阅读说明：本技术 聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药及其抗肿瘤用途 (Polyethylene glycol modified cardiac glycoside compound prodrug and anti-tumor application thereof ) 是由 殷军 韩娜 李怡雯 叶纯 刘志惠 翟健秀 李嗣凯 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药及其制备方法,包含所述的化合物前药的药物组合物,及其它们在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的前药显著提高了原形药物的水溶性,解决了其给药困难的问题。体外细胞实验显示,该类前体药物具有良好的抑制肿瘤细胞生长的作用。体内药代动力学性质考察显示,该类前药能延长其体内半衰期。裸鼠体内药效评价显示,该类前体药物对裸鼠接种的人肺癌A549细胞株移植瘤具有良好的生长抑制作用,其抑制强度显著优于原形药物,具有更好的抗肿瘤效果。所述的前体药物的结构如下,其中,R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、R<Sub>3</Sub>、R<Sub>4</Sub>如权利要求和说明书所述。<Image he="282" wi="700" file="DDA0002213907250000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the technical field of medicines, and relates to a polyethylene glycol modified cardiac glycoside compound prodrug and a preparation method thereof, a pharmaceutical composition containing the compound prodrug, and application of the compound prodrug and the pharmaceutical composition in preparation of antitumor drugs. The above-mentionedThe prodrug remarkably improves the water solubility of the prototype drug and solves the problem of difficult administration. In vitro cell experiments show that the prodrug has good effect of inhibiting the growth of tumor cells. In vivo pharmacokinetic property investigation shows that the prodrug can prolong the in vivo half-life period. The evaluation of the drug effect in the body of a nude mouse shows that the prodrug has good growth inhibition effect on the transplanted tumor of a human lung cancer A549 cell strain inoculated by the nude mouse, the inhibition strength of the prodrug is obviously superior to that of an original drug, and the prodrug has better anti-tumor effect. The structure of the prodrug is shown in the specification, wherein R 1 、R 2 、R 3 、R 4 As described in the claims and specification.)

聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药及其抗肿瘤用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药及其制备和用途。具体涉及从暗消藤中分离得到的强心苷类化合物的聚乙二醇前药及其制备方法和抗肿瘤用途。

背景技术

强心苷(Cardiac glycoside)是存在于植物中具有强心作用的甾体苷类化合物。目前已知主要有十几个科几百种植物中含有强心苷，特别以玄参科、夹竹桃科植物最为普遍，其他如百合科、萝摩科、十字花科、卫矛科、豆科、桑科等亦较普遍。据统计，仅1976至1995年新发现的强心苷成分达250种以上(Liselotte K,et al.Phytochemistry,1998,48(1):1-29)，主要存在于植物的果、叶或根中。强心苷的结构比较复杂，由苷元(cardiacaglycone)与糖两部分构成。强心苷元C17位侧链为不饱和内酯环，有为五元环的Δ^αβ-γ-内酯，称为甲型强心苷元；也有为六元环的Δ^αβ,γδ-δ-内酯，称为乙型强心苷元，都属于β-构型(个别为α-型)(吴立军主编天然药物化学(第4版)人民卫生出版社2003，316)。

目前已有二、三十种强心苷应用于临床治疗，主要是用以治疗充血性心力衰竭及节律障碍等心脏疾患，如西地兰、地高辛、毛地黄毒苷等。但是随着对强心苷研究的不断深入，从20世纪60年代起，开始陆续出现了有关强心苷***的报道(Shiratori O.Gann,1967,58(6):521-528)，12年后首次出现了临床上应用强心苷***的报道StenkvistB,Bengtsson E,Eriksson O,et al.Lancet,1979,1(8115):563)。此后，许多研究证实强心苷对多种肿瘤细胞具有抗增殖和诱导凋亡作用，如乳腺癌、***癌、黑素瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、白血病、神经细胞瘤、肾脏腺癌等。

暗消藤[Streptocaulon juventas(Lour.)Merr.]隶属萝藦科(Asclepiadaceae)马莲鞍属(Streptocaulon)植物，主产于东南亚地区，我国主要分布在云南和广西两地，根据《药用植物辞典》中记载，其为一种民间用药，茎少用，根起补肾和强壮作用，根和茎均可以健脾胃，乳汁有去目翳的功效，用于结膜炎的治疗。

迄今，国内外已从暗消藤中分离鉴定出40多个强心苷类化合物且均具有不同程度的抗肿瘤活性。前期研究中，我们从暗消藤中分离得到了一系列体外抗癌活性强于阳性对照药紫杉醇、对机体基本无毒副作用、并且化学结构相对简单的强心苷类抗癌先导化合物，尽管这类化合物具有显著的抗肿瘤活性，但因为药物本身的特性，其临床应用受到了很大限制。首先，其水溶性和脂溶性都很差，无酸碱依赖性，无法制成水溶性的盐类应用于临床；其次，为了实现静脉给药，在药物溶解过程中加入了一些助溶剂，但这些助溶剂对血管刺激性较强、对正常组织器官有一定的毒副作用；最后，体内消除过快，半衰期只有5-10min左右，无法很好发挥药效。目前首先尝试了如调整剂注射剂pH值；更换助溶剂；增加增溶剂或混溶剂；制备环糊精包合物，乳剂或者纳米混悬剂等方法。由于受化合物物理性质等问题的限制，总的看来，这些制剂普遍存在稳定性差、稀释时析出结晶及代谢过快等问题，无法取代现行的以少量有机溶剂做助溶剂配置溶液的给药方式。其次又尝试过制备如磷酸酯、碳酸酯及苯甲酸酯等小分子前药，但因为强心苷碳酸酯类前药自身体内毒性过大，磷酸酯类等前药仅仅只能增大水溶性，该方法并未取得理想效果。因此，为了进一步提高该类药物的临床治疗价值，围绕改善溶解性，提高药物体内半衰期及靶向性提出了众多的解决方案。其中，尤以近年研究的将具有高水溶性、体内长循环、肿瘤靶向性的大分子载体与原形化合物结合制备高分子前药的战略格外引人注目。

高分子前药将药物分子通过化学键连接到高分子载体链上，本身不具备药物活性，但具有特定的功能性，如增溶、保护、靶向输送、增强细胞摄取、控制释放等，是目前较为先进的药物成药性改良方式之一。目前，应用较为广泛的高分子载体是聚乙二醇(PEG)及其衍生物。聚乙二醇(PEG)是具有高水溶性、低免疫原性以及高生物相容性的特点，在临床上被广泛用于***、冻干保护剂以及长循环修饰材料等，已成功应用于蛋白多肽药物修饰的人工合成高分子。

强心苷及其衍生物通过易解离的共价键与PEG偶联后，形成前体药物，进入机体或到达靶组织后，因体内的代谢或水解作用，结合状态的强心苷又被释放出来，而发挥抗癌作用。当将PEG偶联到药物分子时，由于引入了亲水基团，可改善它们在水溶液中的溶解度；由于聚乙二醇的分子很长，在其修饰的药物周围产生空间屏障，可减少药物的酶解提高半衰期，避免了药物在肾脏的代谢中同时还达到一种称为“被动靶向”(Passive targeting)给药的目的。

目前，可见关于用PEG修饰紫杉醇，喜树碱或者灯盏乙素等小分子化合物制备成前药的报道，但未见该方法于强心苷类化合物的应用。因此，用PEG及其衍生物对强心苷类化合物进行结构修饰，开发出水溶性好，药效高的药物是一个具有广泛应用前景、可有效改善原药不良性质的有效方法。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一系列聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药，所述的前药可以用于制备抗肿瘤药物。

具体地说，本发明是通过如下的技术方案而实现的：

本发明所述的聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药的结构至少包含以下通式中的一种：

其中，

R₁、R₂为H或OH；

R₃为A-X、

或葡萄糖或洋地黄糖或洋地黄毒糖或加拿***糖；

R₄为H或OH或OAc；

R₅为A-X；

A为直链或支链聚乙二醇，优选为直链的聚乙二醇片段，所用聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇，其末端为羟基，分子量为2000-40000，优选2000-20000，可以为2000、5000、20000，最优选5000；

X为连接臂，包括-(CH₂)₂-O-CO(CH₂)₂-CO-，-CH₂-CO-，-(CH₂)₂-O-CO-或-(CH₂)₂-O-aa-，aa为氨基酸，包括甘氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸和脯氨酸。

具体地，本发明所述的聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药的结构如下：

本发明还提供了聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药的制备方法，先将单甲氧基聚乙二醇的末端羟基通过连接臂进行活化，再与强心苷进行化学连接。几类典型聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药的制备方法如下：

A.在单甲氧基聚乙二醇末端羟基直接氧化成羧基，再与强心苷在缩合剂和有机碱催化作用下进行偶联反应，合成路线为：

B.在单甲氧基聚乙二醇末端羟基引入丁二酸酐，再与强心苷在缩合剂和有机碱催化作用下进行偶联反应，合成路线为：

C.在单甲氧基聚乙二醇末端羟基引入活性碳酸酯，再与强心苷在有机碱催化作用下进行酯交换反应，合成路线为：

D.在单甲氧基聚乙二醇末端羟基引入氨基酸，再与强心苷在缩合剂和有机碱催化作用下进行酯化反应，合成路线为：

其中，缩合剂为DCC、DIC、HBTU或EDC，最佳缩合剂为DCC和EDCI。

有机碱为DMAP、吡啶和三乙胺，优选三乙胺或DMAP。

反应溶剂为吡啶、DMF或DMAO中的一种与二氯甲烷的混合溶剂，最佳混合溶剂为二氯甲烷和DMF。

反应温度为0-40℃，最佳温度为0-25℃；反应时间为2-72小时，最佳反应时间为8-16小时。

以化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ(其中，强心苷为acovenosigenin A-β-glucoside以下简称TXA9；化合物Ⅰ为以-CH₂-CO-作为连接臂的强心苷类化合物前药；化合物Ⅱ为以-(CH₂)₂-O-CO(CH₂)₂-CO-作为连接臂的强心苷类化合物前药；化合物Ⅲ为以-(CH₂)₂-O-CO-作为连接臂的强心苷类化合物前药；化合物Ⅳ为以-(CH₂)₂-O-aa-作为连接臂的强心苷类化合物前药，其中aa为常见氨基酸，如甘氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，脯氨酸等)为例进一步说明各聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药的制备方法。

(1)化合物Ⅰ的制备方法

将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)末端羟基氧化成羧基后，再与TXA9在DCM/DMF的反应溶剂中和DCC、三乙胺的催化下反应制得化合物Ⅰ。

(2)化合物Ⅱ的制备方法

将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)与丁二酸酐反应后，再与TXA9在DCC、三乙胺催化下和DCM/DMF溶剂中反应制得化合物Ⅱ。

(3)化合物Ⅲ的制备方法

将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)与对硝基氯甲酸苯酯反应后，再与TXA9在DMAP催化下和DCM/DMF溶剂中反应制得化合物Ⅲ。

(4)化合物Ⅳ的制备方法

将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)与对硝基氯甲酸苯酯反应制得末端为活性碳酸酯的mPEG-pNP，再与氨基酸在碱性条件下发生酯交换反应制得mPEG-aa，最后氨基酸的末端羧基与强心苷类化合物的活性羟基在EDCI、DMAP催化下和DCM/DMF溶剂中发生酯化反应，制得化合物Ⅳ。

本发明进一步对化合物Ⅰ-Ⅳ的水溶性，按《中国药典》中溶解度实验项下的方法进行考察。测定结果表明，化合物Ⅰ-Ⅳ能够明显增加强心苷类化合物的水溶性，更易于制备成多种药物制剂，结果见表1。

对化合物Ⅰ-Ⅳ进行体外抗肿瘤活性实验，结果显示，该类前药对人***癌PC-3细胞、人***Hela细胞、人胃癌SGC7901细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌SMMC-7721细胞的生长均具有良好的抑制活性，且与原药的抑制肿瘤细胞生长活性相当，结果见表2。

对化合物Ⅰ-Ⅳ进行体内药代动力学性质的考察。结果显示，与原型药物相比，该类前药均能增加原药的血药浓度，延长其体内半衰期，其中，化合物Ⅱ显示出最长的体内半衰期和最高的药时曲线下面积，更利于增强药物的体内抗肿瘤药效，结果见图1和表3。

由于化合物Ⅱ在以上实验结果中，显示出最好的水溶性、最强的肿瘤细胞抑制作用和最长的体内半衰期，因此，对化合物Ⅱ进行裸鼠的体内抗肿瘤药效实验。实验结果(表4)显示，与TXA9组相比，化合物Ⅱ能够显著提高原药的体内抗肿瘤药效，并且化合物Ⅱ高剂量组的抑制强度与阳性药对照药紫杉醇相当，说明化合物Ⅱ对裸鼠接种的人源肺腺癌细胞株A549移植瘤具有良好的抑制肿瘤生长作用。

本发明还提供了一种药物组合物，包含所述的聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药和药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还提供了所述聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药和药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤为肺癌、胃癌、肝癌、子***、急性白血病、结肠癌、乳腺癌、肉瘤、鼻咽癌、卵巢癌、皮肤癌、***癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、肾脏肿瘤、直肠癌、口腔癌、食道癌、胆癌、胆道癌、胆管癌、胰腺癌、骨癌、喉癌、舌癌、胸腺癌、淋巴癌、恶性甲状腺肿瘤、脑肿瘤、中枢神经系统肿瘤、纵膈肿瘤、黑色素瘤。

本发明中，PEG具有较强的亲水基团及其能提高药物半衰期的优良特性，本发明利用PEG对来源于暗消藤的系列强心苷类抗癌活性化合物进行结构修饰，通过化学合成的方法制备了一系列强心苷类化合物前药，进而增加强心苷类化合物的水溶性，提高其体内半衰期，改善其药代动力学性质，进而增强其体内抗肿瘤药效。

附图说明

图1为化合物Ⅰ-Ⅳ进行体内药代动力学曲线。

具体实施方式

实施例1：化合物Ⅰ的制备

称取10g mPEG₅₀₀₀，1.56mg TEMPO，24mg KBr(摩尔比为10：0.05：1)15mL水溶解；另取8％NaClO溶液用4M的HCl调节pH至10。将上述溶液用冰浴调整至0℃后混合进行反应。整个反应过程中，保持反应温度为0℃，并用0.5M NaOH保持溶液pH为10。反应5h后，加入乙醇终止反应，用4M的HCl调节pH至3后用二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷层，并用饱和NaCl溶液洗涤，无水MgSO₄干燥4h，过滤除去干燥剂后将滤液浓缩至少量，缓慢加入到适量冰***中，4℃过夜析晶，抽滤，产物用无水***重结晶1次，真空干燥后称重，获得白色粉末即为mPEG₅₀₀₀-COOH产物。

准确称取上述产物1mmol，加入100mL甲苯溶解，120℃油浴加热回流2h，75℃减压蒸干溶剂，然后向圆底烧瓶中加入100mL无水二氯甲烷溶解后，精密称量DCC(2mmol)，TXA9(1.2mmol)，三乙胺(0.2mmol)，4mL DMF溶解后缓慢滴加入上述溶剂中，50℃反应12h后，加入3倍体积的水终止反应，用二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷层，并用饱和NaCl溶液洗涤，无水MgSO₄干燥4h，过滤除去干燥剂后将滤液浓缩至少量，缓慢加入到适量冰***中，4℃过夜析晶，抽滤，产物用无水***重结晶1次，真空干燥后称重，获得白色粉末即为化合物Ⅰ共3.50g，收率62.11％。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm)3.41(3H,s),3.66-3.69(br.s),4.18(2H,m),5.89(1H,s),5.00(1H,d,J＝18.0Hz),4.82(1H,d,J＝18.0),0.88(s),0.94(s)。

实施例2：化合物Ⅱ的制备

称取2mmol mPEG₅₀₀₀，加入200mL甲苯溶解，120℃油浴加热回流2h，75℃减压蒸干溶剂，然后向圆底烧瓶中加入150mL无水二氯甲烷溶解后，称取丁二酸酐(20mmol)，吡啶(0.4mmol)加入上述体系，将反应容器密闭后，37℃油浴搅拌反24h，经TLC检测(I₂显色)反应完毕后减压蒸干溶剂，加入饱和NaHCO₃溶解，用浓盐酸调节pH至2后用二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷层，并用饱和NaCl溶液洗涤，无水MgSO₄干燥4h，过滤除去干燥剂后将滤液浓缩至少量，缓慢加入到适量冰***中，4℃过夜析晶，抽滤，产物用无水***重结晶1次，真空干燥后称重，获得白色粉末即为产物。

准确称取上述产物1mmol，加入100mL甲苯溶解，120℃油浴加热回流2h，75℃减压蒸干溶剂，然后向圆底烧瓶中加入100mL无水二氯甲烷溶解后，精密称量DCC(2mmol)，TXA9(1.2mmol)，三乙胺(0.2mmol)，4mL DMF溶解后缓慢滴加入上述溶剂中，将反应容器密闭后，50℃反应12h后，加入3倍体积的水终止反应，用二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷层，并用饱和NaCl溶液洗涤，无水MgSO₄干燥4h，过滤除去干燥剂后将滤液浓缩至少量，缓慢加入到适量冰***中，4℃过夜析晶，抽滤，产物用无水***重结晶1次，真空干燥后称重，获得白色粉末即为化合物Ⅱ共3.26g，收率57.84％。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ3.38(3H,s),3.65(br.s),4.25(2H,m),5.87(1H,s),4.99(1H,d,J＝18.1Hz),4.81(1H,dd,J＝18.0，1.5Hz),0.89(s),0.93(s),4.31(1H,d,J＝7.6Hz),4.36(1H,d,J＝2.8Hz),4.02(1H,m)。

实施例3：化合物Ⅲ的制备

准确称取mPEG(1.00mmol)，对硝基氯甲酸苯酯(5.00mmol)，DMAP(2.00mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入60mL无水二氯甲烷，25℃反应12h。TLC检测反应完全，反应液依次用等体积的10％柠檬酸水溶液萃取3次，饱和氯化钠水溶液萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥4h，过滤并浓缩，硅胶柱层析纯化产物，得白色粉末状固体即mPEG-pNP，收率82％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.29(d,J＝9.2Hz,2H),7.40(d,J＝9.2Hz,2H),4.45-4.44(m,2H),3.82-3.81(m,2H),3.65(br.s),3.38(s,3H).

准确称取上述制备的mPEG-pNP(0.19mmol)，加入30mL甲苯，搅拌，115℃回流2h，72℃减压蒸干溶剂，用30mL无水二氯甲烷复溶并加入DMAP(0.22mmol)。准确称取化合物TXA9(0.24mmol)于5mL圆底烧瓶中，用1mL无水DMF使之溶解，缓慢滴加至反应体系中，25℃反应16h。TLC检测反应完全，反应液用蒸馏水萃取5次，10％柠檬酸水溶液萃取3次，饱和氯化钠水溶液萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，无水***析出产物，抽滤，得白色粉末状固体，即化合物Ⅲ，收率86％。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ5.88(s,1H),4.99(d,J＝18.1Hz,1H),4.81(d,J＝18.3Hz,1H),4.78(d,J＝9.5Hz,1H),4.71(t,J＝9.6Hz,1H),4.44-4.31(m,4H),4.04(d,J＝18.4Hz,1H),3.85(dd,J＝16.2,4.2Hz,1H),3.73-3.72(m,4H),3.65(br.s),3.38(s,3H),3.13-3.08(m,4H),0.94-0.93(m,3H),0.87(s,3H).

实施例4：化合物Ⅳ的制备

准确称取mPEG-pNP(0.77mmol)，甘氨酸(5.81mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入60mL2/3乙腈水，搅拌，待反应物完全溶解后，加入0.52mL三乙胺(3.74mmol)，25℃反应5h。TLC检测反应完全，用稀盐酸调pH至2，适量水稀释反应液，用等体积***萃取3次，二氯甲烷萃取5次，合并有机层，无水硫酸钠干燥4h，过滤，浓缩至少量，无水***析出产物，抽滤，得白色粉末状固体，即得mPEG-Gly，收率89％。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ5.60(s,1H),4.25–4.24(m,2H),3.97–3.96(m,2H),3.65(br.s),3.38(s,3H),3.11(qd,J＝7.3,4.9Hz,2H).

准确称取上述制备的mPEG-Gly(0.20mmol)，EDCI(0.42mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL无水二氯甲烷，搅拌，溶解后于0℃反应30min。准确称取TXA9(0.24mmol)，用1mL无水DMF溶解后，缓慢滴加至反应体系中，另加DMAP(0.16mmol)，撤去冰浴，25℃反应16h。TLC检测产物不再增加，反应液用蒸馏水萃取5次，10％柠檬酸水溶液萃取3次，饱和氯化钠水溶液萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，无水***析出产物，抽滤，得白色粉末状固体，即化合物Ⅳ，收率88％。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ5.88(s,1H),5.60–5.59(m,1H),5.03(d,J＝9.4Hz,1H),4.99(d,J＝18.5Hz,1H),4.92–4.87(m,1H),4.81(dd,J＝18.2,1.6Hz,1H),4.43–4.31(m,2H),4.24(d,J＝4.8Hz,2H),4.07–4.03(m,1H),4.01(dd,J＝14.1,6.0Hz,2H),3.88(dd,J＝12.2,4.1Hz,1H),3.65(br.s),3.38(s,3H),2.84–2.77(m,4H),0.94–0.93(m,3H),0.88–0.87(m,3H).

实施例5：化合物Ⅰ-Ⅳ水溶性测定

按《中国药典》中溶解度实验项下的方法，分别精密称取一定量研成细粉的化合物Ⅰ-Ⅳ，于25±2℃分批加入一定量的生理盐水，每隔5min强力振摇30s，观察30min内溶解情况，以目视无可见的溶质颗粒，视为完全溶解。记录使药物细粉完全溶解的生理盐水体积，计算化合物Ⅰ-Ⅳ在水中的溶解度。

TXA9水溶性的测定方法为：取研成细粉的TXA9一定量，置于磨口试管中，加入定量的生理盐水，配成TXA9过饱和溶液，置于37℃恒温振荡器(180转/分钟)内振荡24h，12000rpm离心15min后取上清，过0.45μm水膜，用HPLC检测，记录峰面积，计算TXA9在水中的溶解度。

实验结果见表1。结果表明，与原药TXA9相比，化合物Ⅰ-Ⅳ的水溶性提高了139-291倍，说明化合物Ⅰ-Ⅳ能够显著增加TXA9的水溶性，更易于制备成多种药物制剂。

表1化合物Ⅰ-Ⅳ水溶性测定结果

^*化合物的水溶性与TXA9水溶性的比值

实施例6：化合物Ⅰ-Ⅳ对肿瘤细胞的生长抑制活性测定

本实验考察了化合物Ⅰ-Ⅳ对人***癌PC-3细胞、人***Hela细胞、人胃癌SGC7901细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌SMMC-7721五种肿瘤细胞的生长抑制作用。选用对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的培养基配成5×10⁴/mL的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔100μl，37℃，5％CO₂培养24h。实验组更换新的含不同浓度化合物Ⅰ-Ⅳ的培养液，对照组则更换含等体积溶剂的培养液，每组设3个平行孔，37℃，5％CO₂培养48h。弃去上清液，用PBS小心洗2次，每孔加入100μl新鲜配制的含0.5mg/ml MTT的培养基，37℃继续培养4h。小心弃去上清，并加入150μl DMSO，用微型振荡器混匀10min后，用酶标仪在492nm处测定光密度值。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：

从而求出样品的半数抑制浓度(IC₅₀)。

体外抗肿瘤细胞实验结果见表2，结果表明化合物Ⅰ-Ⅳ具有良好的抑制肿瘤细胞生长的活性，且与TXA9的抑制作用相当。

表2化合物Ⅰ-Ⅳ对五种肿瘤细胞的IC₅₀值(nM，TXA9当量)

实施例7：化合物Ⅰ-Ⅳ的体内药代动力学考察

取30只大鼠，随机分为5组，分别通过尾静脉单剂量注射给予TXA9(5mg/kg)，化合物Ⅰ-Ⅳ(5mg/kg TXA9当量)，于给药后5min、15min、30min、1h和1.5h取血0.5mL，血样离心取血浆后，用甲醇沉淀血浆蛋白，离心取上清，用HPLC测定血浆中TXA9含量，绘制药时曲线，结果见图1，用PKSolver软件计算药代动力学参数，结果见表3。实验结果显示，与原形药物TXA9相比，化合物Ⅰ-Ⅳ均能增加TXA9的血药浓度，延长其体内半衰期，其中，化合物Ⅱ显示出最长的体内半衰期和最高的药时曲线下面积，更利于增强药物的体内抗肿瘤药效。

表3化合物TXA9与化合物Ⅰ-Ⅳ的体内药代动力学参数

与化合物TXA9组相比，^**p<0.01,^***p<0.001。

实施例8：化合物Ⅱ的体内抗肿瘤药效学实验

由于化合物Ⅱ在以上实验结果中，显示出最强的肿瘤细胞生长抑制作用和最好的体内药代动力学性质，因此，对化合物Ⅱ进行裸鼠的体内抗肿瘤药效实验。相比于其他细胞系，A549细胞对TXA9及其前药的敏感性最高，故选用此细胞进行体内抗肿瘤实验。

将人肺癌A549细胞按照1×10⁸cells/mL的浓度处理，取50只裸鼠，每只鼠腋窝皮下接种0.2mL。10天后，肿瘤平均体积大于100mm³，随机分5组：模型组、紫杉醇阳性药组(7.5mg/kg)、TXA9组(15mg/kg)、化合物Ⅱ低剂量组(15mg/kg TXA9当量)、化合物Ⅱ高剂量组(37.5mg/kg TXA9当量)，连续给药28天，观察肿瘤生长情况，计算抑瘤率。

对化合物Ⅱ进行裸鼠的体内抗肿瘤药效实验结果(表4)显示，与原药TXA9(抑瘤率33％)相比，化合物Ⅱ的抑瘤率可达54％(低剂量组)和69％(高剂量组)，说明化合物Ⅱ能够显著提高原药的体内抗肿瘤药效；此外，其高剂量组与阳性对照紫杉醇的抑瘤率(68％)相当，说明化合物Ⅱ对裸鼠接种的人源肺腺癌细胞株A549移植瘤具有良好的抑制肿瘤生长作用。

表4化合物Ⅱ的体内抗肿瘤药效实验结果