阅读说明：本技术 一种双重敏感型聚合物-药物连接物及其制备方法和应用 (Dual-sensitive polymer-drug conjugate and preparation method and application thereof ) 是由 陈立江 王惊雷 宋柯 宋立强 石金燕 褚宇琦 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种双重敏感型聚合物-药物连接物及其制备方法和应用,属于高分子化学领域及药物制剂领域。将酶敏感底物制成酶敏感底物中间体；再将药物与胱胺二盐酸盐制备成含二硫键的药物衍生物；然后将酶敏感底物中间体与药物衍生物连接制备成双重敏感的药物衍生物；最后将聚乙二醇单甲醚与药物衍生物缩合为谷胱甘肽还原敏感及组织蛋白酶B敏感的双重敏感型聚合物-药物连接物。其在水中能自组装成两亲性聚合物胶束,连接键为二硫键和二肽,可在肿瘤部位响应性断裂,释放出药物。本发明还公开了mPEG-VC-SS-GA共聚物的制备方法及其作为抗癌药物载体的用途。(The invention discloses a double-sensitive polymer-drug conjugate and a preparation method and application thereof, belonging to the fields of high-molecular chemistry and pharmaceutical preparations. Preparing an enzyme sensitive substrate into an enzyme sensitive substrate intermediate; then preparing the drug and cystamine dihydrochloride into a drug derivative containing disulfide bonds; then connecting the enzyme sensitive substrate intermediate with the drug derivative to prepare the dual sensitive drug derivative; finally, polyethylene glycol monomethyl ether and the drug derivative are condensed into the dual sensitive polymer-drug conjugate which is sensitive to glutathione reduction and sensitive to cathepsin B. The amphiphilic polymer micelle can be self-assembled into an amphiphilic polymer micelle in water, and a connecting bond is a disulfide bond and a dipeptide, so that the amphiphilic polymer micelle can be broken in response at a tumor part to release a medicament. The invention also discloses a preparation method of the mPEG-VC-SS-GA copolymer and application of the mPEG-VC-SS-GA copolymer as an anticancer drug carrier.)

一种双重敏感型聚合物-药物连接物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域与高分子化学领域，具体涉及一种具有谷胱甘肽还原敏感及组织蛋白酶B敏感的双重敏感型聚合物-药物连接物及其制备方法和应用。

背景内容

20世纪70年代，有研究者提出将水溶性聚合物与化疗药物共价结合的想法。随着合成和聚合物的发展，它逐渐成为了一个快速发展的领域，这种结合物在20世纪90年代开始进入临床，如聚(L-谷氨酸)-紫杉醇共聚物。抗肿瘤药物大多为难溶性药物，如紫杉醇、喜树碱、索拉菲尼等，较差的水溶性限制了这些抗肿瘤药物的生物利用度，而纳米载药系统可以提高水溶性、增加生物利用度。其他的一些结合物也处于研发阶段，如以聚乙二醇为载体的聚乙二醇-喜树碱。聚乙二醇是经过FDA批准的亲水性聚合物，毒性和免疫原性较低，但事实却是在肿瘤部位，聚乙二醇连接物可能难以断裂释放出药物，导致抗癌效果明显下降。目前正在迅速发展的肿瘤微环境敏感的药物传递系统，可以响应性释放出药物，为克服化疗药物的低溶解性和部位特异性传递的障碍提供一种新的策略。

藤黄酸(Gambogic Acid,GA,C₃₈H₄₄O₈)是一种中药藤黄中的提取物，是具抗肿瘤作用的主要活性化合物之一，其应用已有数千年的历史。研究表明，在许多癌症类型中GA均具有抗癌作用，如***癌、肝癌、乳腺癌等，并且研究认为其毒性是可以接受的，近年来成为了天然产物抗肿瘤研究的热点。但由于其水溶性差、药效不显著、选择性低，限制了目前其抗肿瘤的临床研究。

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是人体内自然存在的三肽，在肿瘤组织及细胞溶酶体中谷胱甘肽的浓度(约为2-10mM)远高于细胞外液中谷胱甘肽的浓度(约为2-20uM)。由于肿瘤细胞中GSH含量高，常会对化疗产生耐药性，一些研究人员利用如丁硫氨酸硫酸亚胺(BSO)等消耗GSH药物，期望降低GSH的含量。但BSO的作用有限，没有针对性，会降低正常细胞GSH含量，从而加重放化疗带来的副作用。而肿瘤部位高浓度的谷胱甘肽可以还原二硫键，且正常组织及血管中谷胱甘肽浓度低使得二硫键可以稳定存在。另外高浓度的谷胱甘肽在还原二硫键后自身也会被氧化，从而被消耗掉。

组织蛋白酶B是一种半胱氨酸蛋白酶，是一种分子量为30kDA的肽链内切酶，其存在于各种动物组织的细胞内，特别是在溶酶体中，但在正常细胞外环境中未见组织蛋白酶B表达。在一些特殊的病理条件下，如类风湿性关节炎或者肿瘤部位，可见组织蛋白酶B的高表达，尤其在多种肿瘤部位。肿瘤细胞过度分泌组织蛋白酶B以帮助其转移、侵袭，如分解高密度的胶原网络。组织蛋白酶B的一般底物包括缬氨酸-瓜氨酸和苯丙氨酸-精氨酸。根据相关研究报道，一些以酶敏感小分子肽片段为连接剂的抗体药物结合物在肿瘤组织中表现出有效的药物释放。

据此，研发多种生物敏感型聚合物-药物结合物在靶向肿瘤治疗中具有很光明的前景和现实的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种谷胱甘肽还原敏感及组织蛋白酶B敏感的双重敏感型聚合物-药物连接物，将聚乙二醇单甲醚与难溶性药物通过共价键连接到二硫键与一段组织蛋白酶B底物上，提高难溶性药物的水溶性，同时由于肿瘤组织及肿瘤细胞内还原性谷胱甘肽和组织蛋白酶B高含量，可以断裂二硫键和底物的共价键，可以起到靶向肿瘤组织的作用，还可以减少对正常细胞的毒副作用。

本发明采用的技术方案为：一种双重敏感型聚合物-药物连接物，所述双重敏感型聚合物-药物连接物为谷胱甘肽还原敏感及组织蛋白酶B敏感的双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-Y-SS-R。

其中，Y为缬氨酸-瓜氨酸，构成双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-VC-SS-R，具有如(Ⅰ)所示的结构式：

或，Y为苯丙氨酸-精氨酸，构成双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-PA-SS-R，具有如(Ⅱ)所示的结构式：

上述结构式(Ⅰ)和结构式(Ⅱ)中，X部分指代为氧化还原敏感片段二硫键；Y部分指代为组织蛋白酶B底物片段缬氨酸-瓜氨酸或苯丙氨酸-精氨酸；R为带有羧基的药物化合物。

优选的，所述带有羧基的药物化合物选自藤黄酸、大黄酸、缬沙坦、甲氨蝶呤、醋酸艾塞那肽、IDN-6556、AGI-1067、偶氮丝氨酸、氯苯丙氨酸、N–乙酰–L–苯丙氨酸和N–乙酰–L–缬氨酸。

更优选的，所述Y为缬氨酸-瓜氨酸，所述带有羧基的药物化合物为藤黄酸，构成谷胱甘肽还原敏感及组织蛋白酶B敏感的双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-VC-SS-GA，具有如(Ⅲ)所示的结构式：

其中，X部分指代为氧化还原敏感片段二硫键；Y部分指代为组织蛋白酶B底物片段缬氨酸-瓜氨酸；R部分为藤黄酸。

优选的，mPEG规格为聚乙二醇单甲醚mPEG5000。

一种双重敏感型聚合物-药物连接物制备方法，包括如下步骤：1)将酶敏感底物与Fmoc连接制成酶敏感底物中间体；2)将带有羧基的药物化合物R与胱胺二盐酸盐制备成含二硫键的药物衍生物R-胱胺；3)将酶敏感底物中间体与含二硫键的药物衍生物R-胱胺连接制备成双重敏感的药物衍生物；4)将聚乙二醇单甲醚与双重敏感的药物衍生物缩合为谷胱甘肽还原敏感及组织蛋白酶B敏感的双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-Y-SS-R。

优选的，上述双重敏感型聚合物-药物连接物制备方法，Y为缬氨酸-瓜氨酸，构成双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-VC-SS-R，包括如下步骤：

1)酶敏感底物中间体Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸(Fmoc-Val-Cit)的合成：

1.1)将Fmoc-Val(N-(9-芴甲氧羰基)-L-缬氨酸)，HOSu(N-羟基丁二酰亚胺)，DCC(N,N′-二环己基碳二亚胺)在0℃下共溶于四氢呋喃中，搅拌24h后过滤，减压旋蒸，得白色固体产物Fmoc-Val-OSu；

1.2)将Cit(瓜氨酸)与NaHCO₃共溶于蒸馏水中，冷却至0℃，将Fmoc-Val-OSu的DME(1,2-二甲氧基乙烷)溶液逐滴加至Cit与NaHCO₃的混合溶液中，另加四氢呋喃助溶，室温搅拌24h，得反应液；

1.3)于步骤1.2)所得反应液中滴加饱和碳酸钾调节pH至8-9，然后以乙酸乙酯萃取，收集水层，加入柠檬酸溶液调节pH至3-4，析出白色凝胶状固体，过滤，将所得白色凝胶状固体溶于四氢呋喃与甲醇的混合溶液中，旋蒸浓缩后，加入甲基叔丁基醚，0℃搅拌过夜，过滤，真空干燥，得白色固体产物为酶敏感底物中间体Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸(Fmoc-Val-Cit)；

2)含二硫键的药物衍生物R-胱胺(R-SS-NH₂)的合成：

2.1)将带有羧基的药物化合物R溶于二氯甲烷溶液中，冷却至0℃后，加入EDCI(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)与HOBT(1-羟基苯并三氮唑)，所得混合物在0℃下活化1h后，依次加入胱胺二盐酸盐的甲醇溶液和三乙胺，常温搅拌48h，得反应液；

2.2)将步骤2.1)所得反应液以NaHCO₃溶液洗涤，收集有机层，以无水硫酸镁进行干燥，过滤，柱层析分离，真空干燥，得含二硫键的药物衍生物R-胱胺(R-SS-NH₂)；

3)双重敏感的药物衍生物Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸-R(Fmoc-VC-SS-R)的合成：

3.1)将步骤1)得到的Fmoc-Val-Cit溶于二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，冷却到0℃，加入EDCI和HOBT，所得混合物在0℃下活化1h后，加入步骤2)得到的R-SS-NH₂的二氯甲烷溶液和三乙胺，所得混合物搅拌过夜，反应结束后，减压浓缩，加入冰水，并在4℃保存过夜，过滤，水洗三次，真空干燥，以柱层析色谱进行纯化，得双重敏感的药物衍生物Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸-R(Fmoc-VC-SS-R)；

4)双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-VC-SS-R的合成：

4.1)将丁二酸酐与DMAP(4-(二甲氨基)吡啶)溶于吡啶溶液中，然后滴加至mPEG的氯仿溶液中，所得混合物在60℃氮气保护下搅拌反应24h后，用生理盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后，过滤取有机层，浓缩，以***洗涤后，真空干燥，得白色固体产物mPEG-COOH；

4.2)将mPEG-COOH溶于二氯甲烷中，加入EDCI、HOBT和型分子筛，在0℃黑暗中活化，得mPEG-COOH溶液；

4.3)取步骤3)所得Fmoc-VC-SS-R溶于THF中，加入DBU(1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)搅拌10分钟，所得混合液加入到mPEG-COOH溶液中，室温氮气保护反应2天；

4.4)反应结束后，以蒸馏水洗涤，然后以氯仿萃取，合并有机层，减压蒸发，加入***洗涤，然后过滤，所得固体真空干燥后加入超纯水，搅拌，过滤，透析2天，期间分别于2h、6h、12h、24h、36h更换释放介质共5次，冷冻干燥后，得目标产物双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-VC-SS-R。

优选的，上述的制备方法，所述带有羧基的药物化合物R为藤黄酸(GA)，所述mPEG的规格为mPEG5000，制得双重敏感型聚合物-藤黄酸连接物mPEG-VC-SS-GA。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的聚合物-药物共聚物提高了难溶性药物藤黄酸的水溶性，通过二硫键与缬氨酸-瓜氨酸链接，释放响应性能好，增强了共聚药物的靶向性，同时延长了抗癌药物在肿瘤部位的停留时间，临界胶束浓度测试说明本发明的聚合物-药物共聚物容易形成胶束，细胞实验表明其对肝癌有很好的抑制作用。本发明的聚合物-药物共聚物具有靶向智能释放药物的功能，粒径在140nm左右，有助于纳米粒子在肿瘤部位的积聚，而在GSH和酶响应性断裂后，药物释放，有助于药物的渗透。本发明通过采用聚乙二醇单甲醚聚合物靶向药物输送技术，肿瘤部位高浓度的谷胱甘肽和组织蛋白酶B作为靶点，设计研制的聚乙二醇单甲醚-缬氨酸-瓜氨酸-S-S-藤黄酸共聚物药物输送系统，增加藤黄酸靶向治疗作用、降低毒副作用、从而提高生物利用度。

本发明的聚合物-药物共聚物具有氧化还原响应和酶响应性能，水溶性好，毒副作用小，亲水段为聚乙二醇单甲醚，疏水段为藤黄酸。在水溶液中由于亲疏水作用自发形成两亲性聚合物胶束，在肿瘤部位可以响应性释放出药物。本发明的聚合物-药物共聚物作为抗癌药物载体的应用，可以有效提高难溶性药物的水溶性。

本发明设计的谷胱甘肽还原敏感及组织蛋白酶B敏感的双重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-VC-SS-GA(PVSG)，以谷胱甘肽还原单重敏感型聚合物-药物连接物mPE-SS-GA(PSG)作为对照，本发明的聚合物-药物连接物增加了药物在水中的溶解性，从细胞毒性方面评价了其药理作用。此外，相比胶束、脂质体等包合类载体，本发明的聚合物-药物连接物优点在于在体循环过程中药物不会发生泄漏的现象，并且由于药物即为疏水内层，当化学键断裂，药物可以更加快速的释放，研究证明，本发明的聚合物-药物连接物在肿瘤部位快速释药可以达到更好的治疗效果，具有很光明的前景和现实的意义。

附图说明

图1为双重敏感型聚合物-藤黄酸连接物mPEG-VC-SS-GA(PVSG)的合成。

图2为PVSG的MALDI-TOF-MS检测。

图3为mPEG-COOH(A)及PSG(B)的MALDI-TOF-MS检测。

图4为PVSG的DSC测定。

图5为藤黄酸自组装纳米粒粒径、电位的测定；

其中，A：PSG纳米粒粒径；B：PSG纳米粒电位；C：PVSG纳米粒粒径：D：PVSG纳米粒电位。

图6为PVSG自组装纳米粒的透射电子显微镜的测定；

其中，A：PVSG纳米粒；B：PSG纳米粒。

图7为藤黄酸体外释放图。

图8为藤黄酸纳米粒谷胱甘肽敏感释放图。

图9为藤黄酸纳米粒组织蛋白酶B敏感释放图。

图10为本发明双重敏感型聚合物-藤黄酸连接物(PVSG)对四种细胞增殖抑制作用。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

(一)谷胱甘肽还原敏感及组织蛋白酶B敏感的双重敏感型聚合物-藤黄酸连接物(mPEG-VC-SS-GA)(简称PVSG)

制备方法包括如下步骤：

1.Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸(Fmoc-Val-Cit)的合成

1.1)将Fmoc-Val(5g,14.73mmol)，HOSu(1.70g,14.73mmol)和DCC(3.04g,14.73mmol)在0℃下共溶于四氢呋喃(50mL)中，搅拌24h后过滤，减压旋蒸，得白色固体产物，即Fmoc-Val-OSu，无需纯化即可进行下一步反应。

1.2)将Cit(0.4g,2.3mmol)与NaHCO₃(0.19g,2.3mmol)共溶于50mL蒸馏水中，冷却至0℃，将Fmoc-Val-OSu(1g,2.29mmol)的25mL DME溶液逐渐滴加至Cit与NaHCO₃的混合溶液中，另加20mL四氢呋喃助溶，室温搅拌24h之后，得反应液。

1.3)于步骤1.2)所得反应液中，滴加饱和碳酸钾调节pH至8-9后，以20mL乙酸乙酯萃取三次，收集水层，加入柠檬酸溶液调节pH至3-4，可见白色凝胶状固体析出，过滤，将白色凝胶状固体溶于25mL四氢呋喃与10mL甲醇的混合溶液中，在250mL圆底烧瓶中旋蒸浓缩至10mL，加入200mL甲基叔丁基醚，0℃搅拌过夜，过滤，真空干燥，得白色固体产物Fmoc-Val-Cit(0.5g,产率44.3％)。

以1HNMR进行了结构鉴定。Fmoc-Val-OSU:1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.15(d,J＝8.4Hz,1H),7.90(d,J＝7.5Hz,2H),7.75(dd,J＝14.2,7.5Hz,2H),7.46–7.28(m,4H),4.41–4.19(m,4H),2.82(s,4H),2.21(dq,J＝13.5,6.7Hz,1H),1.03(d,J＝6.7Hz,6H).Fmoc-Val-Cit:1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.13(d,J＝7.3Hz,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.75(dd,J＝10.8,7.5Hz,2H),7.46–7.28(m,5H),5.94(t,J＝5.9Hz,1H),5.37(s,2H),4.35–4.09(m,4H),3.92(dd,J＝9.2,7.0Hz,1H),2.94(q,J＝6.6Hz,2H),1.98(h,J＝6.8Hz,1H),1.69(dq,J＝14.0,6.0,5.6Hz,1H),1.56(dtd,J＝13.9,9.2,5.5Hz,1H),1.45–1.33(m,2H),0.87(dd,J＝19.1,6.8Hz,6H).

2.藤黄酸-胱胺(GA-SS-NH₂)的合成

2.1)将藤黄酸(1.57g,2.5mmol)溶于二氯甲烷溶液(50mL)中，冷却至0℃后，加入EDCI(623mg,3.25mmol)与HOBT(439mg,3.25mmol)，混合物在0℃下活化一小时。将胱胺二盐酸盐(1.69g,7.5mmol)的甲醇(30mL)溶液加入至该混合溶液中，加入三乙胺(500μL,3.75mmol)，转移至常温搅拌48h，得反应液。

2.2)将步骤2.1)所得反应液以1mM NaHCO₃溶液(20mL)洗涤3次，收集有机层，以无水硫酸镁进行干燥，过滤，柱层析(石油醚/乙酸乙酯1：2)分离，真空干燥，得黄色固体产物GA-SS-NH₂(1.45g,76％)。

产物以ESI-MS、1HNPR和IR进行了表征。ESI m/z 763.3[M+H]+，1H NMR(600MHz,DMSO-d6)7.70-7.9(m,1H)，7.61(dd,J＝7.1,1.6Hz,1H),6.59–6.50(d,1H),5.94(t,J＝7.0Hz,1H),5.60(dt,J＝10.2,2.8Hz,1H),5.06(q,J＝7.8Hz,2H),3.50(t,J＝5.8Hz,1H),3.28(dd,J＝14.5,8.5Hz,1H),3.10(dd,J＝14.3,5.1Hz,1H),2.94–2.51(m,11H),2.51(q,J＝2.0Hz,1H),2.25(dd,J＝13.8,4.7Hz,1H),1.98(q,J＝8.0Hz,2H),1.75–1.47(m,20H),1.45–1.30(m,4H),1.19(s,3H).

3.Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸-藤黄酸(Fmoc-VC-SS-GA)的合成

将Fmoc-Val-Cit(0.5g,1mmol)溶于50mL二氯甲烷与10mL甲醇中，冷却到0℃，加入EDCI(0.25g,1.3mmol)和HOBT(0.18g,1.3mmol)，所得混合物在0℃下活化1h后，加入GA-SS-NH₂(1.69g,7.5mmol)的二氯甲烷溶液(30mL)和三乙胺(267μL,2mmol)，所得混合物搅拌过夜。反应结束后，减压浓缩溶液，加入100mL冰水，并在4℃保存过夜，过滤，水洗三次，真空干燥。以柱层析色谱(甲醇：二氯甲烷1：11)进行纯化，得Fmoc-VC-SS-GA，产率67.8％。

产物以ESI-MS and 1H NPR进行了结构表征。ESI:m/z 1241.5[M+H]+,1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.35(s,1H),7.89(s,2H),7.78(s,2H),7.43(s,6H),6.56(ddd,J＝9.8,6.3,3.2Hz,1H),5.94(t,J＝6.0Hz,1H),5.66(d,1H),5.38(s,2H),5.28–4.98(m,2H),4.23(s,5H),3.93(s,1H),3.61(s,3H),2.95-2.52(m,11H),2.17–0.93(m,35H),0.65-0.91(s,6H)

4.mPEG-VC-SS-GA(PVSG)的合成

从Fmoc-VC-SS-GA合成至mPEG-VC-SS-GA主要分为以下两步：(1)用丁二酸酐处理mPEG5000，将所有的羟基转化为酸性基团，(2)将mPEG5000-COOH与Fmoc-VC-SS-GA相连接，得mPEG-VC-SS-GA。

4.1)于容器中加入甲苯和mPEG5000，以甲苯回流2h除去mPEG5000(10g,2mmol)的水，冷却后，减压旋蒸除去甲苯，残留物溶于50mL氯仿中，得mPEG5000的氯仿溶液；将丁二酸酐(1g,10mmol)与DMAP(733mg,6mmol)溶于10mL吡啶溶液中，然后滴加至mPEG5000的氯仿溶液中，所得混合物在60℃氮气保护下搅拌反应24h后，用100mL生理盐水洗涤三次，用无水硫酸镁干燥后，过滤取有机层，浓缩，以50mL***洗涤三次后，真空干燥，得白色固体产物，即为mPEG5000-COOH(6.63g,65％)。

4.2)将mPEG5000-COOH(0.5g,0.1mmol)溶于20mL二氯甲烷中，加入EDCI(0.025g,0.13mmol)与HOBT(0.018g,0.13mmol)及1g型分子筛，在0℃黑暗中活化30min，得mPEG-COOH溶液。

4.3)取Fmoc-VC-SS-GA(0.5g,0.4mmol)溶于15mL THF中，加入DBU(0.8mmol,120ul)搅拌十分钟以脱去Fmoc基团。将脱去Fmoc基团的混合溶液加入到mPEG5000-COOH溶液中，室温氮气保护反应2天。

4.4)反应结束后，以50mL蒸馏水水洗三次，然后以氯仿萃取三次，合并有机层，减压蒸发，加入***洗涤，然后过滤，所得固体真空干燥后加入20mL超纯水，搅拌，过滤，透析2天(透析介质为1L 5％DMF的超纯水，透析袋MWCO＝5kDa)，期间分别于2h、6h、12h、24h、36h更换释放介质共5次。冷冻干燥后，收集黄色蓬松状固体，即为目标产物双重敏感型聚合物-藤黄酸连接物mPEG-VC-SS-GA(PVSG)，产率：45％。产物以MALDI-TOF-MS进行了结构表征，如图2。

(二)对比例：谷胱甘肽还原单重敏感型聚合物-药物连接物mPEG-SS-GA(PSG)

制备方法包括如下步骤：

1.藤黄酸-胱胺(GA-SS-NH₂)的合成

1.1)将藤黄酸(1.57g,2.5mmol)溶于二氯甲烷溶液(50mL)中，冷却至0℃后，加入EDCI(623mg,3.25mmol)与HOBT(439mg,3.25mmol)，混合物在0℃下活化一小时。将胱胺二盐酸盐(1.69g,7.5mmol)的甲醇(30mL)溶液加入至该混合溶液中，加入三乙胺(500μL,3.75mmol)，转移至常温搅拌48h，得反应液。

1.2)将步骤2.1)所得反应液以1mM NaHCO₃溶液(20mL)洗涤3次，收集有机层，以无水硫酸镁进行干燥，过滤，柱层析(石油醚/乙酸乙酯1：2)分离，真空干燥，得黄色固体产物GA-SS-NH₂。

2.mPEG-SS-GA(PSG)的合成

2.1)于容器中加入甲苯和mPEG5000，以甲苯回流2h除去mPEG5000(10g,2mmol)的水，冷却后，减压旋蒸除去甲苯，残留物溶于50mL氯仿中，得mPEG5000的氯仿溶液；将丁二酸酐(1g,10mmol)与DMAP(733mg,6mmol)溶于10mL吡啶溶液中，然后滴加至mPEG5000的氯仿溶液中，所得混合物在60℃氮气保护下搅拌反应24h后，用100mL生理盐水洗涤三次，用无水硫酸镁干燥后，过滤取有机层，浓缩，以50mL***洗涤三次后，真空干燥，得白色固体产物，即为mPEG5000-COOH(6.63g,65％)。

2.2)将mPEG5000-COOH(0.5g,0.1mmol)溶于20mL二氯甲烷中，加入EDCI(0.025g,0.13mmol)与HOBT(0.018g,0.13mmol)及1g型分子筛，在0℃黑暗中活化30min，得mPEG-COOH溶液。

2.3)取GA-SS-NH₂(0.153g,0.20mmol))和三乙胺(26μL,0.20mmol)，加入到mPEG5000-COOH溶液中，室温氮气保护反应2天。

2.4)反应结束后，以50mL蒸馏水水洗三次，然后以氯仿萃取三次，合并有机层，减压蒸发，加入***洗涤，然后过滤，所得固体真空干燥后加入20mL超纯水，搅拌，过滤，透析2天(透析介质为1L 5％DMF的超纯水，透析袋MWCO＝5kDa)，期间分别于2h、6h、12h、24h、36h更换释放介质共5次。冷冻干燥后，收集黄色蓬松状固体，即为目标产物mPEG-SS-GA(PSG)。产物以MALDI-TOF-MS鉴定，结果如图3。

图2为PVSG的MALDI-TOF-MS质谱图，图3为mPEG-COOH(A)及PSG(B)的MALDI-TOF-MS质谱图。每个质谱图中分子离子峰与所合成的分子相吻合，且主要的碎片离子峰能和相关结构对应，证明结构正确。

(三)PVSG的DSC测定

分别取1mg GA(A)、10mg mPEG-COOH(B)、10mgPSG(D)、10mgPVSG(E)以及10mgmPEG-COOH与1mgGA的物理混合物(C)，于DSC测定，升温速率为20℃/min，升温区间为25℃-260℃。

如图4所示，藤黄酸在80℃左右有吸收热，可以从曲线A及曲线C中看出，物理混合物中依然可以看到藤黄酸的吸收热峰，而PSG与PVSG的藤黄酸吸收热峰均消失，说明已不存在游离藤黄酸，PVSG的吸收热相比PSG有所偏移，可能是受仪器波动影响或VC片段的影响。

(四)PVSG水化体积的考察

精密称取5mg PVSG置于50mL离心管中，平行试样三份，分别加入2mL、5mL、10mL、20mL蒸馏水，上下振摇，可见其迅速溶解，60W超声一分钟，过0.45um滤膜，以动态光散射进行检测，以粒径与PDI为考察参数，结果如表1。

表1水化体积对纳米粒的影响

表1结果显示，水化体积从2mL增加到20mL时，5mL与10mL时PVSG-NPs的粒径与PDI均较小，参考文献及考虑后续实验用量需求，选择水化体积为10mL，即浓度为0.5mg/mL，粒径为142±4.71，PDI为0.259±0.048。

(五)PVSG超声时间考察

精密称取5mg PVSG置于50mL离心管中，平行试样三份，分别加入10mL蒸馏水，上下振摇，可见其迅速溶解，分别于60W下超声1min、3min、5min，过0.45um滤膜，以动态光散射进行检测，以粒径与PDI为考察参数，结果如表2

表2超声时间对藤黄酸纳米粒的影响

表2结果显示，超声功率从1min增加到5min时，在3min时PVSG-NPs的粒径与PDI最小，5min时粒径与PDI反而上升，考虑到超声时间过长容易导致聚合物断裂，而超声1min与3min无明显差异，考虑到节省时间，选择超声时间一分钟。

最终确定的处方工艺为：精密称取5mg PVSG置于50mL离心管中，加入10mL蒸馏水，上下振摇，于60W下超声1min，过0.45um滤膜，以同法处理PSG，取等效量GA，得到PVSG-NPs及PSG-NPs。

(六)PVSG自组装纳米粒的粒径、电位的测定

以最优处方制备得到PSG-NPs与PVSG-NPs，采用动态光散射(DLS)的方法测试了共轭物的粒径、电位与PDI(25℃，n＝3)结果如图5所示。经测定，PSG-NPs粒径为117±4.71nm，PDI为0.315±0.016，PVSG-NPs粒径为142±4.71nm，PDI为0.190±0.036，可以看出后者粒径要大于前者，但两者粒径均小于200nm，可以通过EPR效应进入肿瘤组织。两者的电位都在0左右，这是由于mPEG的隐身作用，表明mPEG成功包裹了GA。

(七)PVSG自组装纳米粒的透射电子显微镜的测定

对PSG-NPs(B)和PVSG-NPs(A)进行透射电子显微镜(Transmission electronmicroscope,TEM)观察，以移液枪吸取胶束溶液，滴加至200目铜网上，自然晾干，再滴加0.2％的磷钨酸染色，3-5min后吸去，自然晾干，观察两者形态。

由图6可见，TEM分析证实纳米颗粒为球状，大小均一，粒径略小于DLS检测，这是可能由于水分蒸发造成的，综上所述，表征结果证明了胶束成功制备。

(八)PVSG自组装纳米粒的体外释放实验

采用透析法进行体外释放，以累积释放量为指标，为模拟体内环境，采用含1％吐温80的培养基为释放介质，以L-精氨酸制备了藤黄酸制剂，对比考查PSG及PVSG在常温下能否稳定存在。具体实施方法如下：

1)取22mg L-精氨酸、10mg藤黄酸，溶于1％吐温80的培养基中，涡旋。即为对照制剂L-GA。

2)取同批次制备的L-GA、PSG和PVSG，同样以1％吐温80的培养基为介质，制备成藤黄酸等效含量为2mg/mL的溶液，分别加入到相同长度的透析袋中(MWCO：1kDa；预处理：以2％(W/V)的碳酸氢钠和1mmol/L EDTA中将透析袋煮沸10min，放冷至室温于4℃保存)，小心排除气泡，紧密封口，放入已经加入40mL溶出介质的茄型瓶中，于37℃恒温、100rpm恒温震荡箱孵育，于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h时间点取样3mL，取样后立即补充等温等体积的释放介质。样品经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，紫外条件进样分析，记录峰面积，带入标曲，计算不同时间点制剂泄露到介质中的药物含量，计算药物的释放量以及累积释放量，绘制释放曲线(即药物累积释放量-时间曲线)，试验结果如图7。

如图7所示，L-GA释放很快，在12h时已经释放了将近80％，而PSG-NPs与PVSG-NPs较L-GA释放较慢，可以看出，PVSG-NPs在72h的累积释放量要高于PSG-NPs，在正常条件下，PSG-NPs的释放量较高，但两组相比无显著性差异(P>0.05)。

(九)PVSG自组装纳米粒的谷胱甘肽敏感度释放实验

肿瘤微环境，选用pH5.0、GSH浓度为10mM的醋酸-醋酸钠缓冲溶液为释放介质，分别取PSG-NPs和PVSG-NPs两种胶束溶于醋酸-醋酸钠缓冲液中(等效GA 1mg/mL)，以透析法进行体外释放(40mL释放介质)，同时以不加GSH组作为对照，于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h时间点取样3mL，同时补充等温等体积的释放介质，结果如图8。

由图8所示，当加入谷胱甘肽后，PSG-NPs与PVSG-NPs释放量均上升，但相比之下，72h后PSG-NPs的释放量提升了15％左右，PVSG-NPs的释放量提升了25％左右，说明PVSG-NPs的氧化还原性能优于PSG-NPs，但两组数据不具备显著性差异(P>0.05)。

(十)PVSG自组装纳米粒的组织蛋白酶B敏感实验

以10mM GSH与CB的10mL醋酸-醋酸钠缓冲液为释放介质。取PSG、PVSG(eq GA500μg)分别溶于2mL醋酸-醋酸钠缓冲液中。CB(冻干固体，1.2mg)溶于1mL的25mM醋酸钠/1mMEDTA缓冲液中(pH5.0)，在4℃稳定8h后-80℃冷冻保存。试验前将CB置于100μL的30mM DTT/15mM EDTA缓冲液中(pH5.0)37℃孵育，取50μLCB缓冲溶液(50UI/mL)加入胶束溶液中，反应体系在37℃恒温震荡，每0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h时间点取样3mL，同时补充等温等体积的释放介质，结果如图9。

由图9结果显示，加入组织蛋白酶B之后，PSG-NPs相比未加入CB释放曲线非常相近，可见PVSG-NPs释放有所提升，其释放量相比PSG组有显著提升(P<0.05)，显示出PVSG-NPs有优良的性能。

(十一)PSVG的药效学试验

精密称取GA粉末、PSG-NPs、PVSG-NPs各1mg于EP管中，紫外灭菌，以含吐温80的空白培养基溶解药物(100μL/900μL)，以空白培养基稀释至100μM等效GA浓度，作为母液保存。当HepG2细胞生长至80％时，收集细胞，以培养基稀释，进行细胞计数，以1×104个/孔(100μL)转移至96孔细胞培养板，于37℃、5％CO2培养箱培养24h，将三种药物按比例稀释成8μM、4.0μM、2.0μM、1.0μM、0.5μM、0.25μM(eq.GA)这6个浓度梯度进行梯度稀释配置，每孔100μL，加入药物，最终96孔板中给药浓度为4.0μM、2.0μM、1.0μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM(eq.GA)，每个浓度设置三个平行组，96孔板外周一圈以无菌PBS作为空白对照组，另设溶剂对照组，于37℃、5％CO2培养箱分别培养24h、48h、72h后，避光加入MTT溶液(20μL，0.5％)，于37℃恒温箱中孵育4h后，取出96孔板，倒去板中液体，于超净台中风干，加入DMSO(150μL/孔)溶解,在摇床上振摇5min，充分溶解紫色结晶，570nm波长下以酶标仪检测OD值，保存数据结果，计算各组细胞抑制率，根据抑制率结果绘制柱状图。

同样的方法作BV2细胞、RAW264.7细胞和HEK293细胞，结果如表3和图10。

表3药物对四种细胞的IC50值

由表3和图10显示，通过MTT法，分别检测了三种药物对正常细胞的细胞毒性，以及对肿瘤细胞的毒性，发现在三种正常细胞系中，PSG-NPs及PVSG-NPs的毒性要远小于GA，尤其在高浓度时，而PVSG-NPs的敏感性及释放度要高于PSG-NPs，因此呈现出较高的正常细胞毒性，但相比GA原料药，其依然具备显著性差异，在三种细胞系中，PSG-NPs及PVSG-NPs两种胶束对BV2细胞具有最小的细胞毒性，并且在高浓度时，BV2细胞依然存活80％以上，而RAW264.7及HEK293的存活率要小于BV2，这可能是因为RAW264.7可以摄取药物，GA原料药在高浓度时将巨噬细胞杀伤至5％以下，两种胶束对巨噬细胞的存活率也造成了一定影响，但IC50明显高于GA原料药。在对HepG2细胞系的细胞毒性试验中，发现GA原料药的24h IC50是要高于正常细胞的IC50值的，可以看出两种胶束均具备浓度依赖性，但PSG-NPs对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，受到PEG的包裹作用无法释放完全，而PVSG-NPs在24h时对肿瘤细胞的杀伤小于GA，在48h及72小时时，高浓度的PVSG-NPs杀伤效果已经强于GA，三种药物均具备浓度依赖性与时间依赖性，但相比之下，PVSG-NPs释放速度较快，响应能力高于PSG-NPs。