阅读说明：本技术 Peg-亮丙瑞林缀合物及其制备方法 (PEG-leuprorelin conjugate and preparation method thereof ) 是由 张拥军 付免 关英 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种新的PEG-亮丙瑞林缀合物及其制备方法,所述方法包括,将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺活泼酯直接与未进行保护的亮丙瑞林反应,得到亮丙瑞林2-位组氨酸上咪唑基修饰的PEG-亮丙瑞林缀合物。该缀合物既保留亮丙瑞林活性,同时半衰期延长,血浆清除率降低,药代动力学性能改善。(The invention provides a novel PEG-leuprorelin conjugate and a preparation method thereof, wherein the method comprises the step of directly reacting monomethoxy polyethylene glycol succinimide active ester with unprotected leuprorelin to obtain the PEG-leuprorelin conjugate modified by an imidazolyl group on leuprorelin 2-histidine. The conjugate not only retains the activity of the leuprorelin, but also has prolonged half-life, reduced clearance rate of blood plasma and improved pharmacokinetic performance.)

PEG-亮丙瑞林缀合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及PEG-亮丙瑞林缀合物及其合成方法。

背景技术

亮丙瑞林是由九个氨基酸组成的多肽，其氨基酸序列为： GLP-HIS-TRP-SER-TYR-DLEU-LEU-ARG-PRO-NHET，是一种人工合成的***释放激素(GnRH，又名促黄体激素释放激素，LHRH)类似物，其活性远高于天然的GnRH。短期使用时，由于其对***释放激素受体的激动作用，可促进垂体分泌***，睾丸或卵巢分泌甾体激素。长期使用时，由于受体下调作用的影响，***的分泌被抑制，进而抑制生殖器官分泌甾体激素。因此，临床上亮丙瑞林被用于治疗或缓解多种激素依赖性疾病包括：***癌、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、性早熟等。

作为多肽药物，亮丙瑞林的缺点是易被体内的酶降解，半衰期短。已有一些技术被开发来延长其作用时间。例如缓控释微球注射液，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球包裹亮丙瑞林，已在临床上得到应用。但存在注射疼痛感强、突释、炎症反应等问题。Bayer研发了以渗透压变化驱动的皮下植入装置，实现了亮丙瑞林的缓释，并进行了临床试验。但由于成本过高而终止了该项目的研究。文献(Journal of Controlled Release,2014,185,62-70)公开了以去水山梨糖醇单油酸酯液晶为药物载体实现亮丙瑞林缓释的技术。文献(Journal of Controlled Release,2015,205,98-108)则公开了通过4位丝氨酸的羟基残基将亮丙瑞林缀合到聚合物胶束上，从而延长药物半衰期的技术。

PEG化是一种改善治疗性药物特别是多肽/蛋白药代动力学性质的常用方法。聚乙二醇 (PEG)是一种水溶性聚合物，化学性质稳定，无抗原性，毒性小，生物相容性好，并已通过 FDA认证。多肽/蛋白质与PEG的缀合可增加药物分子量，降低其肾清除率，保护其免受蛋白水解酶降解，从而增加其稳定性并延长其循环半衰期。此外，PEG化还可降低其免疫原性和抗原性。

亮丙瑞林的氨基端和羧基端都已封端，而且结构中也没有氨基、巯基等常见的修饰基团，因此亮丙瑞林的PEG化修饰相对困难，研究较少。目前仅见中国专利CN105237762B公开了一种制备PEG化亮丙瑞林的技术。该技术先将亮丙瑞林进行保护，然后与PEG活性酯进行偶联，最后再去保护得到以4位丝氨酸的羟基为PEG化位点的PEG化亮丙瑞林。由于合成步骤多，损失大。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的PEG-亮丙瑞林缀合物及其合成方法，既能保持亮丙瑞林的活性，又延长了半衰期，同时操作简便，易于商品化。

本发明提供一种新的PEG-亮丙瑞林缀合物，具有式I或式II的结构：

其中x为10～1300的整数值，y为0，0.5，1～5的整数值。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺活泼酯 (CH₃O-(CH₂CH₂O)_x-(CH₂CH₂)_y-NHS)与亮丙瑞林(LEU)直接反应，得到亮丙瑞林2-位组氨酸上咪唑基单一位点修饰的PEG-亮丙瑞林缀合物(I或II)。

其中，所述亮丙瑞林包括亮丙瑞林和醋酸亮丙瑞林。

其中，所述单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺活泼酯的结构为

x为10～1300的整数值，聚乙二醇的结构包括线性结构和支化结构，分子量在400-60KDa；y为1～5的整数值，还包括单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺的碳酸酯、乙酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、戊酸酯等。

其中，反应所用溶剂为pH5.5～6.0的蒸馏水。

其中，亮丙瑞林与单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺活泼酯的摩尔比为1:1～1:8，优选1:1～1:5。

其中，反应温度为4～50℃，优选为10～40℃。

其中，反应时间为1～24h，优选为4～10h。

本发明提供的PEG-亮丙瑞林缀合物在药物释放领域中的应用。

本发明的有益效果

本发明提供一种新的PEG-亮丙瑞林缀合物及其合成方法。首先，本发明得到的以2-位组氨酸上咪唑基为PEG化位点的PEG-亮丙瑞林缀合物，与现有技术以4位丝氨酸的羟基为PEG 化位点得到的PEG化亮丙瑞林在结构上不同。其次，本发明提出的合成方法不需对亮丙瑞林进行保护，因此没有保护和去保护的步骤，合成路线短，损失小，高效简便，易于商品化。

以亮丙瑞林为对照，用本发明制备的PEG-亮丙瑞林缀合物在大鼠体内做药代动力学研究，结果见表1。下表的数据表明，与亮丙瑞林相比，PEG-亮丙瑞林缀合物的半衰期延长，尤其 PEG5K-LEU的半衰期比亮丙瑞林的半衰期延长了3倍。与亮丙瑞林相比，PEG-亮丙瑞林缀合物的药时曲线下面积都增大5倍，药物吸收情况显著改善；同时其血浆清除率明显下降，比亮丙瑞林的血浆清除率降低了80％，显著改善了亮丙瑞林的药代动力学性质。

表1亮丙瑞林及PEG-亮丙瑞林缀合物的药代动力学参数表

注：t_1/2为药物半衰期，C_max为峰浓度，T_max为达峰时间，AUC_last为药时曲线下面积(反映药物吸收情况)，Cl_F为血浆清除率。

附图说明

图1.分别为实施例1和2制备的PEG-亮丙瑞林缀合物PEG2K-LEU和PEG5K-LEU的MALDI-TOF质谱图。分子量分别为3235.6和6144.2。两种PEG-亮丙瑞林缀合物的分子量都正好是亮丙瑞林和PEG分子量之和，表明每个亮丙瑞林分子上只接了1个PEG链。

图2.分别为亮丙瑞林、实施例1和2制备的PEG-亮丙瑞林缀合物的¹H NMR谱图，表明PEG链段连接在亮丙瑞林2-位组氨酸的咪唑基上。

图3.亮丙瑞林及PEG-亮丙瑞林缀合物的大鼠体内药代动力学曲线。

图4.每日注射亮丙瑞林或PEG-亮丙瑞林缀合物的雄性SD大鼠血液睾酮浓度变化。

具体实施方式

本发明提供一种新的PEG-亮丙瑞林缀合物及其合成方法，通过将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺活泼酯与未保护的亮丙瑞林直接反应，得到亮丙瑞林2-位组氨酸上咪唑基修饰的PEG- 亮丙瑞林缀合物(I或II)，反应式见下图：

本发明中，所述亮丙瑞林包括亮丙瑞林和醋酸亮丙瑞林。所述单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺活泼酯的结构为CH₃O-(CH₂CH₂O)x-(CH₂CH₂)y-NHS；x为10～1300的整数值，聚乙二醇的结构包括线性结构和支化结构，分子量在400-60KDa；y为0，0.5，1～5的整数值，包括单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺的碳酸酯、乙酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、戊酸酯等。所述反应中亮丙瑞林与单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺活泼酯的摩尔比为1:1～1:8，优选1:1～1:5。

反应实施的条件包括：溶剂为pH5.5～6.0的蒸馏水；反应温度为4～50℃，优选为10～40℃；反应时间为1～24h，优选为4～15h。

本发明提供的PEG-亮丙瑞林缀合物在药物释放领域中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

PEG-亮丙瑞林缀合物(PEG2K-LEU)的制备：

12.6mg(0.01mmol)醋酸亮丙瑞林溶于5mL蒸馏水中，加入等摩尔量的 CH₃O-(CH₂CH₂O)₄₅-CH₂CH₂-NHS，37℃反应4h后，阳离子交换色谱纯化，纯化条件：20mM pH 6.5PBS,氯化钠梯度：0-0.5M,收集目标峰透析，冻干得到PEG2K-LEU。MALDI-TOF质谱检测显示分子量为3235.6，正好等于亮丙瑞林和PEG的分子量之和，表明每个亮丙瑞林分子上只接了1个PEG链(图1)。将PEG2K-LEU溶于氘代水，做¹H NMR谱(图2)；与亮丙瑞林相比，咪唑基上氢的化学位移向高场移动，表明PEG链段连接在亮丙瑞林2-位组氨酸的咪唑基上。

实施例2

PEG-亮丙瑞林缀合物(PEG5K-LEU)的制备：

12.6mg(0.01mmol)醋酸亮丙瑞林溶于5mL蒸馏水中，加入等摩尔量的 CH₃O-(CH₂CH₂O)₁₁₀-CH₂CH₂-NHS，37℃反应6h后，阳离子交换色谱纯化，纯化条件：20mM pH6.5PBS,氯化钠梯度：0-0.5M,收集目标峰透析，冻干得到PEG5K-LEU。MALDI-TOF质谱检测显示分子量为6144.2，正好等于亮丙瑞林和PEG的分子量之和，表明每个亮丙瑞林分子上只接了1个PEG链(图1)。将PEG5K-LEU溶于氘代水，做¹H NMR谱(图2)；与亮丙瑞林相比，咪唑基上氢的化学位移向高场移动，表明PEG链段连接在亮丙瑞林2-位组氨酸的咪唑基上。

实施例3

PEG-亮丙瑞林缀合物(PEG10K-LEU)的制备：

12.6mg(0.01mmol)醋酸亮丙瑞林溶于5mL蒸馏水中，加入等摩尔量的 CH₃O-(CH₂CH₂O)₂₂₅-CH₂CH₂-NHS，40℃反应12h后，阳离子交换色谱纯化，纯化条件：20mM pH6.5PBS,氯化钠梯度：0-1M,收集目标峰透析，冻干得到PEG20K-LEU。MALDI-TOF质谱检测显示分子量为11170.5，正好等于亮丙瑞林和PEG的分子量之和，表明每个亮丙瑞林分子上只接了1个PEG链。将PEG10K-LEU溶于氘代水，做¹H NMR谱；与亮丙瑞林相比，咪唑基上氢的化学位移向高场移动，表明PEG链段连接在亮丙瑞林2-位组氨酸的咪唑基上。

实施例4

PEG-亮丙瑞林缀合物(PEG5K0-LEU)的制备：

12.6mg(0.01mmol)醋酸亮丙瑞林溶于5mL蒸馏水中，加入3倍摩尔量的 CH₃O-(CH₂CH₂O)₁₁₀-NHS，25℃反应15h后，阳离子交换色谱纯化，纯化条件：20mM pH 6.5 PBS,氯化钠梯度：0-0.5M,收集目标峰低温透析，冻干得到PEG5K0-LEU。MALDI-TOF质谱检测显示分子量为6113.2，正好等于亮丙瑞林和PEG的分子量之和，表明每个亮丙瑞林分子上只接了1个PEG链；将PEG5K0-LEU溶于氘代水，做¹H NMR谱。与亮丙瑞林相比，咪唑基上氢的化学位移向高场移动，表明PEG链段连接在亮丙瑞林2-位组氨酸的咪唑基上。

实施例5

PEG-亮丙瑞林缀合物(PEG2K-LEU)的制备：

12.1mg(0.01mmol)亮丙瑞林溶于5mL蒸馏水中，加入等摩尔量的 CH₃O-(CH₂CH₂O)₄₅-NHS，25℃反应8h后，阳离子交换色谱纯化，纯化条件：20mM pH 6.5PBS, 氯化钠梯度：0-0.5M,收集目标峰透析，冻干得到PEG2K-LEU。MALDI-TOF质谱检测显示分子量为3202.2，正好等于亮丙瑞林和PEG的分子量之和，表明每个亮丙瑞林分子上只接了1 个PEG链；将PEG5K0-LEU溶于氘代水，做¹H NMR谱。与亮丙瑞林相比，咪唑基上氢的化学位移向高场移动，表明PEG链段连接在亮丙瑞林2-位组氨酸的咪唑基上。

实施例6

PEG-亮丙瑞林缀合物(PEG2K2-LEU)的制备：

12.6mg(0.01mmol)醋酸亮丙瑞林溶于5mL蒸馏水中，加入8倍摩尔量的 CH₃O-(CH₂CH₂O)₄₅-(CH₂CH₂)₂-NHS，4℃反应20h后，阳离子交换色谱纯化，纯化条件：20mM pH6.5PBS,氯化钠梯度：0-0.5M,收集目标峰透析，冻干得到PEG2K2-LEU。MALDI-TOF质谱检测显示分子量为3266.5，正好等于亮丙瑞林和PEG的分子量之和，表明每个亮丙瑞林分子上只接了1个PEG链；将PEG2K2-LEU溶于氘代水，做¹H NMR谱。与亮丙瑞林相比，咪唑基上氢的化学位移向高场移动，表明PEG链段连接在亮丙瑞林2-位组氨酸的咪唑基上。

实施例7

PEG-亮丙瑞林缀合物在大鼠体内药代动力学研究

15只SD大鼠(体重300g左右)随机分为三组，一组皮下注射醋酸亮丙瑞林(剂量1mg/kg) 作为对照组，其余两组分别按照等摩尔剂量注射PEG-亮丙瑞林缀合物，于不同时间0，0.3， 0.6，1，2，4，6，8，10h眼底静脉丛取血0.5mL，离心取血清，采用LC-MS/MS方法检测血清中的药物浓度。结果如图3所示。非房室模型计算药代动力学参数后，结果如表1所示。亮丙瑞林的半衰期为0.43±0.06h，本发明制备的PEG-亮丙瑞林缀合物的半衰期分别为0.59±0.023h(PEG2K-LEU)和1.51±0.127h(PEG5K-LEU)，尤其PEG5K-LEU的半衰期比亮丙瑞林的半衰期延长了3倍。与亮丙瑞林相比，PEG-亮丙瑞林缀合物的药时曲线下面积都增大5倍，表明药物吸收情况显著改善；同时PEG-亮丙瑞林缀合物的血浆清除率明显下降，比亮丙瑞林的血浆清除率降低了80％，显著改善了亮丙瑞林的药代动力学性质。

实施例8

PEG-亮丙瑞林缀合物的生物活性研究

20只SD大鼠(体重300g左右)随机分为四组，对照组每日皮下注射生理盐水，实验组每日皮下注射醋酸亮丙瑞林或PEG-亮丙瑞林缀合物(PEG2K-LEU或PEG5K-LEU)，剂量0.1mg/kg(按亮丙瑞林计量)。)于不同时间0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12， 13，14，15天眼底静脉丛取血，放射免疫法测定睾酮浓度。结果如图4所示。与空白组相比，注射PEG-亮丙瑞林缀合物和亮丙瑞林的实验组，大鼠血浆中的睾酮含量接近，在15天的时间里，二者无明显差别。表明PEG-亮丙瑞林缀合物保持亮丙瑞林的生物活性，能有效降低睾酮浓度。

由上述实施例可知，本发明提供一种新的PEG-亮丙瑞林缀合物及其合成方法。通过将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺活泼酯与未保护的亮丙瑞林直接反应，得到亮丙瑞林2-位组氨酸上咪唑基修饰的PEG-亮丙瑞林缀合物，具有式I或式II的化学结构。本发明提供的PEG-亮丙瑞林缀合物保持亮丙瑞林的生物活性，能有效降低睾酮浓度，延长半衰期，降低血浆清除率，显著改善了亮丙瑞林的药代动力学性质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。