求在GC-MS气相色谱-质谱仪的进样口270℃老化30分钟。

测试对柑橘大实蝇成虫具有作用的柑橘幼果挥发物的具体过程包括以下步骤：

步骤一、测试前准备：

味源瓶先后用蒸馏水、无水酒精、正己烷淋洗，随后放入200℃烘箱烘烤2小时进行预处理，然后采用Parafilm封口膜密封味源瓶瓶口后，再200mL/min的N₂气流持续通空气；

步骤二、挥发物收集：将500克海南省澄迈县福山镇的新鲜红江橙柑橘幼青果放置于步骤一中预处理后的味源瓶4中，味源瓶4的顶部与吸附管5连接，吸附管5中放置有Porapak-Q吸附剂，吸附管5通过连接管与大气采样器6连接，味源瓶4的底部还通过连接管依次连接有流量计3、活性炭过滤管2和空气泵1，打开空气泵1的气泵和大气采样器6，控制空气流速为500mL/min，大气采样器6以流量为500mL/min的速率进行连续抽气，此时吸附管5中的Porapak-Q吸附剂持续吸附柑橘幼青果的挥发物，抽气时间持续12小时，然后将吸附有挥发物的Porapak-Q吸附剂采用1毫升二氯甲烷洗脱，并在-20℃的条件下冻存保存；

或者，将500克新鲜柑橘幼青果放置于步骤一中预处理后的味源瓶4中，味源瓶4的顶部与固相微萃取SPME萃取头连接，味源瓶4的底部还通过连接管依次连接有流量计3、活性炭过滤管2和空气泵1，打开空气泵1的气泵，控制空气流速为200mL/min，此时SPME萃取头持续吸附柑橘幼青果的挥发物，吸附时间持续30分钟；

步骤三、挥发物成分检测和确定对柑橘大实蝇成虫具有行为反应的成分：在体式显微镜下使用显微剪切取柑橘大实蝇成虫(柑橘大实蝇成虫包括雌柑橘大实蝇成虫和雄柑橘大实蝇成虫)的触角，触角端部和触角芒不做任何处理，小心地将触角根部吸附到玻璃电极上，随后将玻璃电极插到电极固定器中，采用气相色谱-触角电位测试系统(GC-EAD)测试。采用GC-MS技术共鉴定出柑橘幼青果的挥发物27种，分别为：β-侧柏烯、桧烯、β-蒎烯、d-柠檬烯、γ-松油烯、β-石竹烯、α-蒎烯、β-肉桂油烯、α-水芹烯、萜品油烯、芳樟醇、(Z)-香芹醇、3-己醇、(E)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己-2-烯-1-醇、(2S,4R)-对薄荷-1(7),8-二烯-2-醇、α-松油醇、(2Z,6E)-金合欢醇、壬醛、癸醛、3-己酮、2-己酮、香芹酮、(S-3-甲基-6β-异丙烯-2-环己烯-1-酮、甲氧基苯肟、马鞭草烯酮、(E)-氧化柠檬烯、(Z)-氧化柠檬烯。其中对柑橘大实蝇成虫具有行为反应的挥发物仅为柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛；其中雄柑橘大实蝇成虫对柠檬烯、4-萜烯醇和柠檬醛均有作用，雌柑橘大实蝇成虫对柠檬烯和壬醛均有作用；

本实施例中，步骤三中采用气相色谱-触角电位测试系统(GC-EAD测试的条件为：GC柱温箱由40℃保持2min，随后以8℃/min升至260℃并维持5分钟。氮气以每分钟3毫升作为保护气体，进样口和探测器温度设置为250℃，空气流量为每分钟300毫升；色谱柱上加有Y-型分离装置(Agilent Technologies,USA)，Y-型分离装置按体积1:1的分离比将从气相色谱进样管出来的挥发物分离，一半待测物被送入触角电位仪中的触角测定活性，另一半待测物被送到气相色谱的FID检测。待上述触角连接良好，基线稳定，向色谱柱中注入3微升待测挥发物；整个实验重复4次；

本实施例中，还采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)鉴定柑橘青果挥发物：利用气相色谱-质谱联用仪对步骤三中柑橘青果的挥发物的27种成分：β-侧柏烯、桧烯、β-蒎烯、d-柠檬烯、γ-松油烯、β-石竹烯、α-蒎烯、β-肉桂油烯、α-水芹烯、萜品油烯、芳樟醇、(Z)-香芹醇、3-己醇、(E)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己-2-烯-1-醇、(2S,4R)-对薄荷-1(7),8-二烯-2-醇、α-松油醇、(2Z,6E)-金合欢醇、壬醛、癸醛、3-己酮、2-己酮、香芹酮、(S-3-甲基-6β-异丙烯-2-环己烯-1-酮、甲氧基苯肟、马鞭草烯酮、(E)-氧化柠檬烯、(Z)-氧化柠檬烯进行鉴定，气相色谱选用色谱TRACE 1310(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)分析，色谱柱为TR-5MS UI，色谱柱的尺寸为30m×0.25mm×0.25μm(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)，单四级质谱(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)由Xcalibur 2.2软件控制；设置后进样口温度250℃，前进样口温度260℃，采用不分流模式；载气为高纯氦气，高纯氦气的质量纯度为99.999％，载气流速为每分钟1mL，柱头压为1.45psi；起始色谱柱温度40℃保持2分钟，再以8℃/min升至260℃保持1分钟；

质谱条件：接口温度和离子源温度均为280℃，质量扫描范围45m/z～500m/z，扫描速率为5scans/s，离子化方式为EI，电子能量为70eV，发射电流为25μA。

经气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)鉴定，β-侧柏烯、桧烯、β-蒎烯、d-柠檬烯、γ-松油烯、β-石竹烯、α-蒎烯、β-肉桂油烯、α-水芹烯、萜品油烯、芳樟醇、(Z)-香芹醇、3-己醇、(E)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己-2-烯-1-醇、(2S,4R)-对薄荷-1(7),8-二烯-2-醇、α-松油醇、(2Z,6E)-金合欢醇、壬醛、癸醛、3-己酮、2-己酮、香芹酮、(S-3-甲基-6β-异丙烯-2-环己烯-1-酮、甲氧基苯肟、马鞭草烯酮、(E)-氧化柠檬烯、(Z)-氧化柠檬烯确实是柑橘青果的挥发物。

本实施例中，采用触角电位仪验证柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛对柑橘大实蝇成虫的行为反应。具体过程为：选择柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛的标准样品在同一根触角上重复测试3次，连续测试5根触角，测试的室内温度为23℃～27℃，湿度为60％RH～80％RH。测试结果表明：柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛确实对柑橘大实蝇成虫的行为反应，并且雄柑橘大实蝇成虫对柠檬烯、4-萜烯醇和柠檬醛均有作用，雌柑橘大实蝇成虫对柠檬烯和壬醛均有作用，实验证明了雄虫和雌虫的行为反应的挥发物存在差别。

同时还采用触角电位仪测量不同浓度柑橘挥发物活性物质对柑橘大实蝇成虫的EAG电生理反应；实验开始前，向触角电位仪通气2小时；选取羽化后性发育未成熟(羽化后1-5d，d表示天数)和性发育成熟(羽化后11-15d)的柑橘大实蝇成虫(柑橘大实蝇成虫包括雌成虫和雄成虫，触角处理方法参照步骤三；选定触角电位仪的Y-Ampl值为0.5mV，时间基线值为15s，触角电位中刺激空气气流为每分钟300mL，连续通气空气气流为每分钟600mL，每次测定的时间间隔为1分钟；以0.1μg/μL、1μg/μL、10μg/μL、100μg/μL挥发物活性物质标品柠檬烯、4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛为实验组。4-萜烯醇、壬醛和柠檬醛标品购买于阿拉丁(上海,中国)，柠檬烯标品购买于百灵威(北京,中国)。所述挥发物活性物质标品的制备方法为：用分析天平秤取一定量的标准样品放于1.8mL的气相色谱样品瓶中，用液体石蜡Sigma(Hamburg,Germany溶解，配置成100μg/μL浓度的样品母液，然后用梯度系列浓度稀释法配置10μg/μL，1μg/μL，和0.1μg/μL浓度的挥发物活性物质标品，样品都用色谱样品瓶保存于4℃，使用之前先在室温下平衡30分钟。

将10μL挥发物活性物质标品均匀滴在1cm×2.5cm“之”字型的滤纸条上进行EAG值的测定，并记录相应标品对应的EAG值，每个标品都在同一根触角上重复测试3次，对照液体石蜡油前后各测试1次，连续测试5根触角，室内环境条件为25±2℃，70±10％RH。

图2是本发明红江橙幼果挥发物的柑橘大实蝇雄成虫GC-EAD反应曲线，图3是本发明红江橙幼果挥发物的柑橘大实蝇雌成虫GC-EAD反应曲线，经气相色谱-质谱联用仪和触角点位耦合仪测定出对柑橘大实蝇雄成虫和柑橘大实蝇雌成虫具有触角反应的化合物，柑橘大实蝇雄成虫对柠檬烯、4-萜烯醇和柠檬醛均有作用，柑橘大实蝇雌成虫对柠檬烯和壬醛均有作用。

图4是雄柑橘大实蝇成虫(分为羽化后1-5d和羽化后11-15d雄柑橘大实蝇成虫)触角电位-剂量反应曲线，分别对柠檬烯、柠檬醛和4-萜烯醇的行为反应。图5是雌柑橘大实蝇成虫(分为羽化后1-5d和羽化后11-15d雌柑橘大实蝇成虫)触角电位-剂量反应曲线，分别对柠檬烯和壬醛的行为反应。通过对图4和图5的观察发现：雌雄柑橘大实蝇成虫及雌雄本身对柑橘挥发物的感应是不同的，通过EAG-剂量反应曲线发现，1微克到100微克的4种化合物都可以有效的激发触角电位反应，10微克和100微克可以最大程度的激发触角电位反应。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。